マウスの心筋梗塞部位周辺の超音波ガイド下細胞送達は、安全で効果的で便利な細胞移植方法です。
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この記事について
サマリー
要約
心筋梗塞(MI)後の細胞治療の主な目的は、細胞移植率を効果的に高めることであり、ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、虚血性損傷後の心臓修復のための有望な細胞源です。しかしながら、低い移植率は、移植後の効果的な心臓組織再生にとって重大な障害である。このプロトコルは、MI領域への複数のhiPSC-CM超音波ガイド下経皮注射が細胞移植率を効果的に増加させることを示しています。この研究では、hiPSC-CM培養プロセス全体、前処理、および超音波ガイド下経皮送達方法についても説明します。さらに、ヒトミトコンドリアDNAの使用は、他のマウス臓器におけるhiPSC-CMの不在を検出するのに役立ちます。最後に、本論文では、細胞送達後4週間におけるマウスの梗塞境界帯における心機能、血管新生、細胞サイズ、およびアポトーシスの変化について説明します。心エコー検査による左室心筋の経皮的注射は、実行可能で、比較的侵襲的で、満足のいく、再現性のある、効果的な細胞療法であると結論付けることができます。
概要
急性MIが発生すると、梗塞領域の心筋細胞は虚血と低酸素症のために急速に死滅します。いくつかの炎症因子は細胞死と破裂の後に放出されますが、炎症細胞は梗塞部位に浸潤して炎症を引き起こします1。重要なことに、線維芽細胞およびコラーゲンは、いずれも収縮性および導電性を伴わず、梗塞部位の心筋細胞に取って代わり、瘢痕組織を形成する。成体哺乳動物における心筋細胞の再生能力が限られているため、大面積の梗塞後に形成される生組織は、通常、十分な心拍出量を維持するのに十分ではありません2。MIは心不全を引き起こし、心不全の重症例では、患者は正常な心機能を維持するために心臓移植または補助人工心臓のみに頼ることができます3,4。
MI後の理想的な治療戦略は、死んだ心筋細胞を新しく形成された心筋細胞に置き換え、健康な組織との電気機械的結合を形成することです。ただし、治療オプションは通常、置換ではなく心筋サルベージを採用しています。現在、幹細胞および前駆細胞ベースの治療法は、MI5後の心筋修復を促進するための最も有望な戦略の1つです。しかし、これらの細胞の移植にはいくつかの問題があり、主に成体幹細胞が心筋細胞に分化できないことと、それらの寿命が短い....
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プロトコル
この研究のすべての動物実験は、中南大学の第2襄雅病院の倫理委員会によってレビューおよび承認されました。このプロトコルで使用されるすべての材料と機器の詳細については、 材料の表 を参照してください。細胞注入、イメージング、安楽死のタイムラインは次のとおりです:t0-梗塞を誘発し、t1週間-画像およびインプラント細胞、t2週間-画像および移植細胞、t4週間-最終イメージング、安楽死および組織収集。
1. hiPS細胞培養、心筋細胞分化、細胞精製
- DMEM/F12と基底膜マトリックスストック溶液を4°Cの氷と1.5:1の比率で混合し、分注し、得られた混合物(マトリックス希釈液)を-20°Cで保存します。 DMEM/F12培地25 mLを4°Cで混合し、1 mLのマトリックス希釈液を氷と十分に混合し、1 mL/ウェルを6ウェルプレートに広げます。プレートを37°Cのインキュベーターで1時間直立させ、ウェルからDMEM/F12上清を吸引します。手順を実行するときは、6ウェルプレートの底に触れないでください。
- 液体窒素からhiPS細胞を含む凍結保存チューブを取り出し、37°Cの水浴中で素早く解凍します。凍結保存チューブの外面を75%アルコールで滅菌し、アルコールを拭き取り、チューブを滅菌済みの超清浄テーブルに移します。
- ピペットを使用して、hiPS細胞を含む凍結....
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結果
各群のマウスの左心室機能を評価するための心エコー検査により、MD群ではMI損傷が効果的に逆転していることが明らかになりました(図2A)。MI群と比較して、SD群は駆出率(EF)の増加を示しました(30%から35%; 図2B)およびフラクションショートニング(FS)(18%から22%; 図2C)MIの後。しかし、MD群マウスにおけるhiPSC-CMの複数回注射は経皮的にEFを増加させた(30%から42%; 図2B)およびFS(18%から28%; 図2C)MI後のマウス心臓の。
組織切片の非特異的αアクチン(αSA)、DAPI、ヒト特異的トロポニンT(hcTnT)、およびヒト核抗原(HNA)の蛍光標識は、MD群の移植細胞数がSD群のそれよりも有意に高いことを示しました(
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ディスカッション
この研究の重要なステップには、hiPS細胞培養、心筋細胞の分化、hiPSC-CM精製、およびマウス心筋梗塞部位へのhiPSC-CM移植が含まれます。心筋超音波を用いて、hiPSC-CMを注入した梗塞の端にある梗塞部位に経皮的に治療を誘導することがポイントとなります。
培養時間の延長に伴い、hiPSC-CM表現型は、時間とともに分化し、形態(より大きな細胞サイズ)、構造(筋肉、フィブリル密度、配置、顕微鏡的細胞クラスター)、および生理機能(カルシウム処理およびβ-アドレナリン作動性応答)が変化します。本研究では、心筋細胞へのhiPSC分化の10日目と60日目に蛍光標識を行い、形態学的および構造的変化を観察しました。hiPSC-CMでは、細胞サイズとサルコメア長は、10日目よりも60日目の方が有意に増加しました。この研究では、移植のために心筋細胞に分化してから60日後に比較的安定したhiPSC-CMを使用しました。また、hiPSC-CMの培養60日間に乳酸含有グルコースフリー培養液を複数回交換し、心.......
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開示事項
著者は開示するものは何もありません。
謝辞
この研究は、中国国家自然科学財団の主要研究計画(第91539111号からJY)、湖南省科学技術重点プロジェクト(第2020SK53420号からJY)、湖南省科学技術イノベーションプログラム(2021RC2106からCF)の支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 抗体 | |||
| 心臓トロポニン T | Abcam | ab8295 | |
| ロバ抗マウスIgG H&L (Alexa Fluor 488) | アブカム | ab150105 | |
| ロバ アンチマウス IgG H&L (Alexa Fluor 555) | アブカム | ab150110 | |
| ロバ アンチウサギ IgG H&L (Alexa Fluor 488) | アブカム | ab150073 | |
| ロバ アンチウサギ IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150062 | |
| Human cardiac troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Isolectin B4 | Vector | FL-1201 | |
| Sarcomeric alpha actinin | Abcam | ab9465 | |
| Wheat germ agglutinin | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| Reagent | |||
| Accutase | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | |
| B27 Supplement(minus insulin) | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement(serum free) | Thermo Fisher Scientific | 17–504-044 | |
| Bouinの解決 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | SDHT10132 | |
| CHIR99021 | Selleck | CT99021 | |
| cyclosporin A | Medchemexpress | HY-B0579 | |
| DIRECT RED | Sigma-Aldrich | 365548-25G | |
| DMEM/F12 | サーモフィッシャーサイエンティフィック サイエンティフィ | サイエンティフィック ディ11320033 | |
| DNeasy Blood&ティッシュキット | Qiagen | 69504 | |
| FAST GREEN FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| グルコースフリー RPMI 1640 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11879020 | |
| IWR1 | Selleck | S7086 | |
| 乳酸 | Sigma-Aldrich | L6661 | |
| マトリゲル | BD Biosciences | BD356234 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| O.C.T. コンパウンド | さくら | 4583 | |
| パラホルムアルデヒド | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerUP SYBR Green MasterMix kit | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A25742 | |
| RPMI1640 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11875119 | |
| STEMdif 心筋細胞凍結培地/STEMdiff | Stem Cell Technologies | 5030 | |
| STEMdiff 心筋細胞サポート培地 | 幹細胞技術 | 5027 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| 超音波カップリング剤 | CARENT | 22396269389 | |
| Y-27632 | Selleck | S6390 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Applied Biosystems | Thermo Fisher Scientific | 7500リアルタイムPCR | |
| クライオスタット | ライカ | CM1950 | |
| 蛍光顕微鏡 | オリンパス | IX83 | |
| 細かい解剖学的ハサミ | ファインサイエンスツール | 15000-08 | |
| 細かい解剖鉗子 | ファインサイエンスツール | 11255-20 | |
| マイクロシリンジ | ハミルトン | 7633 | |
| 小動物麻酔器 | MATRX | VMR | |
| 超高解像度小動物超音波画像診断システム | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| SoftwareStatistical | |||
| Product and Service ソリューション | IBM | 21 | |
| Image J | NIH | 1.48 | |
| Human mitochondrialDNAプライマー | |||
| フォワードプライマー配列 | CCGCTACCATAATCATCGCTAT | ||
| リバースプライマー配列 | TGCTAATACAATGCCAGTCAGG |
参考文献
- Leuschner, F., et al. Rapid monocyte kinetics in acute myocardial infarction are sustained by extramedullary monocytopoiesis. The Journal of Experimental Medicine. 209 (1), 123-137 (2012).
- Lázár, E., et al.
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