我々は、ヒトの歯から出発して上皮オルガノイド培養を開発するためのプロトコルを提示する。オルガノイドは堅牢に拡張可能であり、アメロブラスト分化能を含む歯の上皮幹細胞を再現する。このユニークなオルガノイドモデルは、歯の再生アプローチの視点を持つヒト歯科(幹細胞)生物学を研究するための有望なツールを提供します。
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この記事について
サマリー
要約
歯は、食物の咀嚼やスピーチだけでなく、心理的幸福のためにも人生において非常に重要です。人間の歯の発達と生物学に関する知識は乏しい。特に、歯の上皮幹細胞とその機能についてはあまり知られていません。ヒトの歯組織(抜いた親知らずから単離された歯包)を起点とした新規オルガノイドモデルの開発に成功しました。オルガノイドは堅牢かつ長期的に拡張可能であり、マーカー発現および機能活性の点で提案されたヒト歯上皮幹細胞区画を再現する。特に、オルガノイドは、アメロジェネシス中に インビボで 起こるようなアメロブラスト分化過程を展開させることができる。このユニークなオルガノイドモデルは、ヒトの歯の発達だけでなく、歯の病態を研究するための強力なツールを提供し、歯の再生治療への道を開く可能性があります。この新しいオルガノイドモデルに基づいて失われた歯を生物学的歯に置き換えることは、合成材料の現在の標準的な移植に代わる魅力的な代替手段となる可能性があります。
概要
歯は、食物咀嚼、スピーチ、心理的幸福(自己イメージ)に不可欠な役割を担っています。人間の歯は、さまざまな密度と硬度1の高度に石灰化された組織で構成されています。歯冠の主成分である歯科用エナメル質は、人体で最も高い石灰化組織です。エナメル質形成(アメロジェネシス)の間、歯が発達すると、歯科上皮幹細胞(DESC)はエナメル質形成細胞(アメロブラスト)に分化する。一度形成されると、エナメル質は、歯の噴火の開始時にアメロブラストのアポトーシス損失のためにめったに修復または更新されない1。損傷したエナメル質組織の修復は、外傷または細菌性疾患によって引き起こされるように、現在、合成材料を使用して達成されている。しかし、これらは、マイクロリーク、劣悪なオッセオインテグレーションとアンカー、有限寿命、および完全に機能する修復の欠如などの重要な欠点に悩まされています2。したがって、アメロブラストを生成する能力と石灰化組織を生成する可能性を備えたヒトDESCの堅牢で信頼性の高い培養は、歯科再生分野における大きな前進となるでしょう。
ヒトDESC表現型および生物学的機能に関する知識は乏しい3,4,5
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プロトコル
ここで説明するすべての方法は、倫理委員会研究UZ/KUルーヴェン(13/0104U)によって承認されています。抽出された第3大臼歯(親知らず)は、患者のインフォームドコンセントの後に得られた。
1. 準備
- 48穴培養プレートを37°Cの1.9%CO2インキュベーター内で15〜20 時間予温する。
- マトリゲルアリコートを液化する(成長因子還元;フェノールレッドフリー;さらに基底膜マトリックスと呼ばれる;BMM)を氷上(4°C)上で、ステップ2.1の前に最低2時間使用してください。
メモ: BMM の凍結/解凍サイクルは避けてください。BMMを氷上で15〜20時間液化し、微量遠心チューブに1mLでアリコートし、-20°Cで保存する。 - 遠心分離機を4°Cに冷却する。
- 培地を調製し、0.22μmのフィルターで溶液をろ過する。以下の体積は、典型的には同時に抽出される4つの第3大臼歯すべてからのDFの収集に基づいている。
- 20mLのDF収集培地(表1)を調製する:10%ウシ胎児血清(FBS)、0.5%アムホテリシンBおよび1%ペニシリン - ストレプトマイシンを含む最小必須培地ワシ(αMEM)。4 mL の DF 収集培地を 15 mL チューブに移し、チューブを氷上で移す。
注:サンプル採取....
- 20mLのDF収集培地(表1)を調製する:10%ウシ胎児血清(FBS)、0.5%アムホテリシンBおよび1%ペニシリン - ストレプトマイシンを含む最小必須培地ワシ(αMEM)。4 mL の DF 収集培地を 15 mL チューブに移し、チューブを氷上で移す。
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結果
歯のオルガノイド発生
我々は、親知らずの抜歯後に取得したヒトDF組織からオルガノイド培養を確立するための詳細なプロトコールを提供する(図1A)。単離されたDFは酵素的および機械的に解離する。得られた細胞は、最適なオルガノイドの発達および増殖について経験的に定義された培地(歯オルガノイド培地;トム)19。
オルガノイドは、典型的には、DF細胞播種後2週間以内に発達する(P0; 図2A)。オルガノイドは長期間拡張可能です(これまでに最大11通路)(図2B、P4で示す)。BMM液滴あたり約20,000個の細胞を(P0およびさらなる継代の両方で)播種すると、最適な密度のオルガノイドが得られますが(図2C)、細胞数を増やすと、増殖するスペースが不十分であるため、最適では.......
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ディスカッション
このプロトコルは、ヒトの歯から始まるオルガノイドの効率的かつ再現性のある生成を記述する。我々の知る限り、これはヒトの歯科組織から始まる現在の概念(上皮)オルガノイドを確立するための最初の方法論である。オルガノイドは長期拡張可能であり、歯の上皮ステムネス表現型を示し、DF7のERMコンパートメントで以前に報告されたDESCを複製する。さらに、オルガノイドは、アメロブラスト分化プロセスの展開を含む機能的なDESC/ERM特性を複製する7,25,26。独立した患者オルガノイド系統19で同等の結果が見出されたので、所見は頑健である。
この歯のオルガノイドプロトコルを実行する際には、いくつかの重要な点を考慮する必要があります。第1に、Rho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤Y−27632を初期播種時および各継代直後に.......
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開示事項
対応する著者は、すべての著者がすべての利益相反を開示したことを保証します。
謝辞
UZ Leuvenの口腔および顎顔面外科(MKA)のすべてのスタッフと患者、新しく抽出された第3大臼歯の収集における貴重な支援に感謝しています。また、ラインヒルデ・ジェイコブス博士とエリザベス・ティスケンス博士のサンプル収集に協力してくれたことにも感謝します。この研究は、ルーヴェン大学(BOF)とFWO-フランダース(G061819N)からの助成金によって支援されました。L.H.はFWO博士研究員(1S84718N)です。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量遠心チューブ | Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 mL 遠心チューブ | Corning | 430052 | |
| 2-メルカプトエタノール | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| 48 ウェル平底プレート | Corning | 3548 | |
| 50 mL 遠心チューブ | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | ||
| アガロース | ロンザ | 50004 | |
| ウシ アルブミン (細胞培養グレード) | Serva | 47330.03 | |
| AMELX 抗体 | Santa Cruz | sc-365284 | |
| アムホテリシン B | Gibco | 15200018 | |
| B27 (ビタミンAなし) | Gibco | 12587-010 | |
| カセット | VWR | ||
| ウシ肝臓由来の7202191カタラーゼ | Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44抗体 | Abcam | ab34485 | |
| セルストレーナー、40 & micro;m | Falcon | 352340 | |
| コレラ毒素 | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| クエン酸 | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 抗体 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | MA5-11599 | |
| コラゲナーゼIV | Gibco | 17104-019 | |
| カバーガラス | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| クライオバイアル | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| ジメチルスルホキシド (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12 Without Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| DMEM 粉末 高グルコース | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| ロバ血清 | Sigma-Aldrich | D9663 - 10ML | |
| 埋め込みワークステーション、220 〜 240 Vac | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 12587976 | |
| エタノール絶対、≥99.8% (EtOH) | Fisher Chemical | E/0650DF/15 | |
| Fetal wevine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF2 (= basic FGF) | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute 哺乳類全 RNA Miniprep キット | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | 溶解バッファーに溶解した 1% &β;-メルカプトエタノールを含む |
| ガラス パスツール ピペット | ニコ メカニズム | 170-40050 | |
| グリシン | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 PeproTech | 100-11 | ||
| InSolution Y-27632 (ROCK阻害剤, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| ウシ膵臓由来インスリン | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030024 | |
| マトリゲル(成長因子低減、フェノールレッドフリー) | Corning | 15505739 | |
| Microscope slide | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm | ミリポア | SLGV033R | |
| 最小必須ミディアムイーグル (αMEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| マウス IgG (Alexa 555) 二次抗体 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-アセチル L-システイン | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| ニコチンアミド | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| P63 抗体 | Abcam | ab124762 | |
| パップペン | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | マーキングペン |
| パラホルムアルデヒド (PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
| ペニシリン G ナトリウム塩 | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン (ペン/連鎖球菌) | Gibco | 15140-122 | |
| ペトリ皿 | コーニング | 353002 | |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| ペット(P20、P200、P1000) | エッペンドルフ他 | 2231300006 | |
| プラスチックトランスファーピペット(3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Rabbit IgG (Alexa 488) 二次抗体 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| Scalpel (surgical blade) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R&D Systems | 464-SH-200 | |
| シリコーン型 (加熱ブロック) | VWR | 720-1918 | |
| 塩化ナトリウム (NaCl) | BDH | 102415K | |
| 炭酸水素ナトリウム (NaHCO3) | メルク | 106329 | |
| ピルビン酸ナトリウム (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| SOX2抗体 | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Real-Time PCR System | |
| Stericup-GP, 0.22 & micro;m | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP 滅菌遠心分離管トップフィルターユニット, 0.22 μm | ミリポア | SCGP00525 | |
| 滅菌 1000 μフィルター付きLピペットチップ | Greiner | 740288 | |
| Sterile 20 μフィルター付きLピペットチップ | Greiner | 774288 | |
| Sterile 200 μフィルター付き/フィルターなしのLピペットチップ | Greiner | 739288 | |
| 滅菌 H2O | フレゼニウス | B230531 | |
| ストレプトマイシン硫酸塩 | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III first-strand synthesis supermix | Invitrogen | 11752-050 | 逆転写キット |
| ティッシュプロセッサー | Thermo Scientific | ||
| Transferrin | Serva | 36760.01 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Vectashield 封入剤+DAPI | Labconsult NV | H-1200 | DAPI |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| キシレン、99%、生化学および組織学用 | VWR | 2,89,75,325 |
参考文献
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
- Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health....
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