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方法論記事

ヒト肺オルガノイドの確立と近位分化による成熟気道オルガノイドの生成

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DOI：

10.3791/63684

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2022年3月23日

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1Department of Microbiology, Li Ka Shing Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 2Centre for Virology, Vaccinology and Therapeutics, Hong Kong Science and Technology Park, 3State Key Laboratory of Emerging Infectious Diseases, The University of Hong Kong

この記事について

サマリー

このプロトコルは、初代肺組織からヒト肺オルガノイドを誘導し、肺オルガノイドを拡張し、近位分化を誘導して、ヒト気道上皮を忠実に表現鏡検査する3Dおよび2D気道オルガノイドを生成する方法を提示する。

要約

ヒト呼吸器上皮の堅牢な インビトロ モデルの欠如は、呼吸器系の生物学および病理学の理解を妨げる。我々は、肺組織中の成体幹細胞からヒト肺オルガノイドを誘導し、近位分化を誘導して成熟気道オルガノイドを生成するための定義されたプロトコールを記述する。その後、肺オルガノイドは高い安定性で1年以上連続して拡張され、分化した気道オルガノイドは、ヒト気道上皮をほぼ生理学的レベルまで形態学的および機能的にシミュレートするために使用される。これにより、ヒト気道上皮の堅牢なオルガノイドモデルを確立した。肺オルガノイドと分化した気道オルガノイドの長期的な拡大は、安定した再生可能な供給源を生成し、科学者が培養皿中のヒト気道上皮細胞を再構築および拡張することを可能にする。ヒト肺オルガノイド系は、ウイルス-宿主相互作用の研究、薬物検査、および疾患モデリングを含む、様々な用途のためのユニークで生理学的に活性な in vitro モデルを提供する。

概要

オルガノイドは、臓器発生のインビトロモデリングと生物学と疾患の研究のための堅牢で普遍的なツールとなっています。成長因子で定義された培養培地で培養すると、様々な器官からの成体幹細胞(ASC)を3次元(3D)で増殖させ、オルガノイドと呼ばれる複数の細胞型からなる器官様細胞クラスターに自己組織化することができる。Cleversの研究室は、2009年に最初のASC由来オルガノイドであるヒト腸管オルガノイドの誘導体を報告した1,2。その後、ASC由来オルガノイドは、前立腺3、4、肝臓5、6、胃7、8、9、膵臓10、乳腺11、および肺12,13を含む様々なヒト器官および組織について確立されている。.これらのASC由来オルガノイドは、天然器官の重要な細胞的、構造的、および機能的特性を保持し、長期拡大培養において遺伝的および表現型の安定性を維持した14、15。

オルガノイドはまた、胚性幹(ES)細胞および人工多能性幹(iPS)細胞16を含む多能性幹細胞(PSC)に由来することもできる。PSC由来のオルガノイドは、その確立のために臓器発達のメカニズムを利用するが、ASCは、生理学的組織の自己複製または組織修復中に幹細胞ニッチを模倣する条件を再構築することによって、オルガノイドを形成するように強制され得る。PSC由来オルガノイドは、ASC由来オルガノイドの同等の成熟レベルに達することはできないものの、発生および器官形成を探索するのに好ましいモデルである。PSC由来オルガノイドの胎児様成熟状態、およびこれらのオルガノイドを確立するための複雑さは、成熟組織における生物学および病理学を研究するためのそれらの広範な適用を実質的に妨げる。

ヒト気道は、鼻から末端気管支まで、4つの主要な細胞タイプ、すなわち繊毛細胞、杯細胞、基底細胞、およびクラブ細胞からなる偽層状繊毛上皮とも呼ばれる気道上皮に並んでいる。我々は、Cleversの研究室12,13と共同で、ヒト肺組織からASC由来のヒト肺オルガノイドを樹立した。これらの肺オルガノイドは、1年以上にわたって拡張培地中で連続して拡張される。正確な持続時間は、異なるドナーから得られた異なるオルガノイド系統間で異なる。しかし、天然の気道上皮と比較して、これらの長期拡張可能な肺オルガノイドは、ヒト気道の主要な細胞集団である繊毛細胞がこれらの肺オルガノイドにおいて過小に表現されているため、十分に成熟していない。そこで、近位分化プロトコールを開発し、気道上皮を生理学的に近いレベルまで形態学的および機能的に表現写用する3Dおよび2D気道オルガノイドを生成しました。

ここでは、一次肺組織からヒト肺オルガノイドを導出し、肺オルガノイドを拡張し、近位分化を誘導して3Dおよび2D気道オルガノイドを生成するためのビデオプロトコルを提供する。

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プロトコル

本明細書に記載のヒト組織を用いた全ての実験は、香港大学/病院局香港西クラスター(UW13-364およびUW21-695)の治験審査委員会によって承認された。インフォームドコンセントは、組織採取前に患者から得られた。

1. ヒト肺オルガノイドの導出

  1. 実験材料の調製
    1. 高度DMEM/F12培地に2 mMグルタミン、10 mM HEPES、100 U/mLのペニシリン、100 μg/mLのストレプトマイシンを補給して基礎培地を調製する。
    2. 基礎培地に10%R-スポンジン1馴化培地、10%ノギン馴化培地、1x B27サプリメント、1.25 mM N-アセチルシステイン、10 mM ニコチンアミド、5 μMのY-27632、500 nMのA-83-01、1 μMのSB202190、5 ng/mLの線維素増殖因子(FGF)-7、20 ng/mLのFGF-10、および100 μg/mLのプリモシンを補充して、ヒト肺オルガノイド増殖培地を調製する( 材料表参照)。
      注:R-スポンジン1およびノギン馴化培地は、市販の組換えR-スポンジン1(500ng/mL)およびノギン(100ng/mL)と交換することができます。
    3. 24穴浮遊培養プレートを細胞培養インキュベーターに予温する。5%CO2 および37°Cで加湿雰囲気を有する標準的な細胞培養インキュベーターを使用する。 地下室のマトリックスを4°Cの冷蔵庫で解凍します。実験中は、地下のマトリックスと培養液を氷上に保管してください。
  2. 3Dオルガノイド培養のためのヒト肺組織からの細胞単離
    1. 0.5cm前後のサイズのヒト肺組織を切除したばかりの患者さんから、様々な疾患により切除手術を受ける患者さんから調達します。室温で肺組織を30mLの基礎培地で輸送し、バイオセーフティフード内でできるだけ早く処理します。
    2. 肺組織を小片(0.5〜1mm)に細かく刻み、滅菌メスを10cm細胞培養皿に入れる。組織片を15mL遠沈管内の10mLの冷たい基礎培地で洗浄し、続いて400 x g で4°Cで5分間遠心分離を行った。
    3. 上清を捨て、ペレットをコラゲナーゼを添加した8mLの基礎培地に最終濃度2mg/mLで再懸濁する。チューブを120rpmで37°Cで30〜40分間振盪することにより、組織片を消化する。
    4. ピペットを上下に20倍にして、10mL血清学的ピペットを使用して消化された組織片を剪断する。100 μm のストレーナーを 50 mL の遠沈管に積み重ね、懸濁液をろ過します。
    5. ストレーナー上の組織片を基礎培地で回収し、それらを15mL遠沈管に移し、続いて2回目の剪断および濾過を行った。追加の剪断濾過は、特に組織の小片(例えば、<0.5cm)が調達される場合に、より多くの細胞を単離するために1x〜2x行うことができる。
    6. FBSを最終濃度2%でフロースルーに添加して消化を終了させ、続いて400 x g で4°Cで5分間遠心分離した。
    7. 細胞ペレットを10mLの基礎培地に再懸濁し、続いて400 x g で4°Cで5分間遠心分離を行った。 上清を捨てる。
    8. (オプション)ペレット中に多くの赤血球が見られる場合(ペレットの色によって推定される)、細胞ペレットを2mLの赤血球溶解緩衝液に再懸濁し、室温で5分間インキュベートする。次いで、10mLの基礎培地をチューブに加え、400 x g で4°Cで5分間遠心分離を行った。 上清を捨てる。
    9. ペレットを冷たい地下マトリックスに再懸濁し、氷の上に保管する。約0.5cmの大きさの肺組織から回収された細胞のために80〜160μLの地下室マトリックスを加える。その量は、2〜4個の液滴を播種するのに十分である。
    10. 予め加温した24ウェル浮遊培養プレートの各ウェルに40μLの懸濁液を分注する。培養プレートを37°Cで10~15分間インキュベートする。地下室のマトリックスを固化させて液滴を形成します。
    11. 5 nM のヘレグリン β-1 を添加した 500 μL のヒト肺オルガノイド増殖培地を各ウェルに加え、プレートを細胞培養インキュベーター内でインキュベートします。
    12. 3 日ごとに培地をリフレッシュします。液滴をそのままに保ちながら古い培地を取り除き、慎重に新しい培地を加えてください。オルガノイドを10〜14日間インキュベートした後に通過させる。ヘレグリンβ-1は、最初の継代前の初期培養にのみ使用する。
    13. オルガノイドを顕微鏡で観察し、オルガノイドが非常に高い細胞密度で埋め込まれていないことを確認します。細胞密度が過度に高いために液滴が崩壊した場合は、オルガノイドと細胞を回収し、より高い体積の地下室マトリックスで再埋め込み、より低く望ましい細胞密度でより多くの液滴を作ります。

2. ヒト肺オルガノイドの増殖

  1. パスツールピペットの先端をブンゼンバーナーなどの炎に燃やしてパスツールピペットを準備し、開口部を直径1.5mmから直径約1.0mmに狭めます。ピペットを冷却し、オートクレーブ処理して滅菌します。ピペットを基礎培地で濡らして、機械的せん断中の細胞付着や損失を避けてください。
  2. 機械的剪断による肺オルガノイド通過
    1. 1 mLの先端とピペットを上下に使用して、上記で得られた液滴を分解します。次いで、オルガノイドを培地と共に15mL遠沈管に移し、冷たい基礎培地で体積を10mLに調整する。300 x g で4°Cで5分間遠心分離した後の上清を捨てる
    2. オルガノイドを10mLの冷たい基礎培地でもう一度洗う。オルガノイドを2mLの冷たい基礎培地に再懸濁する。パスツールピペットでオルガノイドを小片に剪断するために上下にピペットします。
    3. 基礎培地を全量10mLまで補充し、続いて300 x g で4°Cで5分間遠心分離を行った。 オルガノイド断片を、1:3~1:5の膨張を可能にするのに十分な冷たい地下室マトリックスで再懸濁する。氷の上にとどまる。
    4. 40 μLのオルガノイド懸濁液を、予め加温した24ウェルプレートの各ウェルに入れる。培養プレートを37°Cで10~15分間インキュベートする。地下室のマトリックスを固めます。
    5. 各ウェルに500 μLの肺オルガノイド増殖培地を加え、細胞培養インキュベーターでインキュベートする。3 日ごとに培地をリフレッシュします。オルガノイドを2週間ごとに1:3〜1:5の比率で通過させる。
  3. トリプシン処理による肺オルガノイド通過
    注:トリプシン処理は、パスツールピペットを使用して肺オルガノイドを小片に剪断することが困難な場合、またはオルガノイドのサイズが非常に可変である場合、またはその後の実験により、より均一なサイズのオルガノイドが必要な場合に好ましい。
    1. ステップ2.2.1に示すように肺オルガノイドを収穫する。オルガノイドを解離酵素1mLに再懸濁し、37°Cの水浴中で3〜5分間インキュベートする。
    2. 1mLの基礎培地をチューブに加える。パスツールピペットを使用してオルガノイドを上下に小片にピペッティングすることにより、オルガノイドを機械的に剪断する。オルガノイド片の大きさを顕微鏡で4倍の倍率で確認する。その後、40μLのFBSを加えて消化を終了させた。
      注:顕微鏡下でのオルガノイド断片のサイズは、実験的配置に従って決定する。実験でより多くのオルガノイドまたはより均一なサイズのオルガノイドが必要な場合は、オルガノイドをより小さな断片または単一の細胞にせん断します。その後、オルガノイドが実験の準備が整うまでに、より長い時間、おそらく3週間かかります。
    3. 最終容量が10mLになるまで基礎培地を補充し、続いて300 x g で4°Cで5分間遠心分離を行った。 オルガノイド片を冷たい地下室マトリックスに、1:5〜1:10の比率で通過するのに十分な体積で再懸濁する。氷の上にとどまる。
    4. 40 μLのオルガノイド懸濁液を、予め加温した24ウェルプレートの各ウェルに入れる。培養プレートを37°Cで10~15分間インキュベートする。地下室のマトリックスを固めます。
    5. 1ウェルあたり500 μLの肺オルガノイド増殖培地を補充し、細胞培養インキュベーターでインキュベートする。拡張メディアは 3 日ごとにリフレッシュします。2〜3週間後にオルガノイドを継代する。
      注:約100個のオルガノイドが地下室マトリックスの40μL液滴内にマウントされています。肺オルガノイドは、通常、比較的高い細胞密度でよりよく成長する。液滴が崩壊したり、細胞密度が高すぎるために成長しているオルガノイドが一緒に付着したりする場合は、より低い細胞密度でオルガノイドを再埋め込みます。

3. 成熟気道オルガノイドを生成するための近位分化

  1. 気液界面基礎培地に1x空気液界面補足剤、1x空気液界面維持補助剤、4μg/mLのヘパリン、1μMのヒドロコルチゾン、10μMのY-27632、10μMのDAPTを補充して近位分化培地(PD培地)を調製する( 資料表参照)。
  2. 3D気道オルガノイド
    1. 肺オルガノイドを増殖培地中で、機械的剪断 を介して 継代後7〜10日間インキュベートする。拡張メディアをPDメディアと交換してください。オルガノイドをPD培地中で細胞培養インキュベーター中で14日間インキュベートする。
    2. PD培地を各ウェルに廃棄する。細胞溶解液緩衝液を加え、RT-qPCRアッセイによるRNA抽出および細胞遺伝子発現の検出のために分化気道オルガノイドを回収する。
    3. あるいは、10mM EDTAを添加した後、オルガノイドを37°Cで60分間インキュベートしてオルガノイドを単一細胞に解離させ、続いてフローサイトメトリー分析を行い、細胞集団を調べた。オルガノイドは、様々な実験操作の準備ができています。
  3. 2D気道オルガノイド
    1. 2D分化培養に十分な3D肺オルガノイドを調製する。24ウェル透過性支持体インサートおよび12ウェル透過性支持体インサートには、それぞれ合計1.3 x 105および4.5 x 105細胞が必要である。
    2. 3D肺オルガノイドを膨張培地中で2週間増殖させた後、オルガノイドを単一細胞に消化し、24ウェルおよび12ウェルインサートにシードして2D気道オルガノイドを生成する。
    3. インサートを基礎培地と共に細胞培養インキュベーター中で一晩プレインキュベートする。24ウェルプレートの上部および下部チャンバーにそれぞれ250μLおよび500μLの基礎培地を加える。12 ウェルプレートの場合、上部チャンバーと下部チャンバーにそれぞれ 500 μL および 1,000 μL の基礎培地を追加します。
    4. ステップ2.2.1で説明したように3D肺オルガノイドを収穫する。オルガノイドを1mLの解離酵素で再懸濁し、37°Cの水浴中で3〜5分間インキュベートする。
    5. 1mLの基礎培地をチューブに加える。パスツールピペットでオルガノイドを単一細胞に剪断するために上下にピペットし、顕微鏡下で細胞をチェックします。その後、40μLのFBSを加えて消化を終了させた。
    6. 細胞を 40 μm のストレーナーでろ過し、50 mL の遠沈管に入れます。濾過した細胞懸濁液を15mLチューブに移す。全量が10mLになるまで基礎培地を補充し、続いて300 x g で4°Cで5分間遠心分離を行った。
    7. 24滴(40μL)から回収したペレットを、液滴中の細胞密度に応じて1〜2.5mLの肺オルガノイド膨張培地に再懸濁する。顕微鏡下で細胞カウンターで細胞数をカウントする。細胞濃度を 1.3 x 106/mL (24 ウェルインサートの場合) または 9 x 105/mL (12 ウェルインサートの場合) に調整します。
    8. 上部および下部チャンバーから基礎培地を取り外します。24ウェルインサートおよび12ウェルインサートの底部チャンバーにそれぞれ500μLおよび1,000μLの膨張培地を加える。ステップ3.3.7で調製した細胞懸濁液100 μLおよび500 μLの種子を、それぞれ24ウェルインサートおよび12ウェルインサートの頂端チャンバー上に配置した。
    9. 細胞培養インキュベーター内で2日間インキュベートする。プレートの頂端チャンバと底部チャンバの両方で拡張培地をPD培地と交換する。オルガノイドを細胞培養インキュベーター内で14日間インキュベートし、PD培地を3日ごとにリフレッシュする。
      注:移動性繊毛は、PD培地中でのインキュベーション後7日目から顕微鏡下での3Dおよび2Dオルガノイドにおいて識別可能である。PD培地中での分化培養の14日後、気道オルガノイドは様々な実験操作のために成熟する。
    10. 17に記載の標準プロトコールに従って電気抵抗測定システムを用いて、1日おきに経上皮電気抵抗(TEER)を測定する。

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結果

このプロトコルは、高い成功率を有するヒト肺オルガノイドの誘導を可能にする。新鮮なヒト肺組織は細かく細かくなり、次いでコラゲナーゼで分解される。得られた単一細胞を地下マトリックスに包埋し、上皮幹細胞の伸長のためのニッチ因子のカクテルを添加した肺オルガノイド膨張培地中でインキュベートする(ステップ1.1.2)。 図1 は、還元増殖因子基底膜マトリックスに埋め込まれた新たに単離された肺細胞の顕微鏡写真を示す2型(BME; 図1A、左)。嚢胞性オルガノイドが現れ、時間の経過とともに拡大する(図1A、右)。一方、無関係な細胞は徐々に細胞死を受ける。線維芽細胞は、第1または第2の継代の間に培養物中に存在する。その後、培養物は、初代肺組織に存在する上皮幹細胞に由来する肺オルガノイドである上皮オルガノイドを排他的に含む。これらの肺オルガノイドは、1:3〜1:5の比率で機械的剪断によって、または1:5〜1:10の比率でトリプシン処理によって2〜3週間ごとに継代される(ステップ2...

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ディスカッション

人間の気道は、偽層状繊毛上皮としても知られる気道上皮で並んでいます。上気道上皮の主な細胞型は、頂端繊毛の協調運動が気道から粘液および吸入粒子を排出することを可能にする繊毛細胞、粘液を産生および分泌する杯細胞、および基底膜に並び再生に関与する基底細胞である。細気管支のような小さな気道では、直方体気道上皮は分泌クラブ細胞を含み、上気道領域よりも繊毛細胞が少ない。我々は、ヒト肺組織中の上皮幹細胞からヒト肺オルガノイドを誘導するための堅牢なプロトコールを記述する。これらのヒト肺オルガノイドは、膨張培地中で維持され、高い安定性で1年以上連続して継代される。膨張培地中の主要な成長因子は、Wntアゴニスト20であるR−スポンジンを含む;BMPシグナル伝達21の阻害剤であるノギン、ならびにFGF7およびFGF10。以前の研究では、呼吸上皮の恒常性におけるWnt、FGF、およびBMPシグナル伝達の重要な役割が明らかにされている22、23、24。...

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開示事項

J. Z.、C.L.、およびM.C.C.は、気道オルガノイドの特許(公開番号:US-2021-0207081-A1)に発明者としてリストされている。他の著者は、競合する利益を宣言していません。

謝辞

我々は、共焦点イメージング及びフローサイトメトリーにおける支援に対し、香港大学李開清医学部パノラマ科学・電子顕微鏡ユニットに感謝する。この研究は、食品衛生局の保健医療研究基金(HMRF、17161272、19180392)からの資金提供によって部分的に支援されました。研究助成審議会の一般研究費(GRF、17105420)Health@InnoHK、イノベーション・テクノロジー委員会、香港特別行政区政府。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Reagents for lung organoid culture
Advanced DMEM/F12Invitrogen
12634010-A8301Tocris2939500nM
B27 supplementInvitrogen17504-0441x
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2)Trevigen3533-010-070-80%
FGF-10Peprotech100-2620 ng/mL
FGF-7Peprotech100-195 ng/mL
GlutaMAX (グルタミン)Invitrogen350500611x
HEPES 1MInvitrogen15630-05610 mM
ヘレグリン &β;-1Peprotech100-035
nM N-アセチルシステインSigma-AldrichA91651.25 mM
ニコチンアミドSigma-AldrichN063610 mM
Noggin (条件付き中)自家製-10x
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)Invitrogen15140-1221x
PrimocinInvivogenant-pm-1100 µg/mL
Rspondin1 (条件付き中)自家製-10x
SB202190Sigma-AldrichS70671 µM
Y-27632トクリス12545 & マイクロ;M
Proximal differentiation medium
DAPTTocris263410 µM
ヘパリン溶液StemCell Technology79804 µg/mL
ヒドロコルチゾンストック溶液StemCell Technology79251 & micro;M
PneumaCult-ALI 10X Supplementair liquid interface supplement
PneumaCult-ALI Basal MediumStemCell Technology05001air liquid interface basal medium
PneumaCult-ALI Maintenance Supplementair liquid interface maintenance supplement
Y-27632Tocris125410 & マイクロ;M
Equipment
Biological安全キャビネットBaker1-800-992-2537
Carl Zeiss LSM 780または800Zeiss共焦点顕微鏡
CO2インキュベーターサーモフィッシャーサイエンティフィック42093483
実体顕微鏡オリンパス株式会社CKX31SF
遠心分離機エッペンドルフ5418BG040397
血清ピペットッペンドルフ
マイクロピペットエッペンドルフ
ZENブラックまたはZENブルーソフトウェアツァイス分析ソフトウェア
消耗品
12mmトランスウェルステムセル技術#38023
12ウェル細胞培養プレートCellstar665970
15 ml および 50 ml コニカルチューブサーモフィッシャーサイエンティフィックL6BF5Z8118
24 ウェル細胞培養プレートCellstar662160
6.5mm Trans-wellStemCell Technology#38024
Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µmSigma-AldrichSLGPR33RB
マイクロチューブエッペンドルフ
マイクロピペットチップサーモフィッシャーサイエンティフィックTFLR140-200-Q21190531
パスツールピペットガラスサーモフィッシャーサイエンティフィック22-378893
セロロジカルピペット(5ml, 10ml, 25ml)サーモフィッシャーサイエンティフィックBA08003, 08004, 08005
抗体
ヤギ抗マウス Alexa Fluor 594InvitrogenA11005
ヤギ抗マウス、Alexa Fluor 488InvitrogenA11001
ヤギ抗ウサギ Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
ヤギ抗ウサギ Alexa Fluor 594InvitrogenA11037
ヤギ抗ラット Alexa Fluor 594InvitrogenA11007
マウス抗サイトケラチン 5Abcamab128190
マウス抗FOX J1Invitrogen14-9965-82
マウス抗ムチン 5ACAbcamab3649
マウス抗β-チューブリン 4SigmaT7941
ウサギ抗p63Abcamab124762
ラット抗子宮グロビン/CC-10R&DシステムMAB4218-SP
その他の試薬
TrypLE選択酵素(10X)サーモフィッシャーサイエンティフィックA1217701解離酵素
エズ

参考文献

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