Method Article

変異型メチオニンtRNA合成酵素マウス株を用いた複合体組織からの細胞型特異的タンパク質精製・同定

DOI:

10.3791/63713

⸱

April 13th, 2022

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1Max-Planck-Institute for Brain Research, Synaptic Plasticity Department, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Veterinary School, Complutense University of Madrid

In This Article

Summary

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このプロトコルでは、変異型L274G-メチオニンtRNA合成酵素(MetRS*)を発現するマウス株を使用して、アジドノールロイシン(ANL)による細胞種特異的タンパク質標識を実行する方法と、標識された細胞種特異的タンパク質の単離に必要な手順について説明します。生きたマウスにおける2つの可能なANL投与経路を、(1)飲料水と(2)腹腔内注射によって概説します。

Abstract

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in vivoでのタンパク質恒常性を理解することは、生理学的条件と疾患状態の両方で細胞がどのように機能するかを知るための鍵です。本プロトコルは、タンパク質標識を特定の細胞集団に向けるために改変されたマウス系統を使用して、新たに合成されたタンパク質のin vivo標識およびその後の精製を記載する。これは、L274G-メチオニンtRNA合成酵素(MetRS*)のCreリコンビナーゼ発現による誘導可能な系統であり、他の方法では起こらないタンパク質へのアジドノルロイシン(ANL)の取り込みを可能にします。ここで説明した方法を使用すると、in vivoで標識された細胞種特異的プロテオームを精製し、サンプルの複雑さの減少によるタンパク質含有量の微妙な変化を検出することができます。

Introduction

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異常なタンパク質恒常性は、タンパク質の合成と分解の不均衡によって引き起こされます。いくつかの疾患は、タンパク質恒常性の変化に関連しています。いくつかの疾患の特徴は、異なる細胞内位置および脳領域に凝集体が存在することです。タンパク質の恒常性は、疾患において重要であるだけでなく、正常な臓器および細胞機能においても重要な役割を果たします1。例えば、タンパク質合成は、タンパク質合成を阻害する化学阻害剤の使用によって決定されるように、多くの形態のニューロン可塑性2,3に必要である4。しかし、学習と記憶をサポートするためにプロテオームがどの細胞型で変化しているかは明らかではなく、各細胞型のどの特定のタンパク質がそれらの合成または分解において増加または減少するかも理解されていません。したがって、タンパク質の恒常性を包括的に研究するには、特定の細胞型に由来するプロテオームを区別する能力が必要です。実際、多細胞環境で起こる細胞プロセスを研究するための細胞種特異的プロテオームの同定は、プロテオミクスにおける重要なハードルでした。このため、MetRS*発現と生体直交法を組み合わせた技術を開発し、細胞型特異的プロテオームを同定および精製する効果的な方法であることが証明され、このギャップを埋めました5,6,7<....

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Protocol

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動物を用いたすべての実験は、ドイツ(RP Darmstadt、プロトコル:V54-19c20/15-F122/14、V54-19c20/15-F126/1012)またはスペイン(UCMの動物実験委員会およびマドリッド市環境カウンセリング、プロトコル番号:PROEX 005.0/21)の許可を得て実施され、マックスプランク協会の規則およびスペインの規制に準拠し、動物福祉に関するEUガイドラインに準拠しています。

1. ANLによる 生体内 代謝標識

  1. 飲料水：
    1. ANLとマルトースをマウスの通常の飲料水に溶かします。推奨されるマルトース濃度は0.7%(wt /体積)です。.飲料水に添加されるANLの最大量は1%(wt / vol)です。混合物の準備ができたら、ろ過して滅菌し、4°Cで保管します。
    2. ステップ1.1で調製した混合物をマウスに提供します。汚染を避けるためにボトルを頻繁に(たとえば、3日ごと)交換し、汚染や目詰まりの可能性がないか毎日チェックしてください。マウスのANL摂取量を知るために、毎日それを計量することによって飲んだ水の量を監視します。
      注:ここで評価された最大標識期間は、飲料水中の1%のANL濃度を使用して3週間であり、その結果、脳内で十分に検出可能な標識が得られました。良好なラベリングも2週間で達成できます。より短いラベリング時間、より長い時点、また....

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Results

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記載されたプロトコル(図1に要約)に従って、ANLを毎日の腹腔内注射(400 mM ANL 10 mL / kg、Nex-Cre::MetRS *)で7日間、または飲料水(0.7%マルトース、1%ANL、CamkII-Cre::MetRS *)を介して21日間マウスに投与しました。標識後、対応する脳領域を解剖し、溶解し、アルキル化し、クリックした。クリック反応は、SDS-PAGEおよびウエスタンイムノブロットによって分析した。実験の代表的な画像を、IP注入によるANL投与については図2に、飲料水を介したANL投与については図3に示す。図の目的は、両方のラベリングプロトコルが機能することを示すことであり、それらを比較することではないことに注意してください。示された2つの実験(海馬および皮質の興奮性ニューロン、および小脳のプルキンエニューロン)において異なるニューロン集団が標識されているため、比.......

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Discussion

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プロトコルの重要な側面は次のとおりです。陰性対照を含めること、十分な生物学的複製を有すること、ANL投与経路、量、および期間、サンプルのアルキル化、アルキン濃度、およびDST-アルキンを使用する場合のβ-メルカプトエタノールの除去。

Creドライバーなしで、したがってMetRS*発現のないANL標識動物から進行する陰性対照サンプルを含めることが重要です。これらのサンプルは、ANL標識されたCre誘導MetRS*マウスのサンプルと並行して、プロトコルに記載されているすべてのステップにかける必要があります。クリックされていないサンプルは、このコントロールのみを使用して達成された結果が非特定のクリックが原因である可能性があるため、有効なコントロールではありません。MetRS*遺伝子を発現していない細胞でのANLの取り込みや、Creのない細胞でのMetRS*発現は観察されていません。したがって、ANLで標識されたwt動物は、陰性対照として使用することができる。

本明細書に記載されるプロトコルは、サンプルが失われる可能性のある多くのステ.......

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Disclosures

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著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。

Acknowledgements

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B.A-Cは、スペイン科学イノベーション省(Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I)、マドリード自治州(Atracción de Talento-2019T1 / BMD-14057)、およびMICINN(PID2020-113270RA-I00)の助成金によって資金提供されています。R. A-Pは、マドリード自治州(Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057)から資金提供を受けています。E.M.S.は、欧州研究会議の上級研究者賞であるマックスプランク協会(助成金743216)、DFG CRC 1080:神経恒常性の分子および細胞メカニズム、およびDFG CRC 902:RNAベースの制御の分子原理によって資金提供されています。我々は、D.C DieterichとP. Landgrafの技術的助言とDST-Alkyneの合成に感謝する。E. Northrup、S. Zeissler、S. Gil Mast、およびMPI for Brain Researchの動物施設の優れたサポートに感謝します。Nex-Creマウスラインを共有してくれたサンドラゲッベルスに感謝します。アントニオ・G・カロッジョ氏の英文校正にご協力いただき、ありがとうございました。学士実験を設計、実施、分析しました。B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E., および S. T.D.実験を実施し、分析した。B.A-CとE.M.S.は実験を設計し、プロジェクトを監督し、B.A-Cは論文を書いた。すべての著....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12% アクリルアミドゲルGenScriptSurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%
-メルカプトエタノールSigmaM6250毒性; 白衣、手袋、ヒュームフードを使用してください。
重炭酸アンモニウムΣ9830毒性; 白衣、手袋、および
前述の AHA 用に合成された ANL
ANL-HClIrishBotechHAA1625.0500
BenzonaseSigmaE1014
ビオチン アルキンサーモ,B10185
チキン抗体抗GFPAves1020
完全EDTAフリープロテアーゼ阻害剤Roche4693132001Toxic;白衣と手袋を使用してください。
銅(I)臭化物シグマ25418599.999%(wt/wt)
ジスルフィドタグ(DST)-アルキン番号15で報告されているように合成され、プローブ20
DMSOシグマ276855
フィルターメルクSCGP00525
ヨードアセトアミド(IAA)シグマI1149
IRアンチチキン800LI-CORIRDye 800CWロバ抗チキン二次抗体
IR 抗ラビット 680LI-CORIRDye 680RDヤギ抗ウサギ IgG 二次抗体
マルトースシグマM9171
手動ミキサーBioSpec 製品1083
NaClシグマS9888
N-エチルマレイミドシグマ4259毒性;白衣、手袋、ドラフトを使用してください。
NeutrAvidin ビーズPierce29200
ニトロセルロースメンブレンBio-rad1620112
PBS 1XThermoJ62036.K2
PBS 1X pH 7.8参照番号に記載されている調製 5
PD SpinTrap G-25 カラムGE Healthcareバッファー交換
Pierce BCA Protein Assay KitThermo、23225試薬は、水生生物に有毒です。
ポリクローナルウサギ抗ビオチン抗体細胞シグナル伝達5597
PVDF 膜ミリポアIPVH00010
SDS 10%Sigma71736
SDS-PAGE ランニングバッファーMOPS GenScriptM00138
SYPRO ルビー染色SigmaS4942
テーブル 自動 ボルテクサーエッペンドルフミックスメイト
トリアゾール配位子Sigma678937
Triton X-100SigmaT9284
ウォーターSigmaW4502分子生物学グレード
(参考文献 5 および 11 を参照)参照Pierce BCAタンパク質アッセイキットの

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. The regulation of synaptic protein turnover. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).
  2. Sutton, M. A., Schuman, E. M. Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory. Cell. 127 (1), 49-58 (2006).

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