MALDI−TOFを用いて、酸化されたRNAとエキソリボヌクレアーゼXrn−1との間の反応性から得られた断片を特徴付けた。本プロトコルは、RNAおよび/またはDNAを含む他のプロセスに適用できる方法論を記載する。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
RNAは生命のすべてのドメインに存在する生体高分子であり、他の分子および/または反応種、例えばDNA、タンパク質、イオン、薬物、およびフリーラジカルとの相互作用は遍在している。その結果、RNAは、その切断、分解、または修飾を含む様々な反応を受け、別個の機能および含意を有する生物学的に関連する種をもたらす。1つの例は、グアニンの7,8−ジヒドロ−8−オキソグアニン(8−oxoG)への酸化であり、これは活性酸素種(ROS)の存在下で起こり得る。全体として、このような製品と変換を特徴付ける手順は、科学界にとって主に価値があります。この目的のために、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間(MALDI−TOF)質量分析法は広く使用されている方法である。本プロトコールは、酵素処理後に形成されたRNA断片を特徴付ける方法を記載する。選択されたモデルは、RNAとエキソリボヌクレアーゼXrn-1との間の反応を使用し、酵素消化は酸化部位で停止する。2つの20ヌクレオチド長のRNA配列[5'-CAUガアACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU]および[5'-CAUガアACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU]を固相合成によって得、UV-vis分光法によって定量し、MALDI-TOFを介して特徴付けた。次いで、得られた鎖を(1)5'-リン酸化し、MALDI−TOFを介して特徴付け;(2)Xrn-1で処理する工程;(3)濾過および脱塩;(4)マルディ-TOFを介して分析する。この実験セットアップは、Xrn-1の失速に関連する断片の明確な同定につながった:[5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU]、[5'-H2 PO 4-(8-oxoG)(8-oxoG) cua aaa gu]、および[5'-H2PO4-(8-oxoG) cua aaa gu]。記載された実験を、200個のピコモールのRNA(MALDI分析に20pmol使用した)を用いて実施した。しかし、量が少ないと、この作業で使用されたものよりも強力なレーザー光源を使用する分光器で検出可能なピークが生じる可能性があります。重要なことに、記載された方法論は一般化され、RNAおよびDNAを含む他のプロセスの産物同定に拡張することができ、他の生化学的経路の特性評価/解明に役立つ可能性がある。
概要
MALDI-TOF 1,2,3は、さまざまなサイズおよび特性の分子の特性評価および/または検出に広く使用されている技術です。その用途には、天然資源4からのタンニンの検出、食品中の代謝産物のイメージング5、細胞薬物標的またはマーカーの発見またはモニタリング6、臨床診断7など、さまざまな用途が含まれます。本研究に関連するのは、DNAまたはRNAを用いたMALDI-TOFの使用であり、オリゴヌクレオチドに対するその使用は30年以上前にさかのぼる8、そこでいくつかの制限が指摘された。この技術は、現在、生体高分子9の両方を特徴付け、化学的および生化学的反応を同定/理解するために、信頼性が高く一般的に使用される手段、例えば、RNA10中の白金化部位の特性評価、鎖切断後のRNA断片の同定11、12、またはタンパク質....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
RNase非含有の超純水(表1)を本研究に用いた。
1. RNA溶液の濃度決定
- 以下の手順に従ってRNAサンプルを調製する。
- 微量遠心管(0.6 mL)を使用して、1 μLのストック溶液(固相合成 により 得られた)19を159 μLのRNaseフリーH2Oに希釈してRNA溶液を調製する。
注:幅広いキュベットが市販されているため、必要な容量が異なる場合があります。この作業では、1cmの経路長および減少した体積(150μL)のキュベットを使用した。 - UV-visキュベットをメタノール(2x)ですすぎ、続いて水(超高純度H2O、3x、 材料表を参照)をすすいでください。窒素ガスの流れを使用してキュベットを完全に乾燥させます。
- ピペットを使用して溶液をキュベットに移し(ステップ1.1.1)、気泡がないことを確認します。キュベットをキャップし、必要になるまで横に置きます。
- 微量遠心管(0.6 mL)を使用して、1 μLのストック溶液(固相合成 により 得られた)19を159 μLのRNaseフリーH2Oに希釈してRNA溶液を調製する。
- 調製したRNA溶液の濃度をUV-vis分光光度計を用いて決定する。
- UV-Vis分光光度計の電源を入れるには、機器の背面にあるスイッチを切り替えます。計測器が起....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
この作業で使用したオリゴヌクレオチドは、使用前に合成、特性評価、および定量を行った。すべてのオリゴヌクレオチドの濃度は、二次構造の潜在的な形成から生じる誤った読み取り値を避けるために、90°Cで記録されたUV-vis分光法 を介して 決定された。 図3 は、この作業で用いたRNAのモデルオリゴヌクレオチドを、室温で、かつ熱を加えた後に採取したスペクトルを示す。
全体的な手順は、Xrn−1失速を引き起こす酸化的病変の構造と共に、 図4に示されている。オリゴヌクレオチド(1)は、位置−11に1つの8−oxoGを含み、Xrn−1活性が遮断され、RNA鎖の加水分解が停止する場所である。重要なことに、この図に描かれた結果は、200pmolの親鎖を含む溶液(1)を用いて実施された実験に対応するが、プレート上には20pmolのみが斑点を付けられた。すべての計算で平均質量が使用され、1〜3原子質量単位(amu)間で異なる不一致が観察されたことに注意することが重要.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
このワークフローの主な課題は、実験の完了と質量分析の実行の間に生じました。実験はコロラド大学デンバー校で実施され、完了し、コロラド州立大学の施設に(一晩)出荷された。データ取得は、便宜上、受領時に実施した。いくつかの予期せぬ状況により、プロセスの時間遅れが発生しました。ある例では、予期せぬ機器の誤動作により、発見と取得の前にサンプルを凍結(21日間1回)する必要がありました。しかし、この時間の遅れは実験結果に影響を与えていないようであったが、RNAの分解(シグナル強度の低下につながる)を排除することはできない。
記載された実験の限界は、RNA濃度に関して、単一のRNA配列23、24について、インビボで得ることができるものよりも高い[RNA]を用いて実験を行ったことであった。我々は、20pmolのRNA(プレート上に2pmolのスポット)またはそれより低い量で実験を行った場合、期待されるピークは観察されないことを見出した。レーザー出力が向上した分光器.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者らは開示するものは何もありません。
謝辞
この研究は、3つの機関、2つの研究グループ、1つのコア施設間の共同作業であったことに注意することが重要です。分布および作業負荷を以下のように実施した:タンパク質(Xrn−1)発現は、デンバー大学(コロラド州デンバー)で行った。オリゴヌクレオチドの合成、定量、および実験(主に酵素分解)をコロラド大学デンバー校(コロラド州デンバー)で行った。最適化もそこで行われました。MALDI-TOFの発見、取得、分析は、コロラド州立大学の分析資源コアファシリティで実施されました。(コロラド州フォートコリンズ)。SSはUROP賞(CUデンバー)とユーレカ助成金(CUデンバー)の支援を認めたいと思います。E. G.C. は、R00GM115757 を介して NIGMS からのサポートを認めています。MJER は、1R15GM132816 を介して NIGMS からのサポートを認識しています。K.B. はリソース ID: SCR_021758 を確認します。この研究は、ヘンリー・ドレフュス財団の教師学者賞(MJER)、TH-21-028によっても支援されました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.6 mL MCT 目盛り付きバイオレット | フィッシャーサイエンティフィック | 05-408-127 | |
| 6'-トリヒドロキシアセトフェノン一水和物 98% | シグマ アルドリッチ | 480-66-0 | |
| アセトニトリル 99.9%、HPLC グレード | フィッシャーサイエンティフィック | 75-05-8 | |
| アデノシン三リン酸、10 mM | ニューエングラングバイオサイエンス | P0756S | |
| クエン酸アンモニウム、二塩基性 98% | シグマAldrich | 3012-65-5 | |
| ッ化アンモニウム98.0%、ACSグレード | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Bruker細菌試験基準 | Bruker Daltonics 8255343 | ||
| Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
| ジエチルピロカーボネート、97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| フレックス分析の商用ソースソフトウェア | Bruker daltonics | FlexAnalysis ソフトウェアバージョン 3.4、Bruker Daltonics | |
| Lambda 365 UV-vis 分光光度計 | Perkin Elmer | ||
| MALDI プレート: MSP 96 グランドスチールターゲット | Bruker Daltonics | 280799 | |
| 質量分析計 | Bruker | Microflex LRFTOF 質量分析計 (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
| Mili-Q IQ 7000 | Milipore Sigma | A Mili-Qシステムは、この作業で使用したすべての水を精製するために使用されました | |
| OmegaTM膜付きNanosep遠心装置 10 K、青色(24 /pkg) | ポールコーポレーション | OD010C33 | フィルターメディア、オメガ(変性ポリエーテルスルホン)10 Kポアサイズ |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | これはソリューションB |
| オリゴアナライザーツール | IDT-DNA | ですhttps://www.idtdna.com/calc/analyzer | |
| ピペットチップ P10 | フィッシャーサイエンティフィック | 02-707-441 | |
| ピペットチップ P200 | フィッシャーサイエンティフィック | 02-707-419 | |
| RNase アウェイ | モレキュラーバイオプロダクツ | 7005-11 | |
| T4 ポリヌクレオチドキナーゼ | ニューイングランドバイオラボ | M0201S | |
| T4 ポリヌクレオチドキナーゼ反応バッファー | 新製品England BioLabs | B0201S | This is solution A |
| Triflouroacetic Acid | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| Xrn-1 exoribonuclease | Expressed in house | ref. 20 | |
| ZipTip Pipette Tips for Sample preparation | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 & micro;LピペットチップにはC18標準0.6µが装填されています。Lベッド |
参考文献
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
- Karas, M., Hillenkamp, F.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
