この記事では、エレクトロスプレー-イオン移動度-質量分析、半経験的量子計算、およびエネルギー分解閾値衝突誘起解離を使用して、関連する三元金属錯体の解離の相対熱化学を測定する実験プロトコルについて説明します。
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この記事について
サマリー
要約
この記事では、エレクトロスプレーイオン移動度質量分析(ES-IM-MS)とエネルギー分解閾値衝突誘起解離(TCID)を使用して、負電荷[amb+M(II)+NTA]-三元錯体の2つの製品チャネルへの解離の熱化学を測定する実験プロトコルについて説明します。 + amb、ここでM=ZnまたはNiおよびNTAはニトリロ三酢酸である。この複合体は、一次構造アセチル-His 1-Cys 2-Gly 3-Pro 4-Tyr 5-His 6-Cys 7またはアセチル-Asp 1-Cys 2-Gly3-Pro 4-Tyr 5-His 6-Cys 7を有する代替金属結合(amb)ヘプタペプチドの1つを含み、ここでアミノ酸はAa1,2,6,7 位置は潜在的な金属結合部位である。三元複合体とその生成物の幾何学的に最適化された定常状態は、電子エネルギーとその衝突断面積(CCS)をES-IM-MSによって測定されたものと比較することによって、量子化学計算(現在はPM6半経験的ハミルトニアン)から選択された。PM6周波数計算から、三元複合体とその生成物の分子パラメータは、競合TCID法を用いて2つの生成物チャネルのエネルギー依存強度をモデル化し、解離の0Kエンタルピー(ΔH0)に関連する反応の閾値エネルギーを決定する。PM6の回転周波数と振動周波数を用いた統計力学の熱およびエントロピー補正は、解離の298Kエンタルピー(ΔH298)を提供する。これらの方法は、一連の三元金属イオン錯体の熱化学および平衡定数を決定することができるEI-IM-MSルーチンを記述する。
概要
この研究は、代替金属結合(amb)三元金属錯体[amb + M(II)+NTA](M = ZnまたはNiおよびNTA = ニトリロ三酢酸)の解離のための相対熱化学の決定を可能にする市販のイオン移動度質量分析計を用いた新しい技術を説明する(図1)。これらの反応は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)1,2中のNTA固定化金属に結合したambタグ付き組換えタンパク質の解離をモデル化する。一例として、この方法は、amb AおよびHのambヘプタペプチドタグ(図2)を用いて記載される(先行研究3、4、5、6、7、8、9、10、....
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プロトコル
メモ: 図 1 に、プロトコルの概要を示します。
1. 試薬の調製
- フリーズドライアンブペプチド(純度>98%)を購入し、-80°Cの冷凍庫に保管してください。
- 純度>99%の硝酸亜鉛(II)六水和物と硝酸ニッケル(II)六水和物を購入してください。
警告: 硝酸ニッケル(II)六水和物は、環境および健康上の危険があります。 - ニトリロ三酢酸、ポリDL-アラニンポリマー、超高純度/微量金属グレードの酢酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、氷酢酸、HPLCグレードのアセトニトリルを購入してください。
2. 原液の調製
- ペプチドamb原液
- 3つ以上の有効数字を使用して凍結乾燥ペプチドの10〜20mgを秤量し、1.7mLポリプロピレン微量遠心チューブに入れることによって、12.5mM amb濃度の水溶液を調製する。
- 適切な量の脱イオン水(>17.8MΩ cm)を微量遠心チューブに加えます。蓋を閉め、少なくとも20回の反転でよく混ぜる。
- 12.5 mM amb 溶液から 50 μL アリコートを作成し、マークの付いた 1.7 mL 微量遠心チューブに入れ....
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結果
AとHの[amb+M(II)+NTA]-三元錯体の[amb+M(II)]-+NTAまたは[NTA+M(II)]-+ambへの競合衝突誘発解離を図3に示す。amb は A または H のいずれかで示され、M = Zn または Ni として表示されます。[A+Zn(II)+NTA]-三元複合体(図3A)は、[A+Zn(II)]を生成するために約0.7eVの衝突エネルギー(CE)と[NTA+Zn(II)]を生成するために約0.9eVの見かけ上の閾値を示す。[A+Ni(II)+NTA]-錯体(図3B)の解離は、[NTA+Ni(II)]-および[A+Ni(II)]-生成物の両方について.......
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ディスカッション
重要なステップ
ES-IM-MS しきい値衝突誘発解離 (TCID) 解析。 TCIDは、衝突セルとしてアルゴンの存在下での転送T波セルを使用した。解離に先立ち、前駆体イオンは、イオン移動度(IM)セルを通過する際に窒素ガスとの低エネルギー衝突によって熱化される。これは、トラップをコリジョンセル6、40として使用することによって達成されるよりも再現性のあるエネルギー分解TCIDをもたらす。解離前の[amb+M(II)+NTA]- の熱化はまた、三元錯体の利用可能な内部エネルギーを298Kの温度を用いて特徴付けることを可能にする。転写セル内での解離とは、三元複合体およびその生成イオンが検出器への同じ平均到着時間を有することも意味し、これは、転写セル内でのみ起こった三元複合体の解離を特定するのに有用であった。解離が起こり得る他の領域は、ES源(これを避けるためにサンプリングコーンは25Vに保たれる)またはIMセルの入り口である。こ.......
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開示事項
著者らには開示すべき利益相反はありません。
謝辞
この資料は、1764436、NSF REUプログラム(CHE-1659852)、NSF機器サポート(MRI-0821247)、成功のための物理学と天文学奨学金(PASS)NSFプロジェクト(1643567)、ウェルチ財団(T-0014)、エネルギー省(TX-W-20090427-0004-50)およびL3コミュニケーションズのコンピューティングリソースによってサポートされている作業に基づいています。著者らは、ケント・M・アービン(ネバダ大学リノ校)とピーター・B・アーメントラウト(ユタ大学)がCRUNCHプログラムを共有し、PBAからのフィッティングに関するアドバイスをくれたことに感謝します。著者らは、シグマプログラムを共有してくれたカリフォルニア大学サンタバーバラ校のMichael T. Bowerのグループに感謝します。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アセトニトリルHPLCグレード | フィッシャーサイエンティフィック社製 (www.Fishersci.com) | A998SK-4 | |
| 代替金属結合型(amb)ペプチド | PepmicCo社製(www.pepmic.com) | 設計ペプチドは、 | |
| 酢酸アンモニウム(超高純度) | VWR | 97061-014 | |
| 水酸化アンモニウム(微量金属グレード) | フィッシャーサイエンティフィック社製 (www.Fishersci.com) | A512-P500 | |
| Driftscope 2.1 ソフトウェアプログラム | Waters (www.waters.com) | ソフトウェア解析プログラム | |
| Gaussian 09 | Gaussian | Electronic Structure Modeling Software | |
| GaussView | Gaussian | Graphical Interface to Visualize Computations | |
| 氷酢酸 (Optima grade) | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A465-250 | |
| イオンスケール Lennard-Jones (LJ) 法 | カリフォルニア | 大学サンタバーバラ校の Sigma | |
| MassLynx 4.1 | Waters (www.waters.com) | ソフトウェア分析プログラム | |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL, ポリプロピレン |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 87003-298 | 2.0 mL,ポリプロピレン |
| 硝酸Ni(II)六水和物(純度99%) | Sigma-Aldrich(www.sigmaaldrich.com) | A15540 | |
| DL-アラニン | Sigma-Aldrich(www.sigmaaldrich.com) | P9003-25MG | |
| ウォーターズSynapt G1 HDMS | ウォーターズ(www.waters.com) | 四重極 - イオン移動度 - 飛行時間型質量分析計 | |
| Zn(II) 硝酸六水和物 (99%+ 純度) | Alfa Aesar (www.alfa.com) | 12313 |
参考文献
- Kim, Y. -M., Chen, P. Ligand binding energy in [(bipy)Rh(PCH)]+ by collision-induced dissociation threshold measurements. International Journal of Mass Spectrometry. 202 (1-3), 1-3 (2000).
- Plattner, D.
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