低酸素圧を利用したマウス骨髄間質細胞培養における造血細胞の減少

サマリー

骨髄間質細胞(BMSC)の日常的な培養は、不均一な細胞集団の単離につながり、多くの細胞は造血起源です。ここでは、低酸素圧を利用してマウスBMSC培養物中の造血汚染物質を大幅に低減する方法について述べる。

要約

現在、骨格幹細胞(SSC)の均質な集団を前向きに分離するための普遍的に受け入れられているマーカーは依然として不足しています。このため、造血をサポートし、骨格のすべての機能に寄与するBMSCは、多能性間葉系前駆細胞(MMP)の研究やSSC機能の推測に引き続き広く使用されています。さらに、筋骨格系疾患の研究に使用されるトランスジェニックマウスモデルの幅広さを考えると、BMSCの使用は、MMPおよびSSCを調節する分子メカニズムを調べるための強力なツールとしても機能します。しかし、マウスのBMSCの一般的な単離手順では、回収された細胞の50%以上が造血起源であり、これらの研究中に生成されたデータの解釈を妨げる可能性があります。ここでは、BMSC培養物中のCD45⁺ 細胞を選択的に排除するために、低酸素圧または低酸素法を用いた方法について述べる。重要なことに、この方法は、造血汚染物質を減らすだけでなく、BMSC培養中のMMPおよび推定SSCの割合を高めるためにも簡単に実施できます。

概要

造血幹細胞(HSC)と同様に、SSCは骨の微小環境内に収容されています。しかし、HSCとは異なり、現在、SSC1,2,3を前向きに同定するために使用できる、広く受け入れられている細胞表面マーカーは不足しています。しかし、in vitro培養システムおよびin vivo再構成アッセイは、BMSCの一部が造血をサポートする能力、および間葉系のすべての細胞に分化する能力を有することを示しています^4,5。したがって、BMSCは非常に不均一な集団を表していますが、これらの細胞の一部は、起源組織のすべての細胞を自己再生および再構成する能力によって定義されるように、真正な幹細胞の特徴を持っています。さらに、細胞表面マーカーの使用とは異なり、BMSCは組織培養プラスチック^6,7への急速な接着に基づいて迅速に単離することができる。これらの理由から、BMSCはSSCの代用としてよく使用されます⁵。

ヒト組織からBMSCを成功裏に単離するためには、組織培養(TC)プラスチックへの優先的な接着が使用されてきましたが、マウスモデルには追加の課題があります。最も注目すべきは、マウス造血細胞がTCプラスチックとBMSCの両方に接着する能力を持っているため、このモデルシステムでは高い造血汚染が発生し、この単離法を使用して生成されたデータの解釈が妨げられます⁶。

特に、BMSCは、酸素張力が1%〜^4%の範囲の骨微小環境に存在します8。しかし、標準的な組織培養条件下では、細胞培養インキュベーターは超生理学的レベルを表す21%の大気酸素レベルに維持されます。これらの違いの機能的重要性を強調して、間葉系起源の細胞を21%酸素で培養すると、細胞死の増加と関連しています^9,10。また、最近では、血液細胞と間葉系細胞が低酸素圧に対して異なる応答を示すことを示しました。具体的には、BMSCsの培養物を低酸素圧に維持すると、CD45⁺造血細胞の数が大幅に減少します。実際、この技術を用いてCD45⁺造血細胞が90%減少したことに気づいた¹¹。

ここでは、BMSCのルーチン培養中に造血汚染を大幅に低減し、間葉系細胞の純度を向上させるために、ラボで簡単に実装できるプロトコルを共有しています。

プロトコル

マウスモデルを利用した記載されているすべての方法は、承認された動物施設管理および使用委員会(IACUC)のプロトコル(A187-19-08)に準拠して実施されました。

1. 後肢骨の解剖

1. 10〜12週齢の雄または雌のC57BL / 6マウスを_CO2 窒息により安楽死させ、2〜4 L / minの流量を使用して安楽死させ、その後、斬首による死亡を確認します。このアッセイでは、雌マウスまたは雄マウスのいずれかを使用でき、結果に期待される違いはありません。70%エタノールで毛皮をスプレーします。
2. 滅菌済みの外科用鉗子とハサミを使用して、胸骨の下の皮膚に小さな切開を行います。手を使って体の周囲で皮膚を引き裂き、次に皮膚を遠位に後肢に向かって引っ張って、下にある組織を露出させます。
3. 滅菌した外科用鉗子とハサミを使用して、大腿骨頭(ボール)を骨盤(股関節)の寛骨臼(ソケット)から分離することにより、後肢を優しく取り除きます。滅菌鉗子とメスを使用して骨に沿って優しくこすり、できるだけ多くの軟部組織を取り除きます。
4. 滅菌メスを使用して、最小限の抵抗で大腿骨と脛骨を分離し、2つの骨をつなぐ靭帯(外側および内側側副、前十字靭帯と後十字靭帯、膝蓋腱[靭帯])を切断します。重要なのは、分離後、大腿骨遠位端と近位脛骨の両方の顆を無傷に保つことです。
5. 遠位大腿骨の場合は、大腿骨頭と第3転子との間に切り込みを入れ、成長板の近位の骨端に切り込みを入れて、成長板への損傷を最小限に抑えます。
6. 近位脛骨の場合は、外側くるぶしの近位に1つのカットを行い、成長板のすぐ近位に脛骨プラトーの遠位に1つのカットを行います。
7. 大腿骨と脛骨を切った面を下にして、個々の1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れます。

2. 大腿骨および脛骨からのBMSCの分離

1. 1.5 mLの微量遠心チューブをベンチトップ遠心分離機に入れ、10,000 x g 、4°C、1秒間遠心します。
2. 滅菌ピンセットを使用して、マイクロ遠心チューブから骨を慎重に取り除き、マイクロ遠心チューブの底に骨髄の赤い栓を残します。骨幹に骨髄が残っている場合は、骨を新しいチューブに移し、クイックスピンを繰り返し、再懸濁ステップ2.3でペレットを1つのチューブに結合します。
3. P1000ピペットを使用して、骨髄ペレットを500 μLの成長培地、20%ウシ胎児血清および1,000 U/mlのペニシリン-ストレプトマイシンを添加したMEMaに穏やかに再懸濁します。骨髄間質細胞を、4.5 mLの成長培地を含む15 mLの円錐管に移します。

3.赤血球の溶解

1. 細胞を300 x g 、4°Cで5分間スピンダウンします。増殖培地を吸引し、ペレットを1.5 mLの赤血球溶解バッファーに穏やかに再懸濁します。
2. 室温で75〜90秒間インキュベートします。直ちに10mLの増殖培地で急冷します。
3. 細胞を300 x g 、4°Cで5分間スピンダウンします。培地を吸引し、ペレットを10 mLの成長培地に再懸濁してカウントします(ステップ4を参照)。
   注:細胞ペレットは赤ではなく白で、赤血球の溶解が成功したことを示します。ペレットがまだ赤色の場合は、赤血球溶解バッファーの追加ラウンドを実行できます。

4. BMSCのめっき

1. プレーティング用の生細胞をカウントするには、10 μLの細胞懸濁液を取り出し、10 μLのTrypan Blue溶液に加えます。
2. 細胞:トリパンブルー溶液混合物10μLを血球計算盤に置き、生細胞(非青色)細胞をカウントします。ほとんどの細胞はトリパンブルーを除外する必要があります。
3. コロニーアッセイでは、細胞を60,000細胞/cm² の密度でT-25 cm² 組織培養フラスコに播種します。高密度BMSC培養では、130,000細胞/^cm2 の密度の細胞を100 mm² の組織培養皿にプレート化します。T-25 cm² フラスコには総容量5 mL、100 cm² 皿には合計容量10 mLを使用します。.
4. 細胞を1%-2%(低酸素症)または21%酸素(正常酸素症)および5%CO₂のいずれかで3時間インキュベートします。低酸素圧でのBMSCのルーチン培養には、低酸素細胞インキュベーターまたは低酸素チャンバーのいずれかを使用できます。窒素と二酸化炭素のガス流が酸素とCO₂の所望の範囲になるように、製造元の指示に従って各機器を設定します。
5. 3時間後、プレートを1xPBSで3回注意深くすすいでください。付着し始めた細胞が破壊されないように、吸引を遅らせ、組織培養皿の側面にピペッティングして、穏やかにすすぎます。
6. 最後の1x PBSリンスに続いて、PBSを100 cm² 皿を使用する場合は10 mLの成長培地、T-25cm² フラスコを使用する場合は5 mLの成長培地と交換します。すすぎ後、ほとんどの浮遊細胞を取り除く必要があります。

5. 低酸素状態でのBMSCの維持

1. 低酸素培養の場合は、細胞を1%〜2%_O2 および5%CO₂に設定した低酸素チャンバーまたはインキュベーターに維持します。正常酸素培養の場合、細胞を21%_O2 および5%CO 2に維持します_。 低酸素インキュベーターを使用する場合は、大気中の酸素の流入を防ぐために、ドアが最小限に開いていることを確認してください(21%)。メディアは2〜3日ごとに交換してください。
2. コロニーアッセイでは、細胞を7〜10日間インキュベートし、その後、コロニーを列挙するか、分化またはその他の目的のアッセイを開始します。低酸素条件下では、50〜120のコロニーが予想されますが、正常酸素条件下では、5〜30のコロニーが予想されます。
3. 高密度BMSC培養の場合、低酸素培養で約7〜10日、正常酸素培養で約14〜21日、コンフルエントになるまで細胞をインキュベートします。コンフルエントになったら、0.25%トリプシンで細胞をトリプシン化し、目的のアッセイで使用します。
4. 細胞を可視化するには、組織培養皿をステージ上に置き、相対物レンズを光路に回転させ、対応する対物レンズに対して位相コントラストスライダーが選択されていることを確認します。セルを100倍または200倍の倍率で表示します。

結果

7日間の細胞単離後、21%酸素で培養された細胞は非常に不均一です。具体的には、サイズに大きなばらつきがあり、大きな双極細胞と複数の突起を含む小さな細胞が間隔を空けています(図1A)。対照的に、低酸素条件下で増殖した細胞は、非常に均質です。コロニー内の細胞は、サイズが比較的類似しており、バイポーラな外観をしており、組織培養プラスチック上で成長した間葉系起源の他の細胞に似ています(図1B)。培養後14日目のクローン密度では、正常酸素培養で維持された細胞は、T25cm² フラスコあたり約5〜30のコロニーを有し、低酸素条件で増殖したコロニーと比較するとサイズが小さくなります(図2A)。特に、低酸素状態で増殖した細胞は、T25cm² フラスコあたり50〜120コロニーの範囲の堅牢なコロニー形成を特徴とするように増殖します(図2B)。さらに、酸素が21%の場合、培養細...

ディスカッション

我々の観察に基づくと、BMSCはマクロファージや造血起源の他の細胞よりも早く組織培養プラスチックに付着する¹¹。このため、めっきの3時間後にプレートをすすぐことは、後の時点に付着する可能性のある浮遊造血細胞を除去するため、重要なステップです。さらに、これらのすすぎは、特に皿の側面に培地をピペッティングして、まだマトリックスを敷設していない緩く付着した丸みを帯びたBMSCが組織培養皿に広がるのを防ぐなど、注意して行う必要があります。3回のすすぎの後、ほとんどの浮遊細胞を取り除く必要があります。この時点でBMSC培養物をすすぐとCD45⁺ 細胞が減少する一方で、造血細胞の割合を有意に減少させ、間質細胞の割合を増加させるためには、低酸素状態で培養を維持することが必要である¹¹。重要なことは、72時間後にコロニーが現れない場合は、すすぎが厳しすぎて、BMSCと造血細胞の両方が除去された可能性が高いということです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100mm2 組織培養皿	コーニング	353003
1x リン酸バフレッド生理食塩水 (PBS)	Gibco	100010-023
Bright-Line 血球計算盤	Sigma-Aldrich	Z359629
C57BL/6J	ジャクソン研究所	664
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	GE Healthcare LifeSciences	SH30071.03
InvivO2 400	Baker Ruskinn	https://bakerco.com
MEMα, nucleosides	Gibco	12571-063
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
赤血球溶解バッファー Hybri-Max	Sigma-Aldrich	R7757
T-25cm2 組織培養フラスコ	Corning	430168
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154
Trypsin-EDTA (0.25%), フェノールレッド	Gibco	25200-056