液体-ソフトマター相互作用観察のための光誘起 In situ 透過型電子顕微鏡

サマリー

本プロトコルは、光照明システムによる透過型電子顕微鏡(TEM)の修飾、液体細胞の作製、および細菌細胞と光増感剤との間の光誘起相互作用の in situTEM 観察について説明する。サンプル調製方法、電子線損傷、およびイメージングについても説明します。

要約

現在のプロトコルは、 in situ 光誘起観察のための透過型電子顕微鏡(TEM)セットアップの変更を説明しています。対物レンズポールピースの上の電子柱にガラス光ファイバーを挿入し、調整可能な光源であるレーザーを使用してデバイスを作製しました。照明器が外部測定システムを使用して校正された後、観察されたプロセスのニーズに合わせて照明の強度を調整することができます。この照明システムは、現在熱心に研究されている抗菌光線力学療法現象を画像化するために利用されました。サンプルは、炭素、グラフェン、または窒化ケイ素基板上に細菌の懸濁液をスポットし、余分な溶液を吸い取り、光増感剤溶液をスポットし、余分な液体を再度吸い取り、次に液体セルを組み立てることによって調製されました第2の基板またはグラフェン膜。イメージング実験自体のプロセスには、低倍率および最小量の電子を使用して観察に適した場所を選択し、次に光源を周期的に活性化して、必要な最小限の電子量で指定された間隔で後続の画像をキャプチャすることが含まれます。各露光の電子線量と使用される照明の時間と強度は、観察された現象の複雑さのために注意深く記録する必要があり、同時にプロセスは光と電子の両方駆動です。実際の実験が行われた後、同じ線量の電子が使用されるが、追加の光の影響がなく、より小さな線量の電子がより高い線量の光に使用される追加の制御観察が行われる必要がある。これにより、生命科学と材料科学の両分野において、光誘起微細構造効果と電子による構造効果を区別することができます。

概要

高分解能の光誘起現象は、ナノエンジニアリング1,2,3、触媒^4,5、バイオフォトニクス⁶など多くの分野で興味深いものです。そのような実験を可能にするいくつかのオリジナルの設計は、サンプル^{ホルダー1}、^4、7、⁸、⁹および顕微鏡^10、11に取り付けられた光ファイバの変更を含む文献に見出すことができる。

光照明、液体環境、透過型電子顕微鏡(TEM)の組み合わせは、光誘起プロセスの詳細な動的研究のための絶好の機会を提供します。しかしながら、顕微鏡内部の高真空条件は、多くの液体、特に水溶液にとってかな....

プロトコル

1. 透過型電子顕微鏡の修正

1. 対物レンズ上部の顕微鏡カラムに光ファイバ( 材料表を参照)を接続して、透過型電子顕微鏡を変更します。対物レンズとコンデンサーレンズの間に数センチのスペースを確保し、さらにアクセサリー用の空きスロットを確保します。
   注:専用のサンプル^{ホルダー4} または逆構成¹ のカソードルミネッセンス観察用のホルダーも使用できます。
2. 粗い真空ポンプを使用してシステムに漏れがないか確認してください。システムに真空漏れが見られない場合は、高真空下でシステムをテストします。
   1. 真空システムの作動が標準の通気顕微鏡始動から逸脱していないことを確認してください。モジュールの実行、組み立て、または試運転に問題がある場合は、認定サービス担当者またはデバイスの製造元に連絡してください。
      注意: 正しく作成および取り付けられたイルミネーターは、電子ビームを覆い隠すことはありません。顕微鏡の動作中にビームが連続してシフトすると、非導電性の光ファイバが金属シールドで十分に覆われず、電荷が蓄積されます。この場合、光ファイバを導電性ジャケットの奥深くまでスライドさせます。
3. フォトダイオードパワーセンサーを使用して光強度を測定し ます(材料の表を参照)。

結果

実験セットアップは、液体中で発生する光誘起プロセスを高解像度で観察するように設計されました。画像の競合分析により、電子ビームによる損傷と光化学反応に関連する変化を区別することができました。敏感な試料(この場合、液体でカプセル化された細胞)に対する電子ビームの影響は、電子が均一に透過するため、照射領域のいたるところに見られました。もちろん、効果は電子線量に依存するため、より集束されたビームでは、サンプル形態のより重要な変化をより早く観察できます。この深刻な損傷と比較して、光力学的不活性化の実際の破壊的影響は、照射された光増感剤に囲まれた領域でのみ細胞の特定の部分で発生しました。

細菌イメージングの例では、文献によると、30 e⁻/nm²の線量は細菌¹⁷の致死閾値であるように思われ、著者の以前の研究で大幅に超えていました^6,25。しかしながら、6000 e⁻.......

ディスカッション

照明器の設置と試運転には基本的なサービス知識が必要であり、顕微鏡を損傷する可能性があります。顕微鏡に光を導入する最も簡単な方法は、通常TEM偏向コイルと追加の検出器のためのスペースがある対物レンズの上部から光ファイバーを接続することです。同じ場所にサンプル真空ロックとサンプル設置メカニズムを収容する古いトップエントリーデバイスからは、より多くの空きスペースも期待できます。この構成は、例示的な照明器設計を含む以前のレポート²⁵に広く記載されている。顕微鏡の内部が対物レンズの上方に光ファイバの設置を許可しない場合、照明器は側面³²から対物レンズポールピースの内部に設置されてもよい。他の解決策は、専用のサンプル^{ホルダー4} を使用するか、またはカソードルミネッセンス観察¹のためのホルダーの逆の使用を想定しています。

一般に、TEM用の液体サンプルの調製は複雑であり、経験と手動のスキルが必要です。液体.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
200メッシュの銅グリッド上のカーボンフィルム	寒天科学	AGS160	観察および液体細胞調製用の標準TEMグリッド
クロスオーバーピンセット	デュモン	N5	ピンセットは液体細胞調製用ニーセサリーです
フォトダイオードパワーセンサー	ThorLabs	S130C	光強度測定に使用されるセンサー
ポリイミドコーティングマルチモードファイバー	Thorlabs	FG400UEP	10.1016/j.ultramic.2021.113388に従って、オンサイトビルドアダプターを使用して顕微鏡に組み込む必要があります
透過型電子顕微鏡	日立	H-800	サイドエントリー顕微鏡と交換可能、変更可能
チューナブルダイオードレーザー	CNI	MRL-III-660D	光の波長は、光増感剤の吸収スペクトルに基づいて選択する必要があります

任意の