前臨床モデルは、がん生物学の知識を進歩させ、治療効果を予測することを目的としています。この論文では、腫瘍組織断片を用いたゼブラフィッシュベースの患者由来異種移植片(zPDX)の生成について説明します。zPDXを化学療法で治療し、その治療効果を移植組織の細胞アポトーシスに関して評価した。
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この記事について
サマリー
要約
がんは世界中の主な死因の1つであり、多くの種類のがんの発生率は増加し続けています。スクリーニング、予防、治療の面で多くの進歩が見られました。しかし、がん患者の化学感受性プロファイルを予測する前臨床モデルはまだ不足しています。このギャップを埋めるために、 in vivo 患者由来の異種移植片モデルが開発され、検証されました。このモデルは、受精後2日目のゼブラフィッシュ (Danio rerio) 胚に基づいており、患者の手術標本から採取した腫瘍組織の異種移植片断片のレシピエントとして使用されました。
腫瘍の挙動および治療への反応を分析する上で重要である腫瘍微小環境を維持するために、生体試料が消化または分解されなかったことも注目に値する。このプロトコルは、原発性固形腫瘍外科的切除からゼブラフィッシュベースの患者由来異種移植片(zPDX)を確立するための方法を詳述しています。解剖病理学者によるスクリーニングの後、標本はメスの刃を使用して解剖されます。壊死組織、血管、または脂肪組織を取り除き、0.3 mm x 0.3 mm x 0.3 mmの断片に切り刻みます。
次に、断片を蛍光標識し、ゼブラフィッシュ胚の卵周囲腔に異種移植します。多数の胚を低コストで処理できるため、複数の抗がん剤に対するzPDXの化学療法感受性をハイスループットにin vivo で解析することができます。共焦点画像は、対照群と比較して化学療法治療によって誘発されるアポトーシスレベルを検出および定量するために日常的に取得されます。異種移植片の手順は、1日で完了することができ、共同臨床試験の治療スクリーニングを実施するための合理的な時間枠を提供するため、時間的に大きな利点があります。
概要
臨床がん研究の問題点の一つは、がんが単一の疾患ではなく、時間とともに進化する様々な疾患であり、腫瘍自体や患者の特性に応じて特定の治療が必要であることです1。したがって、課題は、がん治療の結果を早期に予測するための新しい個別化された戦略を特定するために、患者指向のがん研究に移行することです2。これは、膵管腺癌(PDAC)が治療が困難な癌と見なされ、5年生存率が11%であるため、特に重要です3。
診断の遅れ、急速な進行、効果的な治療法の欠如は、PDACの最も差し迫った臨床問題のままです。したがって、主な課題は、患者をモデル化し、個別化医療に沿った最も効果的な治療法を選択するためにクリニックで適用できるバイオマーカーを特定することです4,5,6。時が経つにつれて、がん疾患をモデル化するための新しいアプローチが提案されてきました:患者由来オルガノイド(PDO)およびヒト腫瘍組織の供給源に由来するマウス患者由来異種移植片(mPDX)。それらは、治療に対する反応と抵抗性、ならびに疾患の再発を研究するために疾患を再現するために使用されてきた
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プロトコル
イタリア公衆衛生省は、動物の使用と管理に関する指令2010/63 / EUに準拠して、記載されているすべての動物実験を承認しました。地元の倫理委員会は、登録番号70213で研究を承認しました。関係するすべての被験者からインフォームドコンセントが得られました。始める前に、すべての解決策と機器を準備し(セクション1)、魚を渡る必要があります(セクション2)。
1.溶液と機器の準備
メモ: 調製する溶液とメディアについては、 表 1 を参照してください。
- アガロースゲルサポート
- 電子レンジ対応フラスコでアガロース粉末を秤量し、所定の量のE3ゼブラフィッシュ培地に溶解して1%ゲルを作ります。アガロースが完全に溶解するまで電子レンジで加熱します。
注意: 溶液を沸騰させすぎないでください。 - 溶かしたアガロースをペトリ皿に注ぎ、ゲルが完全に固まるまで待ちます。
- 先端を切り取ったプラスチックパスツールピペットを使用して、小さなアガロースシリンダー(高さ~5 mm)を作ります。調製したら、アルミホイルで包んで4°Cのシャーレに保管します。
- 電子レンジ対応フラスコでアガロース粉末を秤量し、所定の量のE3ゼブラフィッシュ培地に溶解して1%ゲルを作ります。アガロースが完全に溶解するまで電子レンジで加熱します。
- ガラスマイクロニードル
- ホウケイ酸ガラスの毛細血管をプーラーで引っ張って、細い針を取得します....
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結果
このプロトコルは、原発性ヒト膵臓腺癌からzPDXを確立するための実験的アプローチを説明しています。腫瘍サンプルを採取し、細切し、プロトコルセクション4に記載されているように蛍光色素を使用して染色した。次に、zPDXは、プロトコルセクション5で説明されているように、2つのdpfゼブラフィッシュ胚の卵周囲腔に腫瘍片を移植することによって首尾よく確立されました。プロトコルセクション6に記載されるように、zPDXをさらにスクリーニングして、患者由来の癌細胞の化学療法感受性プロファイルを同定した。たとえば、化学療法の組み合わせFOLFOXIRI(5-フルオロウラシル、フォリン酸、オキサリプラチン、およびイリノテカン)は、進行性膵管腺癌および転移性結腸直腸癌の第一選択化学療法として使用されるため、テストされました。zPDXの全マウント画像を共焦点顕微鏡でZスタックとして取得し、プロトコルセクション8および9に記載されているようにアポトーシス誘導を分析しました。図1A、Bに示すように、併用療法は、対照群と比較して細胞アポトーシスの増加をもたらした。ここで報告.......
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ディスカッション
がん研究におけるin vivoモデルは、がん生物学を理解し、がん治療反応を予測するための貴重なツールを提供します。現在、異なるin vivoモデル、例えば、遺伝子改変動物(トランスジェニックマウスおよびノックアウトマウス)またはヒト初代細胞からの患者由来の異種移植片が利用可能である。多くの最適な機能にもかかわらず、それぞれにさまざまな制限があります。特に、前述のモデルは、患者の腫瘍組織の微小環境を模倣するための信頼できる方法を欠いている。
腫瘍微小環境が薬物応答において多くの重要な役割を果たす可能性があることが示唆されています18。したがって、腫瘍組織の微小環境を維持する適切な動物モデルを見つけるために、2つのdpfゼブラフィッシュ胚に異種移植された腫瘍組織の断片を使用して、代替のPDXモデルが開発されました。このプロトコルは、多数の胚で異種移植片を実行する方法を記述し、単剤および組み合わせの両方で薬物のハイスループットスクリーニングを可能にします。
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開示事項
著者には、宣言する利益相反はありません。
謝辞
この作品は、フォンダツィオーネピサ(プロジェクト114/16)によって資金提供されました。著者らは、Azienda Ospedaliera Pisanaの組織病理学ユニットのRaffaele Gaeta氏に、患者サンプルの選択と病理学のサポートに感謝の意を表したい。また、実験における技術サポートを提供してくれたアレッシア・ガランテにも感謝します。この記事は、COST(欧州科学技術協力)の支援を受けたCOST Action TRANSPAN, CA21116の作業に基づいています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 5-フルオロウラシル | テバ ファーマ AG | SMP 1532755 | |
| 48 マルチウェル プレート | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 マルチウェル プレート | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| アセトン | メルク | 179124 | |
| アガロース パウダー | メルク | A9539 | |
| アムホテリシン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15290018 | |
| 抗核抗体 クローン 235-1 | メルク | MAB1281 | 1:200希釈 |
| 水族館ネット QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | メルク | A9418 | |
| CellTrace | サーモフィッシャーサイエンティフィック | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | サーモフィッシャーサイエンティフィック | C7001 | |
| CellTracker ディープレッド | サーモフィッシャーサイエンティフィック | C34565 | |
| 切断カスパーゼ-3 (Asp175) (5A1E) ウサギ mAb | 細胞シグナル伝達技術 | 9661S | 1:250 希釈ジ |
| メチルスルホキシド (DMSO) | PanReac AppliChem ITW試薬 | A3672,0250 | |
| デュモン#5鉗子 | ワールド精密機器 | 501985 | |
| フォリン酸- Lederfolin | ファイザー | ||
| ガラス毛細血管、3.5" | ドラモンドサイエンティフィック | カンパニー3-000-203-G / X | 外径= 1.14 mm。 |
| ガラスバイアル | VWRインターナショナル | WHEAW224581 | |
| ヤギアンチウサギ IgG (H+L)交差吸着型二次抗体 Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 1:500希釈 |
| ヤギ血清 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 31872 | |
| ヘキスト 33342 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | H3570 | |
| イリノテカン | ホスピーラ | ||
| 低温冷凍バイアル | VWR インターナショナル | 479-1220 | |
| マキルウェイン ティッシュチョッパー | ワールド精密機器 | ||
| マイクロプレートミキサー | SCILOGEX | 822000049999 | |
| オキサリプラチン | テバ | ||
| パラホルムアルデヒド | メルク | P6148-500G | |
| PBS | サーモフィッシャー サイエンティフィ | 14190094 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15140122 | |
| ペトリ皿 100 mm | Sarstedt | 83 3902500 | |
| ペトリ皿 60 mm | Sarstedt | 83 3901 | |
| プラスチックパスツールピペット | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| ヨウ化プロピジウム | メルク | P4170 | |
| RPMI-1640 ミディアム | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11875093 | |
| メス刃 No 10 滅菌ステンレス鋼 | VWR インターナショナル | SWAN3001 | |
| メスハンドル #3 | ワールド精密機器 | 500236 | |
| トリカイン | メルク | E10521 | |
| トリトン X-100 | メルク | T8787 | |
| トゥイーン20 | メルク | P9416 | |
| 垂直マイクロピペットプーラー | シャッター機器 | P-30 |
参考文献
- Rubin, H. Understanding cancer. Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).
- Krzyszczyk, P., et al. The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment. Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
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再版と許可
