化学感受性試験のためのゼブラフィッシュ患者由来膵臓癌異種移植片の樹立

臨床がん研究の問題点の一つは、がんが単一の疾患ではなく、時間とともに進化する様々な疾患であり、腫瘍自体や患者の特性に応じて特定の治療が必要であることです¹。したがって、課題は、がん治療の結果を早期に予測するための新しい個別化された戦略を特定するために、患者指向のがん研究に移行することです²。これは、膵管腺癌(PDAC)が治療が困難な癌と見なされ、5年生存率が11%^{であるため}、特に重要です3。

診断の遅れ、急速な進行、効果的な治療法の欠如は、PDACの最も差し迫った臨床問題のままです。したがって、主な課題は、患者をモデル化し、個別化医療に沿った最も効果的な治療法を選択するためにクリニックで適用できるバイオマーカーを特定することです^4,5,6。時が経つにつれて、がん疾患をモデル化するための新しいアプローチが提案されてきました:患者由来オルガノイド(PDO)およびヒト腫瘍組織の供給源に由来するマウス患者由来異種移植片(mPDX)。それらは、治療に対する反応と抵抗性、ならびに疾患の再発を研究するために疾患を再現するために使用されてきた^7,8,9。

同様に、ゼブラフィッシュベースの患者由来異種移植片(zPDX)モデルへの関心は、そのユニークで有望な特性¹⁰のおかげで増加しており、癌研究のための迅速かつ低コストのツールを表しています^11,12。zPDXモデルでは腫瘍サンプルサイズが小さいため、化学療法のハイスループットスクリーニングが可能です¹³。zPDXモデルに使用される最も一般的な手法は、完全なサンプル消化と初代細胞集団の移植に基づいており、腫瘍を部分的に再現しますが、腫瘍の微小環境の欠如と悪性細胞と健康な細胞の間のクロストークという欠点があります¹⁴。

この研究は、zPDXを前臨床モデルとして使用して、膵臓がん患者の化学感受性プロファイルを特定する方法を示しています。貴重な戦略は、細胞増殖の必要がないため、異種移植プロセスを促進し、化学療法スクリーニングの加速を可能にします。このモデルの強みは、よく知られているように、腫瘍の挙動はそれらの相互作用に依存するため、すべての微小環境成分が患者の癌組織内でそのまま維持されることです^15,16。これは、腫瘍の不均一性を維持し、患者固有の方法で治療結果と再発の予測可能性を改善することに貢献し、zPDXモデルを共同臨床試験で使用できるようにするため、文献の代替方法よりも非常に有利です。この原稿では、zPDXモデルの作成に必要なステップを、患者の腫瘍切除から始めて治療し、化学療法に対する反応を分析する手順について説明します。

イタリア公衆衛生省は、動物の使用と管理に関する指令2010/63 / EUに準拠して、記載されているすべての動物実験を承認しました。地元の倫理委員会は、登録番号70213で研究を承認しました。関係するすべての被験者からインフォームドコンセントが得られました。始める前に、すべての解決策と機器を準備し(セクション1)、魚を渡る必要があります(セクション2)。

1.溶液と機器の準備

メモ: 調製する溶液とメディアについては、 表 1 を参照してください。

1. アガロースゲルサポート
   1. 電子レンジ対応フラスコでアガロース粉末を秤量し、所定の量のE3ゼブラフィッシュ培地に溶解して1%ゲルを作ります。アガロースが完全に溶解するまで電子レンジで加熱します。
      注意: 溶液を沸騰させすぎないでください。
   2. 溶かしたアガロースをペトリ皿に注ぎ、ゲルが完全に固まるまで待ちます。
   3. 先端を切り取ったプラスチックパスツールピペットを使用して、小さなアガロースシリンダー(高さ~5 mm)を作ります。調製したら、アルミホイルで包んで4°Cのシャーレに保管します。
2. ガラスマイクロニードル
   1. ホウケイ酸ガラスの毛細血管をプーラーで引っ張って、細い針を取得します(設定:HEAT 990、PULL 550)。
      注:1つのキャピラリーから、先端直径10μmの細い針を2本得ることができます。

2.魚の交配と卵の収集

1. Avdeshら¹⁷によって説明されているように、組織移植の3日前に成魚を繁殖タンクに移す。
2. 注:男性と女性の比率は1:1または2:3をお勧めします。魚の密度は、水1リットルあたり最大5匹の魚でなければなりません。男性と女性をバリアで一晩分離してください。
3. 翌日、障壁を取り除き、魚が交尾できるようにします。
4. 繁殖タンクから魚を取り出し、収容タンクに戻します。
5. 繁殖タンクから細かいメッシュネットを通して水を注ぎます。受精卵をE3ゼブラフィッシュ培地を含むペトリ皿に移します。
6. 実体顕微鏡でペトリ皿を確認し、濁った卵を捨てます。受精卵を28°Cの新鮮なE3ゼブラフィッシュ培地に保管します。

3. 標本採取

注:オートクレーブ鉗子とメスハンドル。

1. 即時処理
   1. 腫瘍の手術標本を4°Cの腫瘍培地10 mL(直径5 mmから10 mmの範囲の腫瘍標本)に採取します。サンプルを目的の場所から4°Cで移し、すぐに処理します。
2. 一晩保管(オプション)
   1. 手術用腫瘍標本を10 mLの腫瘍培地に採取し、4°Cで一晩保存します。
3. -80°Cでの保管(オプション、最低推奨)
   1. サンプルを-80°Cで、5%ジメチルスルホキシド(DMSO)を添加した腫瘍培地を含む極低温バイアルに保存します。

4. サンプル処理

注意: 滅菌組織培養層流フードの下で手順を実行します。

1. 腫瘍組織全体を5 mLの新鮮な腫瘍培地で洗浄し、プラスチック製パスツールピペットを使用して10回上下にピペッティングします。洗浄媒体を吸引して廃棄します。この手順を 3 回繰り返します。
   注意: 腫瘍組織はプラスチック製のパスツールピペットに付着したままになる可能性があるため、吸引は避けてください。
2. サンプルをペトリ皿に移し、1〜2 mLの新鮮な腫瘍培地に浸します。メスの刃を使用して腫瘍サンプルを小片(1〜2 mm³)に切断し、腫瘍培地を入れた滅菌5 mLプラスチックチューブに入れます。
3. マキルウェインティッシュチョッパーを100μmの厚さに設定します。試料の破片をチョッパーの円形のプラスチックテーブルに置き、それらを粉砕します。テーブルを90°回転させ、チョッピングを繰り返します。
4. 断片を300 × g で3分間遠心分離します。その後、上清を注意深く吸引し、廃棄します。
5. 蛍光セルトラッカー、CM-DiI(ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水[DPBS]中の最終濃度10 μg/mL)、ディープレッド(DPBS中の最終濃度1 μL/mL)、またはセルトレース(DPBS中の最終濃度5 μM)でフラグメントを30分間インキュベートし、チューブを37°Cの水浴に入れます。
6. 10分ごとにゆっくりと上下にピペッティングして、フラグメントを再懸濁します。
   注意: CellTraceの場合は、製造元の指示に従って、インキュベーションの最後に少なくとも1%のタンパク質を含む培地を追加します。
7. 300 x g で3分間遠心分離し、上清を廃棄します。このステップを1 mLのDPBSで3回繰り返し、取り込まれていない色素を除去します。
8. 断片を60 mmのペトリ皿に5 mLのDPBSに懸濁します。
   注意: 組織が乾かないようにしてください。

5. zPDXの設立

注意: 滅菌組織培養層流フードの下で手順を実行します。

1. 受精後2日間(dpf)の胚に、E3ゼブラフィッシュ培地中の0.16 mg / mLトリカインで麻酔します。
2. 3つのアガロースシリンダー(ステップ1.1.3)をペトリ皿に入れ、ゼブラフィッシュの胚をシリンダーの上に置き、片側を露出させます。余分な溶液を取り除き、胚を薄いフィルムに保ちます。
3. 滅菌鉗子で染色された組織片をペトリ皿から胚が横たわっている1%アガロース支持体に移します。組織を拾い上げ、胚卵黄の上に置き、熱で引っ張ったガラスマイクロニードルを使用して卵胞周囲腔に押し込みます(ステップ1.2.1)。
4. E3 1%ペニシリン-ストレプトマイシン(ペン-ストレップ)を胚に数滴静かに加えて、胚を液体に戻します。
5. すべての胚に対して手順5.2〜5.4を繰り返し、最後にペトリ皿からアガロース支持体を取り出し、35°Cで胚をインキュベートします。
6. 蛍光実体顕微鏡を使用して、着床後2時間で胚の正しい異種移植片(陽性染色)を確認します。完全に卵胞周囲腔内にない腫瘍片を含む胚、および死んだ胚を廃棄します。胚を6つのマルチウェルプレート(最大n = 20胚/ウェル)にランダムに分配し、実験計画に従ってグループに均等に分けます(例:コントロールとFOLFOXIRI)。

6.治療

1. 薬物(例:.、5-フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカン)をE3 1%ペンストレップに希釈し、数回上下にピペッティングして完全に混合します。.Usaiら¹²によって提案されたように、等価血漿濃度(EPC)に対して、魚水中の薬物の5倍希釈を使用する。
2. 薬を混ぜてカクテルを準備します(例:フォルフォキシリ)。
3. 各ウェルから培地を取り出し、移植の2時間後に薬物カクテルを加える。
4. 胚を3日間治療します。ドラッグカクテルを毎日更新してください。

7. ホールマウント免疫蛍光染色

注意: 開始する前に、アセトンを-20°Cで置き、表1にリストされている溶液を準備します。

1. 1日目:
   1. 幼虫を1 mLの4%パラホルムアルデヒドでガラスバイアルに4°Cで一晩固定します。
2. 2日目:
   1. 幼虫を1 mLのPBSで3 x 5分間洗浄し、実験室のプラットフォームロッカー(400 rpm)で穏やかに攪拌します。
   2. 1 mLの100%メタノールに-20°Cで一晩保存します(または長期保存の場合)。
   3. 1 mLのPTw(PBS中の0.1%トゥイーン)で3 x 10分間再水和し、実験室のプラットフォームロッカー(400 rpm)で穏やかに攪拌します。
   4. 1 mLの150 mM Tris-HClをpH 8.8で室温で5分間透過処理した後、70°Cで15分間加熱します。
   5. 1 mLのPTwで2 x 10分間洗浄し、実験室のプラットフォームロッカー(400 rpm)で穏やかに攪拌します。
   6. 1 mLのdH 2 Oで₂x 5分間洗浄し、実験室のプラットフォームロッカー(400 rpm)で穏やかに攪拌します。
   7. 1 mLの氷冷アセトンで-20°Cで20分間透過処理します。
   8. 1 mLのdH 2 Oで₂x 5分間洗浄し、実験室のプラットフォームロッカー(400 rpm)で穏やかに攪拌します。
   9. 1 mLのPTwで2 x 5分間洗浄し、実験室のプラットフォームロッカー(400 rpm)で穏やかに攪拌します。
   10. 幼虫を1 mLのブロッキングバッファー中で4°Cで3時間インキュベートし、実験室のプラットフォームロッカー(400 rpm)で穏やかに攪拌します。
   11. 幼虫をグループごとに分けたウェルプレートに次のように配置します:96ウェルプレートの50 μLの容量/ウェルに10匹の幼虫、または48ウェルプレートに100 μLの容量/ウェルに20匹の幼虫。
   12. ブロッキングバッファーを廃棄し、インキュベーションバッファーで希釈した一次抗体溶液(例:ウサギ抗ヒト切断カスパーゼ-3、1:250)で幼虫を暗所で4°Cで一晩インキュベートし、シェーカープレート(400rpm)で穏やかに揺り動かします。推奨ボリュームについては、ステップ 7.2.11 を参照してください。
3. 3日目:
   1. 幼虫を1 mLのPBS-TS(10%ヤギ血清、PBS中の1%トリトンX-100)で3 x 1時間順番に洗浄し、次に1 mLのPBS-T(PBS中の1%トリトンX-100)で2 x 10分、1 mLのPBS-TSで2 x 1時間。各洗浄では、幼虫を含むプレートをシェーカープレート(400 rpm)で静かに攪拌します。
   2. 蛍光色素結合二次抗体(例:ヤギ抗ウサギIgG [H+L]交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 647、1:500)およびインキュベーションバッファーで希釈した100 μg/mL Hoechst 33258をシェーカープレート(400 rpm)上で穏やかに撹拌しながら、暗所で4°Cで一晩インキュベートします。二次抗体溶液の推奨量については、ステップ7.2.11を参照してください。
4. 4日目:
   1. シェーカープレート(400 rpm)で穏やかに攪拌しながら、1 mLのPBS-TSで3 x 1時間、1 mLのPTwで2 x 1時間洗浄します。
   2. 顕微鏡スライド上にエナメル質(厚さ~0.5-1 mm)で円形の層を作成します。エナメル質を乾かし、幼虫を円形層の中央に置き、異種移植片の側面を露出させます。
   3. 余分な溶液を乾燥させ、ガラスカバーガラスに水溶性の非蛍光封入剤を取り付けます。

8. イメージング

1. 40倍の対物レンズを備えた共焦点顕微鏡下で画像をキャプチャします。次の取得パラメータを使用します:解像度は1024 x 512ピクセル、Z間隔は5 μmです。

9. ImageJによるアポトーシスの解析

1. ロード(フィジーはジャスト)ImageJソフトウェア(https://imagej.net/Fiji/Downloads)を開き、Zスタックファイルイメージを開きます( ファイル|開く)。ポップアップウィンドウで、[スタック 表示/ハイパースタック ]を選択し、[ OK]をクリックします。
2. 画像を選択してさまざまなチャンネルをオーバーレイ する |カラー |コンポジットを作る。
3. 画像の下部にあるZバーをドラッグしてZスタック画像を参照し、異種移植片領域(蛍光細胞トラッカー陽性の細胞)を特定します。ステップ4.5)を参照してください)ゼブラフィッシュペリビテリンスペースで。
4. ポイントツールを選択し、補足ビデオS1に示すように、アポトーシスヒト細胞(蛍光細胞トラッカーおよび切断カスパーゼ-3に対して陽性)の数をカウントします。
5. ポイントツールアイコンをダブルクリックし、カウンターを変更して、ヒト細胞核(CM-DiI陽性細胞の核)の総数をカウントします。

このプロトコルは、原発性ヒト膵臓腺癌からzPDXを確立するための実験的アプローチを説明しています。腫瘍サンプルを採取し、細切し、プロトコルセクション4に記載されているように蛍光色素を使用して染色した。次に、zPDXは、プロトコルセクション5で説明されているように、2つのdpfゼブラフィッシュ胚の卵周囲腔に腫瘍片を移植することによって首尾よく確立されました。プロトコルセクション6に記載されるように、zPDXをさらにスクリーニングして、患者由来の癌細胞の化学療法感受性プロファイルを同定した。たとえば、化学療法の組み合わせFOLFOXIRI(5-フルオロウラシル、フォリン酸、オキサリプラチン、およびイリノテカン)は、進行性膵管腺癌および転移性結腸直腸癌の第一選択化学療法として使用されるため、テストされました。zPDXの全マウント画像を共焦点顕微鏡でZスタックとして取得し、プロトコルセクション8および9に記載されているようにアポトーシス誘導を分析しました。図1A、Bに示すように、併用療法は、対照群と比較して細胞アポトーシスの増加をもたらした。ここで報告されたケーススタディでは、移植された異種移植片におけるアポトーシス細胞の割合の統計的に有意な増加が、対照群と比較してFOLFOXIRI治療群で確認されました(図1C)。

表1:プロトコルで使用されるソリューションとメディア。

補足図S1:PDAC腫瘍サンプルをDiO染色(緑色)し、 2dpfゼブラフィッシュ胚 の卵胞周囲腔に異種移植した。3日間のインキュベーション時間の後、zPDXに2 μg/mLヨウ化プロピジウム(PI;赤)を注射し、3D共焦点イメージングにかけました。細胞生存率は、ヒト細胞の総数のうちPI陽性細胞(DiO陽性)を測定することにより確認した。スケールバー = 100 μm。略語:PDAC =膵管腺癌;DPF =受精後の日数。zPDX = ゼブラフィッシュ患者由来の異種移植片。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ビデオS1:ImageJのマルチポイントツールを使用したアポトーシスヒト細胞カウントの例。 ビデオは、移植後3日目のzPDXのZスタックであり、切断されたカスパーゼ-3とHoechst 33258免疫染色の後に取得されました。略称:zPDX =ゼブラフィッシュ患者由来の異種移植片。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者には、宣言する利益相反はありません。