方法論記事

三次元オルガノイド 培養を用いたヒト 膠芽腫細胞の多様性の維持

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DOI：

10.3791/63745

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2022年8月25日

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1Department of Neurological Surgery, Cleveland Clinic, 2Cardiovascular and Metabolic Sciences, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic

この記事について

サマリー

ここでは、患者一次検体または患者由来の細胞培養から膠芽腫(GBM)オルガノイドを作製し、成熟度まで維持する方法について述べる。これらのGBMオルガノイドは、表現型的に多様な細胞集団を含み、腫瘍微小環境を ex vivoで再現します。

要約

膠芽腫(GBM)は、予後が非常に悪い、最も一般的に発生する原発性悪性脳腫瘍です。腫瘍内の細胞および分子の多様性、ならびに腫瘍微小環境間の複雑な相互作用は、効果的な治療法を見つけることを困難にする可能性があります。従来の接着培養法や球体培養法はこのような複雑さを隠すことができますが、3次元オルガノイド培養法は地域の微小環境勾配を再現することができます。オルガノイドは、患者の腫瘍構造をよりよく模倣し、表現型的に多様な細胞集団を含み、ミディアムスループット実験に使用できる3次元GBM培養の方法です。三次元オルガノイド培養は、従来の培養に比べて手間と時間がかかりますが、独自の利点を提供し、現在のin vitro システムと in vivo システムの間のギャップを埋めるのに役立ちます。オルガノイドは、腫瘍の挙動と耐性のメカニズムをよりよく理解するための癌生物学者の武器の中で非常に貴重なツールとしての地位を確立しており、その用途は拡大し続けています。ここでは、GBMオルガノイドを生成および維持するための方法について詳細に説明する。凍結およびパラフィン包埋技術の両方を使用してオルガノイドサンプル包埋および切片作成を実行する方法の説明、ならびにオルガノイド切片の免疫組織化学および免疫蛍光プロトコルの推奨事項、ならびにオルガノイド細胞生存率の測定についてもすべて説明します。

概要

膠芽腫(GBM)は、最も一般的に発生する原発性脳腫瘍であり、診断1から約15か月の厳しい予後があります。前臨床試験で有効な治療法は、多くの場合、患者にはあまり効果がありません2,3。臨床反応の低下は、GBMの微小環境の不均一性や複雑な腫瘍内相互作用など、多くの要因に起因します。これらは、従来の接着培養法または球培養法では実験室環境で再現するのが難しい場合があります4。GBM内に自己複製癌幹細胞(CSC)のサブセットが存在することも、この複雑さの一因となる可能性があります5,6。CSCは腫瘍の増殖に不可欠であり、活発な血管新生、癌浸潤、および放射線を含む治療に対する耐性を促進することにより、腫瘍の成長を維持します7,8,9。CSCは腫瘍全体に均一に分布しているのではなく、血管周囲ニッチや骨膜壊死領域などの特定の微小環境内で濃縮されており、それぞれが細胞状態の異なる分子調節を提供します10、11、12、13、14。CSCは、微小環境の手がかりの受動的な受信者ではありませんが、代わりに独自の微小環境を改造する能力を持っています7,15,16。CSCの微小環境は、栄養不足、pH、低酸素症などの圧力に応答して幹細胞状態の維持を促進する可能性があり17,18,19,20、モデルシステムにおけるこれらの条件の重要性を示唆しています。したがって、腫瘍内の多様な細胞微小環境の再現は、治療耐性を理解し、新しい治療法を特定するために重要です。

三次元培養は近年人気が高まっている21,22。オルガノイドは他の種類の癌で使用されており、細胞をオルガノイドとして維持する主な目的は、不均一な細胞集団(その多くは通常、より均質な球培養で競合する可能性があります)の成長と、遺伝的特異性を持つ局所腫瘍微小環境と見なされる空間的多様性を可能にすることです4,23,24,25,26.癌細胞の三次元培養には多くの方法があり、それぞれに長所と短所があります27、28、29。オルガノイド培養は、従来の接着性または球体培養に代わるものではない。これは、細胞の微小環境と腫瘍細胞の応答との間の相互作用が重要である特定の質問がある場合に、2次元法の補完的な技術として最適に使用されます。

この記事では、一次患者サンプルまたは患者由来の培養からGBMオルガノイドを生成するための信頼性が高く再現性のある方法について説明します。3次元オルガノイド培養の2つの異なる目的に取り組んでいます:(1)均一性に関係なく最大の生着電位を持つ一次患者組織からのオルガノイドの樹立、または(2)より定量的な実験的使用のための均一なオルガノイドの成長。一次標本をオルガノイドとして樹立する場合、初期培養を確立するために最大細胞数と種類を維持することが優先されるため、単一細胞をフィルタリングしたり、細胞をカウントしたりする必要はありません。しかし、比較実験のためにオルガノイドを増殖させる場合、複製オルガノイドが実験の一貫性と同等であることを保証するために、単一細胞ろ過と細胞カウントが必要です。このプロトコルでは、オルガノイド培養を確立して均一なオルガノイドを作成する方法、オルガノイドを埋め込んで保存するための洗練された方法、および免疫組織化学、免疫蛍光、GBMオルガノイドの全細胞生存率の評価などの標準的な細胞培養実験について詳しく説明します。

プロトコル

以下に詳述するプロトコルのすべてのステップは、クリーブランドクリニック治験審査委員会(IRB)プロトコル#2559および機関バイオセーフティ委員会(IBC)承認#1711に従って開発および実施されました。スフィアとオルガノイドは「ニューロバサルメディアコンプリート」(NBMc)で培養されます。手順については 、表 1 を参照してください。

1. オルガノイド型を作る

  1. パラフィルムシート(約4 cm x 4 cmのサイズ)からパラフィン紙を取り出し、2つの滅菌96ウェルポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プレートの間に置きます。
    1. 培養フードでこれらの手順を実行し、パラフィルムの「内側」(紙で覆われている側)を清潔に保つように特に注意してください。このきれいな面は、くぼみの凹みを作るはずです。
  2. 上部の96ウェルPCRプレートに均等な圧力を加えて、パラフィルムに小さなディンプルを形成します。目標は、パラフィルムに穴を開けずにディンプルの深さを約2mmにすることです。
  3. 2 つの 96 ウェル PCR プレートを穏やかに分離します。くぼみのあるパラフィルムは天板にくっつきます。これをドライアイスの上に約30秒間置きます。
  4. パラフィルムをドライアイス上で30秒間置いた後、滅菌鉗子を使用してパラフィルムを上部の96ウェルPCRプレートから引き抜きます。
    1. パラフィルムを取り外すときは、非常に「注意」するのではなく、素早い動きを使用してください。凍結したパラフィルムは、温めたパラフィルムよりも簡単に取り除くことができ、ディンプルが反転する可能性があります。
  5. 完成したパラフィルム型を、蓋をした滅菌済みの10 cm細胞培養皿に入れます。金型は事前に作成して、無菌性が維持されていれば保管できます。

2.患者組織標本の肉眼解剖

  1. 滅菌培養皿(10 cm細胞培養プレート)で、2つの滅菌カミソリブレードを使用して、圧力をかけながら患者検体を細かく刻みます。
    注:検体のミンチは、培養皿に約500 μLのNBMcがあると最も簡単です。かみそりの刃で、できるだけ細かく刻んでみてください。理想的には、個々のピースは1 mm3 以下です。
  2. 細かく刻んだ腫瘍片を、カットしたp1000ピペットチップを使用して15 mL遠心チューブに移します。
    注:オルガノイドを取り扱うときは、カットp1000ピペットチップのみを使用することが重要です。これらは、鋭利なかみそりを使用して希望の開口部サイズ(約5〜8 mm)にカットし、オートクレーブ滅菌することができます。
  3. 室温(RT)細胞剥離溶液2 mL(材料表)を加え、37°C、5%CO2 インキュベーターに約10分間入れます。
    注意: 数分ごとに観察して混ぜてください。一部の細胞剥離溶液または標本では、さまざまなインキュベーション時間が必要になる場合があります。細胞溶解によるDNA放出を示す凝集が現れた場合は、すぐに次のステップに進みます。
  4. 8 mLのNBMc培地を加えて細胞剥離溶液を中和し、65 x gで3分間スピンします。
  5. 上清を吸引し、組織を1〜2 mLのNBMcに再懸濁します。

3. 患者一次組織からのオルガノイドの生成

注:患者の一次組織からオルガノイドを作製する際の目標は、三次元培養を確立することです。単一セルをフィルタリングしたり、セルをカウントしたりするのではなく、目視検査を使用して初期セル負荷をできるだけ均一に保ちます。初期オルガノイドの成長と確立に不均一性があるのは正常です。各オルガノイドの容量は20 μLになります(ステップ2.5から、16 μLのラミニンリッチ細胞外マトリックス(lrECM)と4 μLの組織をNBMcに懸濁)。指示は、意図するオルガノイドの数に合わせて調整できます。目標は、通常、一次患者検体から約20〜30個のオルガノイドを形成することです。

  1. アイスバケットまたはコールドブロックに、lrECMと小さな遠心チューブを置きます。適量のlrECM(16 μL x X 目的のオルガノイド数)を小型遠沈管に入れます。
  2. ステップ2.5の適切な量の組織懸濁液(4 μL x 目的のオルガノイドの数)を氷上の遠沈管に追加します。
  3. 20 μLのlrECM/細胞懸濁液をパラフィルム型に慎重にピペットで移します。これにより、真珠のような液滴が形成されます。
    1. 必ずlrECM /細胞懸濁液の混合物を完全に混合してください。細胞はlrECM内に容易に定着する傾向があり、その結果、不均一なオルガノイドが得られます。
    2. lrECM /細胞懸濁液を氷上に保ちます。lrECMが温まると、重合してオルガノイド形成を損なう可能性があります。lrECM重合を防ぐために、2〜3個のオルガノイドごとにピペットチップを冷却してください。オルガノイドに気泡を入れないでください(ピペットを「二重に押す」ことは避けてください)。
  4. 所望の数のオルガノイドを10cm細胞培養プレート中のパラフィルム型上にピペットで移したら、プレート蓋で覆い、細胞培養インキュベーター内で37°C、5%CO2 中で1〜2時間インキュベートする。
  5. オルガノイドが固まったら、NBMc培地を使用してパラフィルムモールドから静かに洗い流し、合計20 mLのNBMcを含む新しい滅菌10 cm培養プレートに入れます。p1000チップを使用すると、オルガノイドを型から洗い流すのに最適です。彼らは穏やかに滑り落ちます。
    注:オルガノイドを型から細胞培養プレートに流すと、培地中に小さなピンク色の球体として見えるはずです。オルガノイドがメディアでバラバラになったり粉々になったりしたように見える場合、これはlrECMが重合したという以前の問題を示しており、オルガノイドはまだ成長する可能性がありますが、サイズが均一である可能性はほとんどありません。
  6. この10cm培養皿を37°Cの細胞培養インキュベーターに入れ、5%CO2 (振とうせずに)4日間行った。
    注:最初の数日間にオービタルシェーカーにオルガノイドを配置すると、オルガノイドがバラバラになる可能性があります。4日目まで揺れていないことを確認してください。
  7. 4日後、培地を交換し、37°C、5%CO2の細胞培養インキュベーター内で80RPMのオービタルシェーカーに入れます。
    1. 未成熟なオルガノイドとの培地交換は、可視化が難しいため困難です。細胞培養皿を傾け、少なくとも20秒間待ちます。オルガノイドは底部に沈殿し、ガラスまたはプラスチックの10〜20 mLピペットで上から培地をゆっくりと除去することができます。
    2. 下部のオルガノイドの収集に細心の注意を払ってください。彼らがメディア除去の力で動揺しているように見える場合は、一時停止して再定住させるのが最善です。オルガノイドが成熟し、視覚化しやすくなるにつれて、このプロセスは微妙な違いが少なくなります。
      注:細胞培養プレートの下に暗い紙を置くと、未熟なオルガノイドを視覚化するのに役立つ場合があります。真空吸引付きのパスツールピペットは、オルガノイドが吸い上げられて失われやすいため、培地を除去するために使用しないことをお勧めします。
    3. オルガノイドが最初に確立されたとき、それらは成熟したオルガノイドほど速く培地を消費しません。50%の培地交換から始めることで、不要な培地の使用を減らし、培地交換プロセス中に新しいオルガノイドを誤って損傷または吸引する可能性を減らします。

4.確立されたGBM球、接着性、またはオルガノイド培養からのオルガノイドの生成

注:ここでの目標は、比較実験で使用するためにサイズと細胞量が均一なオルガノイドを作成することであるため、単一細胞フィルターを使用して細胞をカウントし、これを確実にします。

  1. GBMスフェア培養液からの単一細胞懸濁液を調製する。
    注:GBM細胞のスフェア培養はNBMc培地で維持されます。
    1. 球体を15 mLの遠沈管に入れ、120 x g で5分間回転させます。
    2. 上清を除去し、2 mLのRT細胞剥離溶液を加えます。37°Cのインキュベーターに3分間入れます。
    3. 8 mLのNBMc培地を加えて、細胞剥離溶液を中和します。シングルセルストレーナー(70 μm)でひずみ、120 x gで5分間回転させます。
    4. チューブから上清を取り除き、残りの細胞を~1 mLのNBMcに再懸濁します。 細胞をカウントし(細胞不透過染色を使用)、手順4.4に進みます。
  2. GBM付着培養物からシングルセル懸濁液を調製する。
    1. 使用済みの培地をプレートから取り出し、2 mLのRT細胞剥離溶液をプレートに加え、37°Cのインキュベーターに3分間入れます。
    2. 細胞がプレートから剥離していることを顕微鏡で確認します。
    3. 8 mLのNBMc培地を加えて、細胞剥離液を中和します。シングルセルストレーナー(70 μm)でひずみます。
      注:接着培養を使用する場合、単一細胞のひずみはオプションです。
    4. 120 x gで5分間回転します。チューブから上清を取り除き、残りの細胞を~1 mLのNBMcに再懸濁します。 細胞をカウントし(細胞不透過染色を使用)、手順4.4に進みます。
  3. GBMオルガノイド培養からの単一細胞懸濁液を調製する。
    1. カットしたp1000ピペットチップを使用してオルガノイドを10 cm培養プレートに移し、できるだけ多くの残留培地を慎重に除去します。
    2. 2つの滅菌カミソリを使用して、オルガノイドを細かく細かく刻みます。カットしたp1000チップで、ミンチオルガノイドを15 mLの遠沈管に移し、~2-3 mLのNBMc培地を加えます。
    3. 120 x g で3分間回転し、上清を取り除きます(この部分には真空吸引ではなくピペットチップを使用することをお勧めします)。
    4. 2 mLのコールドセル剥離溶液を10分間加えます。
      注:細胞剥離溶液は、最初に加温するのではなく、4°Cから直接使用する必要があります。これは、残っているマトリゲルを柔らかくし、細胞の回復を助けるようです。
    5. その後、37°Cのインキュベーターに10〜20分間移動し、数分ごとに観察および混合します。細胞溶解を示す可能性のある凝集が現れた場合は、すぐに次のステップに進みます。
    6. 8 mLのNBMc培地を加えて、細胞剥離液を希釈します。シングルセルストレーナー(70 μm)で濾し、120 x gで5分間回転させます。
    7. チューブから上清を取り除き、残りの細胞を~1 mLのNBMcに再懸濁します。 細胞をカウントし(細胞不透過性染色を使用して)、ステップ4.4に進みます。
  4. 単一細胞懸濁液からのオルガノイド作製
    1. アイスバケットまたはコールドブロックに、lrECMと小さな遠心チューブを置きます。適量のlrECM(16 μL x X 目的のオルガノイド数)を小型遠沈管に入れます。
    2. 20,000個の細胞/オルガノイドを含む総容量(4 μL x X個の目的のオルガノイド)の細胞の混合物を作成し、これを氷上でlrECMを使用して小型遠心チューブに追加します。
    3. 20 μLのlrECM/細胞懸濁液をパラフィルム型に慎重にピペットで移します。これにより、真珠のような液滴が形成されます。
      1. 細胞はlrECM内に容易に沈降する傾向があり、これにより不均一なオルガノイドが生じるため、lrECM/細胞懸濁液混合物を完全に混合するようにしてください。
      2. lrECM /細胞懸濁液を氷上に保ちます。lrECMが温まると、重合してオルガノイド形成を損なう可能性があります。
      3. lrECM重合を防ぐために、2〜3個のオルガノイドごとにピペットチップを冷却してください。オルガノイドに気泡を入れないでください(ピペットチップを「ダブルプッシュ」しないでください)。
    4. 所望の数のオルガノイドを10cm培養プレート内のパラフィルム型上にピペットで移したら、細胞培養インキュベーター内で37°Cで1〜2時間インキュベートする。
    5. オルガノイドが固まったら、NBMc培地を使用してパラフィルムモールドから静かに洗い流し、合計20 mLのNBMcを含む新しい滅菌10 cm培養プレートに入れます。p1000チップを使用すると、オルガノイドを型から洗い流すのに最適です。彼らは穏やかに滑り落ちます。
      注:10 cmの培養皿あたり約15〜20個のオルガノイドが推奨されます。
    6. 10 cmの培養皿をインキュベーターに(振とうせずに)4日間入れます。
    7. 4日後、培地を交換し、細胞培養インキュベーター内の80 RPMのオービタルシェーカーに置きます。その後、2〜3日ごとにメディアを交換します。
      1. 未成熟なオルガノイドとの培地交換は、可視化が難しいため困難です。細胞培養皿を傾け、少なくとも20秒間待ちます。オルガノイドは底部に落ち着き、大きな開口部のガラスピペットで上から培地をゆっくりと取り除くことができます。
      2. 下部のオルガノイドの収集に細心の注意を払ってください。彼らがメディア除去の力で動揺しているように見える場合は、一時停止して、彼らが再定住するのを待ちます。オルガノイドが成熟し、視覚化しやすくなるにつれて、このプロセスは微妙な違いが少なくなります。
        注:細胞培養プレートの下に暗い紙を置くと、未熟なオルガノイドを視覚化するのに役立つ場合があります。真空吸引付きのパスツールピペットを使用してメディアを除去すると、オルガノイドが吸い上げられて失われやすくなります。
      3. オルガノイドが最初に確立されたとき、それらは成熟したオルガノイドほど速く培地を消費しません。50%の培地交換から始めて、不要な培地の使用を減らし、培地交換プロセス中に新しいオルガノイドを誤って損傷または吸引する可能性を減らします。

5. クライオム埋め込み

  1. 各オルガノイドを、1 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を含む個々の1.5 mLチューブ(カットp1000チップを使用)に入れます。オルガノイドを4°Cで一晩保存します。 オルガノイドをパラフィンに埋め込む場合は、セクション6に進みます。
  2. 4%PFAで一晩固定した後、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でオルガノイドを3回洗浄します。
  3. オルガノイドを、1 mLの30%スクロースを水に含む新しい1.5 mLチューブ(カットp1000ピペットチップを使用)に移し、4°Cで一晩保存します。
  4. 少量(通常は1〜2 mL)の最適な切断温度コンパウンド(OCT)をクライオモールドに追加し、底部を覆い、金型の深さの約1/3〜1/2を満たします。
  5. カットp1000ピペットチップを使用して、単一のオルガノイドをクライオモールドに移します。これにより、一部の培地がオルガノイドとともに転写されますが、これは避けられません。小さいピペットチップを使用して、オルガノイドを乱すことなく周囲の培地を慎重に除去します。
    注:これは視覚化するのが難しい場合がありますが、遅いピペッティングではメディアとOCTの密度に明確な違いが見られるため、これはある程度「感触によって」行われます)。
  6. クライオモルドをドライアイスのトレイに置きます。OCTはフリーズを開始し、その過程で不透明になります。
  7. OCTを追加してオルガノイドを完全に覆い、残りの体積のクライオモールドを満たします。ブロックは、数日間の短期保管の場合は-20°Cで、無期限の長期保存の場合は-80°Cで保存できます。

6.パラフィン包埋

  1. オルガノイドをサイズで並べ替えます(小さなオルガノイドは3 mm未満、大きなオルガノイドは3 mm以上)。カットしたp1000ピペットチップを使用して各オルガノイドを組織学的カセットに移し、表 2 または 表3に従ってパラフィンワックスに加工する。
    注:組織学カセットのサイズ/構成はユーザー次第です。
  2. オルガノイドをカセットから埋め込み型に移し、1〜2 mLの溶かしたパラフィンワックスを入れ、ワックスが半固体になるまで冷やします。
  3. ワックスが部分的に固まったら、金型の上部にワックスを追加します。ラベルの付いたカセットトップを金型の上に置き、これをコールドプレートに移します。ワックスが完全に固まるまで冷却を続けます。
  4. ワックスが固まったら、ミクロトームを使用してブロックを切断します。または、後で切片化するためにRTまたは4°Cで保存してください。

7.免疫蛍光法(IF)

  1. 以下の手順に従って、スライド染色皿を用いて5〜12μmパラフィン包埋組織切片を脱パラフィンおよび再水和する。
    注:OCT包埋オルガノイドの切片を使用する場合は、12 μm切片の使用をお勧めします。スライドをPBSで30分間振ってOCTを取り外します。手順 7.2 に進みます。
    1. キシレン中で5分間インキュベートします。これをさらに2回繰り返します。その後、100%エタノール中で10分間インキュベートします。これをもう一度繰り返します。
    2. 95%エタノール中で10分間インキュベートします。もう一度繰り返します。切片を蒸留水で5分間、2回洗浄します。
  2. 抗原のマスク解除には、スライドを1xクエン酸塩アンマスキング溶液(材料表)に沈め、沸点以下の温度で10分間電子レンジで加熱します。溶液を沸騰させないように注意してください。
    注意: これは、沸騰が発生するまで最初に~2分間電子レンジで加熱し、次に電力を下げて、溶液が沸騰しないように監視する場合に最もよく達成されます。好ましいマスキング解除温度は100°Cをわずかに下回り、理想的には98°Cです。
  3. スライドを30xクエン酸塩マスキング解除溶液のRTで1分間冷却します。
    注:これは同じ1xクエン酸塩溶液です。このステップでソリューションを交換する必要はありません。
  4. スライドを蒸留水で5分間、2回洗います。
  5. スライドを1x TBST(0.1%トゥイーン20を含むトリス緩衝生理食塩水)バッファーで5分間洗浄します。
  6. TBSTからスライドを取り出し、組織切片を乾燥させないように注意しながら、実験室のクリーニングワイプを使用して組織切片の周りを注意深く乾かします。スライドが十分に乾いたら、疎水性バリアペンで組織切片を一周します。
  7. 各切片を100〜400 μLの10%血清ブロッキング溶液でRTで1時間ブロックします。 二次抗体に基づいて血清ブロッキング溶液を選択します。たとえば、ロバで作られた二次抗体を使用する場合は、1x TBSTで10%の正常ロバ血清を使用します。
  8. ブロッキング溶液を除去し、ブロッキング溶液に所望の濃度に希釈した100〜400μLの一次抗体を加える。
  9. 4°Cで、切片を一次抗体と共に一晩インキュベートします。
  10. 一次抗体溶液を取り出し、スライドを1x TBSTで5分間、3回洗浄します。
  11. 100〜400 μLの二次抗体(ブロッキング溶液で1:1000希釈、または製造元の指示に従って)を各セクションに加え、RTで1.5時間インキュベートします。
  12. スライドをTBST1回で5分間、2回洗浄します。次に、スライドを1x PBSで5分間洗浄します。
  13. PBSからスライドを取り出し、実験室のクリーニングワイプを使用して組織切片の周りを乾燥させます。液体硬化封入剤を数滴加え、ガラスカバーガラスを慎重に取り付けます。スライドが乾いたら、イメージングの準備ができるまで、光から保護された-20°Cで保管します。

8. 免疫組織化学

  1. 以下の手順に従って、スライド染色皿を用いてパラフィン包埋組織切片を脱パラフィンおよび再水和する。
    注:OCT包埋オルガノイドの切片を使用する場合は、スライドをPBSで30分間振ってOCTを除去します。手順 8.2 に進みます。
    1. キシレン中で5分間インキュベートします。さらに2回繰り返します。
    2. 100%エタノール中で10分間インキュベートします。もう一度繰り返します。
    3. 95%エタノール中で10分間インキュベートします。もう一度繰り返します。
    4. セクションを蒸留水で5分間、2回洗浄します。
  2. 抗原アンマスキングの場合は、スライドを1xクエン酸塩アンマスキング溶液に沈め、マイクロ波でサブボリング温度で10分間加熱します。溶液を沸騰させないように注意してください。
  3. 1xクエン酸塩マスキング解除溶液のRTで30分間スライドを冷まします。
  4. スライドを蒸留水で5分間3回洗います。
  5. スライドを3%過酸化水素中で10分間インキュベートします。
  6. スライドを蒸留水で5分間2回洗います。
  7. スライドを1x TBSTで5分間洗浄します。
  8. 1x TBSTからスライドを取り外し、実験室のクリーニングワイプの角を使用して、組織切片の周りを注意深く乾かします。
  9. スライドが乾いたら、疎水性バリアペンで組織切片を一周します。
  10. 100〜400 μLのブロッキング溶液を、疎水性バリアペンサークル内の各セクションにRTで1時間置きます。10%正常ロバ血清(NDS)または0.75%ウシ血清アルブミン(BSA)のいずれかを1x TBSTで希釈して使用します。
  11. 次に、ブロッキング溶液を除去し、各切片に100〜400μLの一次抗体を追加します。この一次抗体を適切なメーカーの希釈液を使用して所望の濃度に希釈します。
  12. 切片を4°Cで一晩インキュベートします。一次抗体溶液を取り出し、スライドを1x TBSTで5分間、3回洗浄します。
  13. 各切片に100〜400 μLのIHC検出試薬を加え、RTで1時間インキュベートします。 一次抗体に応じてIHC検出試薬を選択してください。
  14. 各セクションを1x TBSTで5分間、2回洗浄し、続いて1x PBSで5分間1回洗浄します。
  15. 製造元の指示に従って3,3-ジアミノベンジジン(DAB)溶液を調製します。各組織切片に100〜400μLのDAB溶液を加え、顕微鏡下で綿密にモニターします。1〜10分で許容できる染色強度が得られます。この時間をメモし、すべての組織切片で一貫性を保ってください。
  16. 希望の染色強度に達したら、スライドを蒸留水に浸します。
  17. 表4の指示に従って、ヘマトキシリン対比染色とスライド脱水を行い、取り付けます。
  18. キシレン代替品(材料表)からスライドを取り外し、実験室のクリーニングワイプを使用して組織セクションの周りの余分な液体を拭き取ります。少量の永久封入剤を使用して、ティッシュセクションにカバーガラスを取り付け、乾燥させます。

9.全細胞生存率の測定

  1. 各オルガノイドを2 mLチューブに移し、小さなピペットチップを使用して、オルガノイドの周囲の余分な培地をすべて慎重に取り除きます(この手順の概略図については 図3 を参照してください)。
    注:細胞生存率アッセイは、同じ数の細胞で作成されたオルガノイドを使用して実行する必要があります。この実験は、手術を受けた患者の検体から直接作られたオルガノイド、alredyで形成されたオルガノイドの切断、または単一細胞がろ過およびカウントされなかったその他の場合には実行しないでください。
  2. 発光細胞生存率アッセイ試薬と1x PBSを1:1の比率で調製し、各チューブに500 μLを加えます。
  3. p1000ピペットチップを使用して積極的に上下にピペットし、オルガノイドを分解し、5分間放置します。オルガノイドはやや解離し、柔らかくなっているはずです。P1000ピペットチップとの混合をもう一度繰り返します。
  4. 目標は、96ウェルプレートのウェルあたり100 μLの総容量を持つことです。ステップ9.3から25 μLの混合物を追加し(複数のテクニカルレプリケートに十分です)、残りの発光細胞生存率アッセイとPBS混合物75 μLを追加します。
  5. プレートをシェーカーに2分間置き、RTで20分間インキュベートします。
  6. プレートリーダーの発光設定を使用してプレートを読み取り、データを収集します ( 図4を参照)。

結果

図1 は、光学顕微鏡で10倍の倍率で見た初期のオルガノイド成長を示しています。 図1A は、中央図にlrECMを介した単一細胞の遊走および浸潤を示す。細胞は拡大し続け、lrECMに「コロニー形成」し、目視検査ではより密度が高く、最終的には不透明に見えます。 図1B は、ダイムのサイズに対して、倍率なしでいくつかの成熟オルガノイド(7週間)を示しています。

図2 は、活性増殖のマーカーであるホスホヒストンH3に対するGBMオルガノイドの免疫組織化学的染色を示しています。ほとんどの高度に増殖する細胞は、オルガノイドコアと比較してオルガノイド周囲に見られます。陽性染色は茶色/銅の外観になります。

図3 は、3D特異的発光細胞生存率アッセイを用いてGBMオルガノイド中の総細胞数を均質化し測定するプロセスを説明する。GBMオルガノイドには細胞数が多いため、発光アッセイ試薬で粉砕することにより、より大きなオルガノイド構造が最初に均質化されます。次に、オルガノイドライセート全体の画分を個々のウェルにロードし、追加の発光アッセイ試薬で希釈してから、インキュベーションを行い、適切なマルチウェルプレートリーダーで読み取ります。

図4 は、オルガノイドのDMSO(共通ビヒクル)制御データを表しています。プロットされたデータは、オルガノイド内およびオルガノイド間の一貫性を示しています。発光生存率データは通常、実験データを生成する際に各標本の対照に対して正規化されます。

figure-results-1
図1:光学顕微鏡による観察(10倍)。 (A)ラミニンリッチ細胞外マトリックス全体でGBM細胞の遊走/浸潤を示す初期のオルガノイド増殖。(B)ダイムのサイズに対する成熟したオルガノイド。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:GBMオルガノイドの免疫組織化学 。 (A、 B)活性化増殖のためのホスホヒストンH3染色細胞を示すGBMオルガノイド。スケールバーは、AとBでそれぞれ600μmと300μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:オルガノイドの発光細胞生存率プロトコル 。 (A)個々のオルガノイドを小さな遠沈管に移し、余分な培地を取り除きます。(B)500 μLの1:1 PBSおよび発光細胞生存率アッセイ混合物を各チューブとピペットに積極的に添加して、オルガノイドを分解します。(C)このオルガノイド混合物25 μLと、同じ1:1 PBSおよび発光細胞生存率アッセイ混合物75 μLを96ウェルプレートの各ウェルに加えます。(D)シェーカーに2分間置き、続いてRTで20分間インキュベートした後、プレートリーダーで発光を読み取ります。BioRender.com を使用して作られた図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図4:細胞生存率。 4つの患者検体に対する4つのオルガノイドの6つの技術的複製について、0.1%ジメチルスルホキシド(DMSO)中のオルガノイドの細胞生存率データ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

コンポーネント量
神経基礎培地マイナスフェノールレッド500ミリリットル
B-27サプリメントマイナスビタミンA(50倍)10ミリリットル
抗生物質 - 抗真菌薬(100x)5ミリリットル
ピルビン酸ナトリウム (100 mM)5ミリリットル
0.85%NaCl(200 mM)中のグルタミン5ミリリットル
組換えヒトFGF塩基性(250 μg/mL)20 μL
組換えヒトEFGタンパク質(250 μg/mL)20 μL
フェノールレッド500 μL

表1:神経基礎培地完全(NBMc)製剤

試薬時間
50%エタノール3 ミン
75%エタノール3 ミン
95%エタノール3 ミン
95%エタノール4 ミン
100%エタノール2 ミン
100%エタノール3 ミン
100%エタノール4 ミン
キシレン代替物2 ミン
キシレン代替物3 ミン
キシレン代替物4 ミン
パラフィンワックス15分
パラフィンワックス15分

表2:小型オルガノイド(直径3 mm未満)の処理スケジュール

試薬時間
50%エタノール6 ミン
75%エタノール6 ミン
95%エタノール5 ミン
95%エタノール8 ミン
100%エタノール5 ミン
100%エタノール5 ミン
100%エタノール8 ミン
キシレン代替物5 ミン
キシレン代替物5 ミン
キシレン代替物8 ミン
パラフィンワックス30分
パラフィンワックス30分

表3:大型オルガノイド(直径3mm以上)の処理スケジュール

試薬時間
ヘマトキシリン2 ミン
ランニング diH2O2 ミン
核ヘマトキシリン清澄化試薬1 ミン
ランニング diH2O1 ミン
ブルーイング試薬1 ミン
ランニング diH2O2 ミン
70%エタノール1 ミン
100%エタノール1 ミン
100%エタノール1 ミン
キシレン代替物2 ミン
キシレン代替物2 ミン

表4:ヘマトキシリン対比染色

ディスカッション

GBMオルガノイドは、細胞および微小環境の不均一性が大きい従来のスフェアを補完する培養方法です4,22,30。より多くの時間とリソースを大量に消費しますが、オルガノイド培養は、腫瘍内挙動と薬剤耐性のメカニズムに関する貴重な洞察を提供することができます。

GBMはCSCの集団によって推進されています5,31、そしてこれらの方法はこのCSC集団の継続的な成長と自己複製を可能にするために開発されました。上皮成長因子(EGF)および線維芽細胞増殖因子(FGF)は、幹細胞の維持および増殖を促進し、活性受容体チロシンキナーゼ(RTK)シグナル伝達を提供することが知られている。GBM腫瘍内の不均一な細胞集団および明確な腫瘍微小環境の形成は、CSC挙動のサポートに依存している。lrECMの選択は、ラミニンが豊富な脳環境を模倣し、オルガノイド培養中の細胞が自己組織化し、浸潤によって移動することをサポートします。一部のグループは、lrECMまたはEGF/FGF濃縮培地を使用せずにオルガノイド培養を確立していますが24,28、これは、この培養方法のより時間効率の良い方法と、増殖を促進する発癌性シグナル伝達のより強力な選択を提供する可能性がありますが、これらの方法は、オルガノイドの細胞不均一性を最もよく確立するためにプロ幹細胞環境を最適化するために選択されました。脳オルガノイドおよびGBMオルガノイドの両方が、以前の文献21、32、33においてlrECMを用いて作製されている。オルガノイド内に見られる腫瘍集団と空間的変動に関するデータは確立されていますが、オルガノイド内の非腫瘍集団と、それらが元の患者標本からどのくらいの期間生存するかについてはあまり知られていません。特定のIHC染色(CD45など)がこのデータを提供する可能性があり、オルガノイドを用いた将来の興味深い研究ポイントになる可能性があります。

オルガノイド培養の用途を知ることは、適切な方法を選択するために重要です。一次標本からオルガノイドを確立する方法と、特定の実験のために均一なオルガノイドを成長させるには、手順がわずかに異なります。オルガノイドがどのように成熟し、lrECM足場を視覚的に満たすかを理解することは、オルガノイド培養に適切な時間とリソースを割り当てることができるようにするために重要です。オルガノイド内の細胞のまばらな領域は、ゆっくりと拡大し、lrECMを満たすために成長し、標本の挙動に応じて2〜8週間かかる場合があります。この成長率は、各標本にいくらか固有のものです。オルガノイドの異なるバッチにわたって保存され、球の成長の相対速度とほぼ一致しています。オルガノイドは1年以上維持でき、マウスへの異種移植片で腫瘍形成能力を保持します。ただし、ラボのリソース(材料と時間の両方)を無駄にしないように、明確な目的でそれらを成長させることをお勧めします4。オルガノイド増殖は、複数のウェルサイズおよびフォーマットで試験されており、最適な細胞生存率を維持するには10cmプレートが理想的な設定であり、続いてウェルあたり3つのオルガノイドを含む6ウェルプレートが続くことが示されています34。オルガノイドは、2次元培養のオルガノイドと比較してより多くの培地を消費し、より小さなウェルフォーマットを使用しても適切なメンテナンスにつながりません。例えば、96ウェルフォーマットプレートの1ウェルには、オルガノイドの成長を維持するのに十分なスペースまたは培地容量がありません。

オルガノイドが確立するにつれて、観察することは成功を高めるために重要です。最初は、オルガノイドはゆっくりと培地を消費しますが、密度が高く成熟するにつれて、培地をより早く消費します。フェノールレッドをメディアに追加すると、メディア消費量の指標として役立ちます。培地が黄色くなると、大量の培地を交換する、プレート内の総培地量を増やす、オルガノイドを複数の細胞培養プレートに分割して成長に追いつく、実験のタイムラインを調整するなど、給餌パターンを調整するように促される場合があります。

多くの点で、オルガノイドは癌研究を行うための非効率的な方法です。それらは長い時間スケールを含み、GBM球培養と比較して高価で資源が重い。しかし、細胞および微小環境の多様性を再現するための代替方法である患者由来の異種移植片と比較して、それらはより単純で、より安価で、制御可能です。オルガノイドをいつ最適に使用するかの選択は、がん研究者にとって重要です。それらは、伝統的な領域や付着文化を置き換えることを意図したものではなく、異種移植片モデルを置き換えることを意図したものではありません。オルガノイドは、適切な科学的問題に適用すると、これら両方のシステムの利点を組み合わせることができ、そうでなければ隠されたままになる腫瘍細胞生物学を観察することができます。科学界は、オルガノイドがどのような学習機会を提供するかを理解し始めたばかりですが、GBMの複雑な生物学を理解するための将来、オルガノイドが非常に貴重なツールになることは明らかです。

開示事項

著者は開示する矛盾はありません。

謝辞

ジャスティン・ラティア博士の貴重なアドバイスと継続的なサポートに感謝します。また、カトリーナ・ファイフ、リサ・ウォレス、マヤ・カムヒの優れた技術サポートにも感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3,3-ジアミノベンジジン(DAB)錠MP Biomedicals 089806813,3-ジアミノベンジジン(DAB)錠
96ウェルPCRプレートサーモフィッシャーサイエンティフィック96ウェルPCRプレート
アキュターゼサーモフィッシャーサイエンティフィックSCR005細胞剥離液
抗生物質-抗真菌剤サーモフィッシャーサイエンティフィック15240062抗生物質-抗真菌剤
B-27 サプリメント マイナスビタミン Aサーモフィッシャー サイエンティフィック12587001B-27 サプリメント マイナス ビタミン A (50x)
GelCode Blue Stain 試薬サーモフィッシャー サイエンティフィック24590ブルーイング試薬
セル ストレーナー (70 & micro;m)CellTreat Scientific229483セルストレーナー (70 & micro;m)
CellTiter-Glo 3DPromegaG9681発光細胞生存率アッセイ
Clarifier 2ThermoFisher Scientific7301核ヘマトキシリン清澄化試薬
Clear-Rite 3ThermoFisher Scientific6901キシレン代替品
Epredia Gill 2 ヘマトキシリンThermoFisher Scientific72504ヘマトキシリン
タミン0.85% NaClThermoFisher Scientific350500610.85% NaCl (200 mM) 中のグルタミン
MatrigelThermoFisher Scientific354234ラミニンが豊富な細胞外マトリックス
Mini PAP ペンThermoFisher Scientific008877疎水性バリアペン
封入剤ThermoFisher Scientific22-050-102封入剤
神経基礎培地マイナスフェノールレッドThermoFisher Scientific12349015Neurobasal 培地マイナスフェノールレッド (500 mL)
正常ロバ血清 (NDS)Jackson ImmunoResearch017-000-121正常ロバ血清 (NDS)
パラホルムアルデヒド 4% PBSサーモフィッシャーサイエンティフィックAAJ19943K2パラホルムアルデヒド 4% PBS
フェノールレッドSigmaP0290フェノールレッド (0.5%)
ProLong Gold 退色防止封入剤 with DAPIサーモフィッシャーサイエンティフィックP10144液体硬化型封入剤
組換えヒト EGF タンパク質R&Dシステム236-EG-01M組換えヒトEGFタンパク質(250µg/mL)
組換えヒトFGF基本R&Dシステム4144-TC-01組換えヒトFGF基本(250µg/mL)
SignalStain 抗体希釈液細胞シグナル伝達8112抗体希釈液
SignalStain Boost IHC 検出試薬細胞シグナル伝達8114免疫組織化学検出試薬
SignalStain クエン酸アンマスキング溶液細胞シグナル伝達14746クエン酸剥離液
シングルエッジカミソリ刃UlineH-595Bシングルエッジかみそりの刃
ピルビン酸ナトリウムサーモフィッシャーサイエンティフィック11360070ピルビン酸ナトリウム (100 mM)
Tissue-Tek クライオモールドVWR25608-916使い捨てクライオモールド
Tissue-Tek O.C.T. コンパウンドVWR25608-930最適な切断温度コンパウンド
トリパンブルーステインサーモフィッシャーサイエンティフィックT10282細胞不透過性ステイン (0.4%)
キシレンサーモフィッシャーサイエンティフィックX3P-1GALキシレン
グル

参考文献

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三次元オルガノイド 培養を用いたヒト 膠芽腫細胞の多様性の維持
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