哺乳類の脳の興奮性シナプスでは、シナプス前放出されたグルタミン酸は、シナプス後膜に埋め込まれた受容体を活性化します1,2。これらのシナプス接続の強さは、経験依存の可塑性を受け取り、多様な形態の学習と記憶を可能にする特性を経験します3,4,5,6,7,8,9。シナプスの数とそのシグナル伝達特性の病理学的変化は、多くの神経障害および精神障害で示される回路活動と情報処理の変化につながります10、11、12。そのため、神経接続とシナプス接続の強さを支配する根底にあるメカニズムを理解することが非常に重要です。
興奮性シナプスは、樹状突起棘、足場タンパク質、受容体、シグナル伝達因子、細胞骨格タンパク質、および輸送細胞小器官を含む小さなシナプス後突起に形成されます1,2,13,14,15,16。これらのミクロンサイズのシグナル伝達コンパートメントは、シナプスごとにシナプス強度を制御することを可能にする13,16。樹状突起の脊椎の形態は、ニューロンの樹状突起の長さに沿って変化し、脊椎の形状は通常、細い、糸状の、ずんぐりした、キノコ状、または分岐した13として説明されます。重要なのは、脊椎の形状がシナプス機能および安定性と相関していることです。たとえば、棘が大きいほど受容体の数が増加し、シナプスの強度が大きくなります16,17,18。細い棘とは異なり、大きな棘はin vivoで数か月間持続することができ、安定したシナプス接続と長期記憶の保存を可能にする可能性のある特性19,20。
樹状突起に沿った脊椎の形態と密度は、正常状態と疾患状態の両方で、特定の脳領域内の神経接続の程度と興奮性シナプスの特性を調査するために一般的に追跡されます13。標準的な光学顕微鏡および蛍光顕微鏡、ならびに超解像および電子顕微鏡(EM)21を使用して、さまざまな組織調製およびモデルシステムにおける脊椎形態を視覚化するために、さまざまな方法が開発されています。これらの強力なイメージング技術は、脳の組織、機能、および疾患に関する現在の理解に多大な洞察を提供してくれました。このメソッドコレクションには、樹状突起と棘の形態学的複雑さを監視するための重要なイメージング技術と、樹状突起と単一棘の神経活動を活性化および測定するための光遺伝学的ツールが含まれています。
Pekarekら22 は、無傷の神経組織の奥深くにあるニューロン樹状突起の構造を画像化および定量化するための比較的迅速でハイスループットのプロトコルを提示しています。著者らは、脳組織から脂質を除去し、その後のイメージング中の光散乱を最小限に抑えるのに役立つ組織透明化技術である C lear Lipid交換 Aクリルアミドハイブリ ダイズRigid Iマジング/免疫染色/in situ ハイブリダイゼーション対応 Tissue-hYdrogel(CLARITY)を実行します23.クリア後、蛍光タンパク質を発現するニューロンのZスタックを共焦点顕微鏡または二光子顕微鏡で収集しました。画像解析と自動定量化により、脊椎の密度と形状、樹状突起の木の複雑さを正確に測定できるようになりました。このプロトコルにより、単一の棘から樹状突起の木に至るまでの構造の同時イメージングが可能になり、時間がかかり、潜在的に損傷を与える薄い断面切断のステップが不要になります。この手法は、目的の遺伝子の導入または除去後の無傷の脳組織における脊椎の形態と樹状突起の複雑さの変化を定量化しようとしている研究者にとって非常に役立ちます。
100 年以上前に開発された24 ゴルジ染色は、神経系の組織と神経細胞の形態を視覚化するための強力なツールであり続けています。この方法では、ニューロンのまばらな集団がクロム酸銀の微結晶化によって染色され、軸索、樹状突起の木、および棘の視覚化が可能になります25。Frankfurt and Bowman26 は、ラット海馬と内側前頭前野のニューロンと樹状突起棘を視覚化するための迅速なゴルジ含浸プロトコルを詳述しています。著者らは、その後の光学顕微鏡検査のために組織を準備、染色、画像化する方法、および樹状突起の木に沿った脊椎密度を定量化する方法を実証しています。ここで説明するプロトコルは、ニューロンの一一貫した信頼性の高い含浸をもたらし、有毒化学物質への曝露を減らします。
光学顕微鏡と蛍光顕微鏡は樹状突起と棘のイメージングに適していますが、EMはシナプス前およびシナプス後構造のナノメートル解像度の視覚化を可能にします21。EMアプローチは通常、シナプス後密度の寸法、シナプス小胞の数とサイズなど、シナプスの超微細構造特性を測定するために使用されます21。このコレクションでは、Śliwińska et al.27 は、海馬マウス組織28,29 の Serial Bロックフェース スキャン Electron Microscopy (SBEM) によって 3 次元 (3D) EM 画像を取得するプロトコルを提供します。具体的には、サンプルの調製方法、樹脂への組織埋め込み、サンプルのマウントとトリミング、SBEM の実行方法、画像の解析による 3D 再構成の生成方法について説明します。このプロトコルは、明確に定義された膜を持つ高コントラスト画像を生成し、さまざまな組織タイプに適応させることができます。
神経系の発達中に、シナプス接続が形成され、神経活動によって洗練されるにつれて、ニューロンは劇的な形態学的変化を起こします30,31。発達中の小脳におけるニューロンの成熟を追跡するために、Chan et al.32 は、発達中の顆粒ニューロンの生後 in vivo エレクトロポレーションのためのプロトコルを提供します。ここで、研究者らは、出生後のマウスの子犬の後脳にDNAを注入してエレクトロポレーションし、まばらなニューロン集団に蛍光タンパク質をトランスフェクションしました。高解像度共焦点顕微鏡と3Dイメージングにより、研究者は出生後の発達のいくつかの段階にわたって樹状突起と樹状突起の爪の形態を特徴付けることができました。重要なことに、このアプローチは、顆粒細胞の成熟と機能に影響を与える可能性のある遺伝子の挿入または除去を可能にする可能性があり、小脳の発達と顆粒ニューロンの成熟を研究する研究者にとって大きな関心を集めるでしょう。
最後に、Cuentas-CondoriとMiller33 によるプロトコルは、超解像イメージング34、光遺伝学35、およびカルシウムダイナミクス36 の生細胞イメージングを採用して、線 虫のGABA作動性ニューロンの活性を研究します。超解像イメージング用に装備された共焦点顕微鏡37を使用して、著者らは樹状突起で蛍光タンパク質を発現させ、さまざまな脊椎形状の周波数を測定します。さらに、著者らは、シナプス前での光遺伝学的タンパク質の発現とシナプス後のカルシウム指標の発現によって神経機能を評価しています。末端の光の活性化に続いて、個々の樹状突起棘内でカルシウム過渡現象が観察されました。これらのプロトコルは、最近の発見38 とともに、脊椎の形態とシナプス活動を追跡するための強力なモデル システムとしての C. elegans のエキサイティングな使用を強調しています。
まとめると、このメソッドコレクションで説明されているプロトコルは、神経構造と機能21を視覚化するために利用可能なすでに豊富なツールボックスに追加されます。将来の研究でこれらの方法を実装することで、学習関連のシナプス可塑性を促進するプロセスと、疾患状態の根底にある細胞メカニズムについてのさらなる洞察が得られる可能性があります。