Method Article

ハイドロゲルアレイにより、3D腫瘍モデルにおけるマトリックス成分および治療薬の効果をスクリーニングするためのスループットの向上が可能

DOI:

10.3791/63791

⸱

June 16th, 2022

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1University of California Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本プロトコールは、調整可能な機械的特徴を有するヒドロゲルのハイスループット光架橋を容易にするカスタムメイドのUV照明装置を使用して、3Dマトリックス模倣培養における患者由来の膠芽腫細胞の化学療法応答に対する機械的および生化学的手がかりの効果を評価するための実験プラットフォームを記載する。

Abstract

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細胞-マトリックス相互作用は、生化学的、機械的、幾何学的手がかりを通じて複雑な生理学的プロセスを媒介し、病理学的変化および治療応答に影響を与える。医薬品開発パイプラインの早い段階でマトリックス効果を考慮することで、新規治療薬の臨床的成功の可能性が高まると予想されます。3D細胞培養における特定の組織微小環境を再現する生体材料ベースの戦略が存在するが、これらを主に薬物スクリーニングに使用される2D培養方法と統合することは困難であった。したがって、ここで提示されたプロトコルは、既存の薬物スクリーニングパイプラインおよび細胞生存率のための従来のアッセイとの統合を容易にするために、マルチウェルプレートフォーマットの小型化された生体材料マトリックス内で3D培養のための方法の開発を詳述する。培養細胞における臨床的に関連する表現型を保存するために重要なマトリックス特徴は、高度に組織特異的および疾患特異的であると予想されるため、マトリックスパラメータの組み合わせスクリーニングは、特定の用途に適した条件を特定するために必要であろう。ここで説明する方法は、微細化された培養フォーマットを使用して、マトリックス力学およびリガンド提示の直交変動に対する癌細胞応答を評価する。具体的には、この研究は、化学療法に対する患者由来の膠芽腫(GBM)細胞の応答に対するマトリックスパラメータの効果を調査するために、このプラットフォームを使用することを実証する。

Introduction

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新薬開発の予想コストは過去10年間で着実に上昇しており、現在の見積もりでは10億ドルを超えています1。この費用の一部は、臨床試験に入る薬の高い失敗率です。医薬品候補の約12%が、最終的に2019年に米国食品医薬品局(FDA)から承認を得ています。多くの薬剤は、予期せぬ毒性2のために第I相で失敗しますが、安全性試験に合格した他の薬剤は有効性の欠如3のために失敗する可能性があります。非有効性によるこの消耗は、医薬品開発中に使用される癌モデルが臨床的有効性の予測がないことで悪名高いという事実によって部分的に説明することができる4。

インビトロモデルとインビボモデルとの間の機能的差異は、非腫瘍細胞および物理的ECMを含むそれらの天然微小環境から癌細胞を除去することに起因し得る5,6。一般に、研究グループは、マトリゲル(マウス肉腫に由来するタンパク質性基底膜マトリックス)などの市販の培養マトリックスを使用して、培養腫瘍細胞に3Dマトリックス微小環境を提供する。2D培養と比較して、膜マトリックス中の3D培養は、in vitro結果....

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Protocol

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患者由来のGBM細胞株(GS122およびGS304)は、UCLA治験審査委員会(IRB#10-000655)によって承認されたプロトコルの下でこれらの株を開発したDavid Nathanson教授(私たちの共同研究者)によって提供されました。細胞株を個々の患者に再び連結することができないように、細胞を非同定して提供した。

ヒドロゲル溶液の調製

  1. HEPES粉末をハンクス平衡塩溶液(HBSS)に20mMで溶解して、HEPES緩衝溶液を調製する。完全な溶媒和後にpHを7に調整します。
  2. HEPES 緩衝溶液に、前の報告31 に従って調製したチオール化 HA (700 kDa 公称分子量、材料表を参照) を溶解し、各グルクロン酸上のカルボン酸残基の 6% ~ 8% がチオールで修飾されるように、緩衝液に 10 mg/mL の濃度で溶解します。
    注:周囲光によるチオール酸化を防ぐために、琥珀色のバイアルをお勧めします。
    1. マグネチックスターリングプレート(<1,000rpm)を用いて、完全に溶解するまで室温で、典型的には約45分間撹拌する。
  3. HAが溶解している間に、(1)100mg/mLの8-アーム-PEG-ノルボルネン(20kDa)、(2)100mg/mLの4-アーム....

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Results

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AFM測定では、カスタムメイドのArduino制御LEDアレイを使用して、光架橋中のUV放射照度(mW/cm2)の関数としてヒドロゲル力学を正確に制御することが確認されました(図2A)。このプロトコールで使用されるヒドロゲル製剤を 表2に見出すことができる。提供されたテンプレート上のLEDの間隔は、384ウェルプレートの他のすべてのウェルの間隔と一致し、プレート内にゲルを形成することができます(図2B)。単一のヒドロゲルの表面におけるミクロンスケール領域のAFM調査は、より柔らかい平均ヤング率を有するヒドロゲルも、より硬いヒドロゲルよりも小さいモジュライの範囲を有することを示した(図2C−E)。

生存率を最大化する細胞播種密度は、細胞種ごとに経験的に決定されるべきである。この研究は、.......

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Discussion

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現在の研究は、HAベース内で3Dの小型化された培養物を生成すると同時に、マトリックスの剛性とインテグリンエンゲージメントに利用可能なペプチドを変更する方法を提示しています。この技術は、マトリックスパラメータが細胞表現型(例えば、化学療法に曝露された癌細胞の生存率)にどのように影響するかを、より高いスループットで体系的に研究することを可能にする。本明細書に提示されたものを含む以前のアプローチは、最終製剤中の全ポリマーパーセントを変化させることによってヒドロゲル剛性を調整しており、ここで、より硬いヒドロゲルは、より高いポリマー含有量21、31を有する。しかしながら、このアプローチは、所望の各剛性に対して固有のヒドロゲル製剤を調製する必要があり、このプロセスは本質的にスループットを低下させる。ここで、ヒドロゲルの剛性は、架橋中にUV放射照度を変化させることによって調整され、単一の前駆体溶液から複数の剛性のヒドロゲルが得られる。ここで説明するカスタムイルミネーターを構築する機会がないかもしれない将来の開業医は、市販のUVスポット.......

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Disclosures

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著者らは開示するものは何もありません。

Acknowledgements

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著者らは、Carolyn Kim、Amelia Lao、Ryan Stoutamore、Itay Solomonがフォトジェレーションスキームの初期の反復に貢献したことを特に認めたいと思います。細胞株GS122およびGS304は、David Nathansonによって寛大に提供された。すべての図は BioRender.com で作成されました。UCLAの中核施設、分子スクリーニング共有リソース、ナノおよびピコキャラクタリゼーション研究所は、この研究に役立った。Chen Chia-Chunは、UCLA Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Programの支援を受けました。Grigor Varuzhanyanは、Tumor Cell Biology Training Program NIH Grant(T32 CA 009056)の支援を受けました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.1 kΩ 抵抗器、6 WDigikey35601k1ft
1.7 mL 微量遠心チューブGenesse Scientific21-108
15 mL 円錐管Fisher Scientific14-959-70C
365 nm LEDDigikeyltpl-c034uvh365
384 well plateBio Greiner One781090
40 & micro;m細胞ストレーナーMTCバイオC4040
4アームチオール終端ポリエチレングリコール(20 kDa)Laysan Bio4arm-PEG-SH-20K-1g
6 NPN BJTsDigikey2n5550ta
80オーム抵抗器、0.125 WDigikeyerjj-6enf80r6v
8アームノルボルネン終端ポリエチレングリコール(20 kDa)Jenkem TechnologyA7025-1
アキュターゼ革新的細胞技術AT104500 細胞の解離 試薬
AFM ProbesNovascan0.01 N/m 公称ばね定数、2.5 & micro;m SiO2粒子
Arduino IDEArduino1.8.19
Arduino NanoMakerfireMini Nano V3.0 ATmega328P マイクロコントローラ ボード
bFGFPeprotech100-18B20 ng/mL
CCK8Abcamab228554
遠心分離機Thermoscientificsorvall legend xtr
CP100STGilson F148415Pipette tips for positive displacement Pipette
Cubis Semi-Micro BalanceSartoriusMSA225S100DI
DMEM - F12 (50-50)Life Technologies113300571x
DMSOFisher ScientificBP231-100
DPBS Ca (-) Mg (-)Genesse Scientific25-508
EGFPeprotechAF100-1550 ng/mL
エタノール、無水Fisher ScientificA405PDI 水を加えて 70% に希釈します
Fisherbrand クラス B 琥珀色 ガラス製ねじ付きバイアルFisher Scientific03-339-23C
Fisherbrand 計量紙Fisher Scientific09-898-12B
G21 サプリメントGemini Bio400-16050x
ハンクス バランス塩溶液サーモフィッシャーサイエンティフィック14175095
HCl, ACS, 12Mシグマ アルドリッチS25838A水を加えてブ
タ腸粘膜から 1M ヘパリンナトリウム塩シグマ アルドリッチH3149-100Ku25 & マイクロ;g/mL
HEPES SigmaAldrichH7006-100G
熱風銃WagnerHT1000
インテグリン結合シアロタンパク質(IBSP)ペプチドGenscriptカスタムオーダーGCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
リチウムフェニル-2,4,6 トリメチルベンゾイルホスフィン酸 (LAP) , >95%Sigma Aldrich900889-1G
磁気攪拌板サーモサイエンティフィックSP194715
マイクロ遠心機Thermo ScientificSorvall legend micro 21R
Microman E シングルチャンネルピペットギルソンFD10004容積式ピペット
マイクロピペット チップ各種メーカー様々なサイズ
mLine マイクロピペットSartorious
N-アセチル システインSigma AldrichA7250-10G
Nanowizard 4BrukerAFM microscope
NaOHFisher Scientificss255-1DI水を加えて1 M
NormoicinInvivogenant-nr-1500x
Osteopontin PeptideGenscriptカスタムオーダーGCGYGTVDVPDGRGDSLAYG
ピペットエイドDrummond4000102
プレーン顕微鏡スライドグローブサイエンティフィック1301
プレス・トゥ・シール シリコンアイソレーター、直径 12-4.5mm x 深さ 2mmグレースバイオラボ664201-A1枚のシートから8つの個々の型が作られるようにカット
加工加工3.5.4
リピーター M4エッペンドルフ4982000322
リピーター ピペットのヒントSartorious300894301 mL サイズ
RGD ペプチドGenscriptGCGYGRGDSPG
Scoth テープ
血清ピペットGenesse Scientific12-102,12-1045,10 mL ピペット
んだペーストDigikey315-NC191LT15T5-ND
はんだワイヤー
ストレート解剖鉗子VWR Scientific82027-408
Synergy H1 Plate ReaderBiotek
T-75 Cell Culture Treated FlaskGenesee Scientific25-209
TemozolomideSigma AldrichT2577通常、10 & micro から使用されます。Mから100µM
Tenascin-C PeptideGenscriptGCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR
GV
チオール化ヒアルロン酸 (700 kDa)、6-8% 変性Lifecore BiomedicalHA700K5
VWR Spinbar、Flea MicroVWR58948-375
DIに希釈します は

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).
  2. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug....

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