方法論記事

ラベル保持拡張顕微鏡(LR-ExM)は、超解像イメージングと高効率ラベリングを可能にします

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DOI：

10.3791/63793

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2022年10月11日

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1Center for Complex Biological Systems, University of California Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California Irvine, 3Department of Chemistry, University of California Irvine

この記事について

サマリー

ラベル保持拡張顕微鏡(LR-ExM)のプロトコルが実証されています。LR-ExMは、以前に導入された膨張顕微鏡と比較して、より優れたラベリング効率を提供する新しい三官能アンカーのセットを使用しています。

要約

膨張顕微鏡(ExM)は、ほとんどの光学顕微鏡法と組み合わせて分解能を高めることができるサンプル調製技術です。細胞または組織を膨潤性ヒドロゲルに包埋した後、サンプルは元のサイズと比較して物理的に3〜16倍(直線寸法)に拡大することができる。したがって、顕微鏡の有効分解能は膨張係数によって増加します。先に導入されたExMの主な制限は、重合および消化手順後の蛍光の減少である。この制限を克服するために、新しい三官能アンカーのセットを使用して信号損失を防ぎ、標識効率を大幅に向上させるラベル保持拡張顕微鏡(LR-ExM)が開発されました。この技術により、蛍光シグナル損失を最小限に抑えながら、ナノメートルスケールで細胞または細胞内構造を調べる際に、より高い分解能を達成することができます。LR-ExMは、免疫蛍光標識だけでなく、SNAPタグやCLIPタグなどの自己標識タンパク質タグにも使用できるため、より高い標識効率を実現します。この研究では、この免疫染色ベースのアプローチの手順とトラブルシューティング、および代替としてのLR-ExMの自己標識タグ付けアプローチについて説明します。

概要

膨張顕微鏡(ExM)は、落射蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡などの従来の顕微鏡で超解像イメージングを実現するための便利なアプローチとして最初に導入されて以来、研究者によって使用されてきました1,2,3,4,5,6,7 .ExMを使用すると、通常の共焦点顕微鏡でも~70nmの横方向の分解能を達成することができます。ExMを超解像イメージングと組み合わせると、解像度がさらに向上します。例えば、構造化照明顕微鏡(SIM)では約30nmの分解能、確率的光学再構成顕微鏡(STORM)では約4nmの分解能を達成できます1,5。

ただし、ラベリング効率の低さは、標準的なExMメソッドでは重要な問題です。蛍光損失は、蛍光基の種類および消化時間に基づいて変化し得る。しかし、平均して、蛍光色素の50%以上がExMの重合およびタンパク質消化ステップの後に失われることが報告されており、これはイメージング品質に有害です3,4。

そのため、ラベルを効率的に保持し、シグナル損失を低減できるラベル保持拡張顕微鏡(LR-ExM)が開発されました1。LR-ExMの主な革新は、目的のタンパク質を染色するために、標準的なExM手順のように蛍光色素を単に使用するのではなく、三官能性アンカーのセットを使用することです。これらの三官能性リンカーは、(1)抗体に接続するためのコネクター(例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS))、(2)タンパク質をポリマーにアンカーするためのアンカー(例えば、メタクリルアミド(MA))、および(3)有機色素に結合するためのレポーター(例えば、ビオチンまたはジゴキシゲニン(DIG))の3つの部分からなる。三官能性アンカーは、重合およびタンパク質消化ステップに耐え、蛍光色素の損失を防ぎます。

さらに、この方法は、SNAPやCLIPなどの自己標識酵素タグと互換性があるため、大きな可能性を秘めています。酵素タグアプローチは、高い特異性と標識効率に関して免疫染色アプローチに比べていくつかの利点があります8、9、10。

この原稿では、LR-ExMの詳細な手順を示しています。LR-ExMは、ラベリング効率を高めて高い空間分解能を実現するための非常に効果的で柔軟な方法です。

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プロトコル

1. 細胞培養

  1. マッコイ社製5A培地で培養したU2OS細胞を使用し、10%FBSを添加し、37°Cの5%CO2中。
  2. 取り扱いを容易にするために、16ウェル取り外し可能なチャンバーカバーガラス(培養面積0.4 cm2)上に細胞を培養します。

2.固定と透過処理

注:固定および透過処理の条件は、最適化された免疫染色プロトコルによって異なります。以下は、微小管およびクラスリンコーティングピット(CCP)の共免疫染色に対する固定および透過処理プロトコルです。

  1. 細胞数が~0.04 x 10 6に達したら、100 μLの3.2%パラホルムアルデヒド(PFA)をPEMバッファー(100 mM PIPES、1 mM EGTA、および1 mM MgCl2、pH6.9)で室温で10分間固定します(表1)。
    注意: PFAを使用した固定は、認定された安全フードで行われます。
  2. 細胞を200 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でそれぞれ5分間3回洗浄します。
  3. 100 μLの透過処理バッファーで細胞を室温で15分間透過処理します(表1)。
    注:標的タンパク質、RNA、またはDNAの分解を回避し、最適な結果を得るために、できるだけ早く標識を進めてください。ただし、必要に応じて、固定サンプルを4°CのPBSバッファーに長期間(最大1か月)保存できます。 蒸発したPBSを交換し、サンプルを光退色から保護します。

3.内因性ストレプトアビジンおよびビオチンブロッキング

  1. 細胞ブロッキングバッファー(100 μL)で希釈したストレプトアビジン溶液で室温で15分間インキュベートします(表1)。
  2. 200 μLの細胞ブロッキングバッファーで短時間すすぎます。
  3. 細胞ブロッキングバッファーで希釈した100 μLのビオチン溶液で細胞を室温で15分間インキュベートします。
    注: SNAP タグや CLIP- タグの使用など、自己ラベル付けタグ付けアプローチを使用する場合は、手順 4 をスキップして、手順 5.1: 自己ラベル付けタグ付けアプローチに進みます。

4. 一次抗体染色

  1. ラット抗αチューブリン抗体(1:500希釈)およびウサギ抗クラスリン重鎖抗体(1:100希釈)を用いて、100 μLの細胞ブロッキングバッファー中で細胞を4°Cで16時間、または室温で1時間インキュベートします。組織サンプルのインキュベーション時間を2倍にします。
  2. サンプルを200 μLのPBSでそれぞれ5分間4回洗浄します。

5. LR-ExM特異的二次抗体染色

  1. IgG抗体と3官能性リンカー、例えばN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)-メタクリルアミド(MA)-ビオチンまたはNHS-MA-ジゴキシゲニン(Dig)とのコンジュゲート(図1B)。三官能性アンカーの合成および二次抗体の結合は、Shiら1で既に導入されている。自己標識タグ付けアプローチ:IgG抗体をMA-ベンジルグアニン(BG)-ビオチンまたはMA-ベンジルシトシン(BC)-Digなどの3官能性リンカーとコンジュゲートします(図1B)。三官能性アンカーの合成および二次抗体の結合は、Shiら1において既に導入されている。
  2. ロバ抗ウサギDig-MA(1:100希釈)およびロバ抗ラットビオチン-MA(1:100希釈)二次抗体を用いて、100 μLの細胞ブロッキングバッファー中で細胞を室温で1時間インキュベートします。組織サンプルのこのインキュベーション時間を2倍にします。
  3. サンプルを200 μLのPBSでそれぞれ5分間4回洗浄します。

6.追加のアンカー

  1. 細胞をPBS(100 μL)中の0.25%グルタルアルデヒド(GA)とともに室温で15分間インキュベートし、タンパク質をヒドロゲルに固定します。または、アンカーリングに25 mMメタクリル酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MA-NHS)を使用します。室温で1時間のインキュベーションが推奨されます。
  2. サンプルをPBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。

7.ゲル化

注:膨張速度は、塩と水のゲル内またはゲルへの拡散時間によって決まります。したがって、薄いゲルをキャストすると、膨張時間が短縮されます。

  1. 16ウェルゲルプレートの上部構造を取り外します。40 μLのモノマー溶液を各ウェルに加え、氷上で細胞をコンディショニングします。氷上で5分間インキュベートします。
    1. モノマー溶液を調製するには、 表2を参照してください。
  2. 氷上でゲル化溶液を調製する。二重蒸留水と10%N,N,N',N′テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)促進剤をモノマー溶液に加えます(10%TEMED:モノマー溶液= 1:47)。イニシエータをまだ追加しないでください(表3)。
  3. 面積0.4cm2の細胞培養チャンバーの場合、約40μLの容量のゲル化溶液を使用する。
  4. ゲル化溶液に10%過硫酸アンモニウム(APS)を加え、氷上でインキュベートし、直ちに40 μLのゲル化溶液を氷上の各シリコーンガスケットウェルにピペットで入れます。氷上で3分間インキュベートします(10%APS:10%TEMED:モノマー溶液= 1:1:47)。
  5. サンプルを光から保護し、10 cmのペトリ皿のカバーガラスを37°Cのインキュベーターに1.5時間移動してゲル化させます。37°Cのインキュベーション中にゲルの湿度を保つために、ペトリ皿を蓋で覆い、ペトリ皿に数滴の水を入れます。

8.消化

  1. ゲル化後、ガラスを取り外してゲルを分離し、ゲルを6ウェルプレートに移します。包埋細胞を2 mLの消化バッファー(表1)で室温または37°Cで4時間一晩消化します。 少なくとも10倍過剰量の消化バッファーを使用してください。
  2. 最終ゲル量よりも少なくとも10倍過剰量の水でゲルを洗浄します。毎回20〜30分間、洗浄手順を4回繰り返します。ゲルは各次元で約2倍に膨張します。
    注:ゲルサンプルは、4°CのPBSバッファーに最大1か月間保存できます。 乾燥を防ぐために蒸発した水を交換し、保管中にサンプルを光から保護します。三官能アンカーの劣化を避けるために、サンプルは消化と洗浄の後できるだけ早く染色する必要があります。

9. 消化後の蛍光染色

  1. 2 mL容量のストレプトアビジン(STV)/ジゴキシゲニン(DIG)染色バッファー中で、2〜5 μMのSTV色素および/または抗DIG色素を含むゲルを室温で24時間インキュベートします。サンプルは暗所に保管してください。

10. 拡張

  1. ゲルを過剰な水(2〜3 mL)で30分から1時間4回洗浄して膨張させます。
  2. 蛍光顕微鏡下で細胞を簡単に可視化するために、5回の洗浄のうち3回目にDAPIで細胞を染色します。DAPIストック濃度(5 mg/mL、4°Cで保存)を洗浄水で1:5,000希釈液で希釈します。ゲルをDAPI水溶液(2 mL)で30分から1時間インキュベートします。
  3. 3 mLの水でさらに2回洗浄します。
  4. サンプルを入れるのに十分な大きさの平らな皿にゲルを広げます。0.4cm2の面積カバーガラス上に調製された膨張ゲルは、ガラス底部6ウェルプレートにうまく収まる。
    注:膨張後に染色されたサンプルは、4°CのPBSバッファーに最大4か月間保存できます。 乾燥を防ぎ、サンプルを光退色から保護するのに十分な水を追加します。イメージングの前に拡張およびDAPI染色ステップを繰り返します。蛍光色素の劣化のリスクを回避するには、サンプルをできるだけ早くイメージングする必要があります。

11. イメージング

  1. 6ウェルガラス底部イメージングチャンバーに0.01%ポリ-L-リジン(各3 mL)をコーティングし、ゲルサンプルを固定化します。
  2. ゲルサンプルをコーティングされたイメージングチャンバーに移します。
  3. 任意の蛍光スコープでサンプルを画像化します。

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結果

クラスリン被覆ピット(CCP)は、三官能性アンカーを用いて免疫染色され(図1B)、LR-ExMは図1Aに記載されるように行われる。LR-ExM(図2C、E)は、タンパク質保持拡大顕微鏡(proExM、図2A)またはビオチン-ExM(図2B)と比較して、はるかに高い蛍光強度を示します。LR-ExMの信号はproExMの約6倍でした(図2D)。LR-ExMは、回折限界よりもさらに小さいCCPなどの小さな構造を効果的に捕捉することができます(図2F、G)。

LR-ExMの代表的な結果のいくつかを免疫染色アプロ...

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ディスカッション

LR-ExMの主な革新は、三官能アンカーを使用して標的タンパク質を効果的に標識し、画質を向上させることです。この方法は、研究者がそれほど容易に利用できない三機能アンカーによって制限されています。ただし、三機能アンカーはリクエストに応じて他の研究者と共有することができ、ChrometaのExMプローブなどの同様の製品も現在市販されています。

このプロトコルでは、一次抗体および二次抗体染色ステップのために室温で1時間のインキュベーションが行われています。ただし、これらのステップは代わりに4°Cで一晩行うことができ、一晩染色するとバックグラウンドノイズが低下することが観察されます。

ヒドロゲルの異方性膨張に由来する構造歪みを防止するためには、プロテアーゼ3を用いて徹底したタンパク質消化を行うことが重要である。しかし、以前の膨張顕微鏡では、蛍光標識の50%以上が重合およびタンパク質消化ステップ後に失われる可能性があり、その結果、画質が低下することが示されています

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開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、米国国立衛生研究所(R00 GM126136からX.S.)、米国国立科学財団(DMS1763272からS.P.)、およびサイモンズ財団(594598からS.P.)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アクリルアミド シグマ A9099 ExMゲル
AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearchH+L, 711–005-152抗体
AffiniPureロバ抗ラットIgGジャクソン免疫研究H + L、712–005-153抗体
Alexa Fluor 488-ストレプトアビジンJackson ImmunoResearch016-540-084蛍光プローブ 
Alexa Fluor 594 ストレプトアビジンジャクソン免疫研究016-580-084蛍光プローブ 
Alexa Fluor 647 ストレプトアビジンJackson ImmunoResearch016-600-084蛍光プローブ 
過硫酸アンモニウム シグマ A3678 ExMゲル
anti-H3K4me3Abcamab8580抗体
anti-H3K9me3Abcamab176916抗体
DAPI二酢酸Thermofisher ScientificD3571蛍光プローブ 
DyLight 488標識抗ジゴキシゲニン/ジゴキシン(DIG)Vector LaboratoriesDI-7488プローブ 
DyLight 594 標識抗ジゴキシゲニン/ジゴキシン (DIG)Vector LaboratoriesDI-7594蛍光プローブ 
EGTAEMDミリポア株式会社324626-25GM固定緩衝液
エチレンジアミン四酢酸 シグマ EDTA消化緩衝液
グルタルアルデヒド10%EMグレード電子顕微鏡科学50-262-13アンカリング
グレースバイオラボ培養取り外し可能なチャンバーカバーガラスバイオラボ GBL112358-8EA細胞培養チャンバー
Grace Bio-Labs CultureWell 取り外しツールGrace Bio-Labs GBL103259除去ツール
グアニジンHCl シグマ G3272 消化バッファー
塩化マグネシウムSigmaM8266-1KG固定バッファー
McCoy's 5aATCC30–2007セル培地
メタクリル酸 N-ヒドロキシスクシンイミドエステル,98% (マサチューセッツ州-NHS)シグマ 730300-1Gアンカリング
モノクローナル マウス 抗 Nup153 抗体Abcamab24700抗体
N,N′メチレンビスアクリルアミド シグマ M7279 ExMゲル
N,N,N&素数;,N&素数;テトラメチルエチレンジアミン (テメド)シグマ T7024 ExMゲル
16% パラホルムアルデヒド 水溶液電子顕微鏡 科学50-980-487固定バッファー
PIPESSigmaP6757-25G固定バッファー
Poly-L-LysineSigmaP8920-100MLチャンバーコーティング
プロテイナーゼ K Sigma-AldrichP4850-5ML消化バッファー
ウサギ抗クラスリン重鎖抗体Abcamab21679
抗体ラット抗 –&α;-チューブリン抗体、チロシン化、クローンYL1/2ミリポアシグマMAB1864-I抗体
酸ナトリウム Sigma408220ExM ゲル
ストレプトアビジン/ビオチン ブロッキング キットVector LaboratoriesSP-2002ブロッキング バッファー
Tris-HCl ライフテクノロジーズ AM9855 消化バッファー
U2OSATCCHTB-96細胞株
6ウェルガラス底板CellvisP06-1.5H-Nイメージングプレート
蛍光グレースアクリル

参考文献

  1. Shi, X., et al. Label-retention expansion microscopy. The Journal of Cell Biology. 220 (9), 202105067(2021).
  2. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  3. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
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  5. Wang, Y., et al. Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes. Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).
  6. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
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  9. Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).
  10. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
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  12. Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, 73775(2021).
  13. M'Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850(2020).

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