このプロトコールは、マウス脳の自由浮遊組織切片の切片化、染色、および画像化のための方法を記載し、続いて、アストロサイト領域体積およびアストロサイト領域オーバーラップまたはタイリングの分析の詳細な説明を記載する。
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この記事について
サマリー
要約
アストロサイトは、脳内のほぼすべてのタイプの細胞および構造と相互作用することを可能にする驚くべき程度の形態学的複雑さを有する。これらの相互作用を通じて、アストロサイトはシナプス形成、神経伝達、イオン恒常性など、多くの重要な脳機能を積極的に調節します。げっ歯類の脳では、アストロサイトは出生後最初の3週間でサイズと複雑さを増し、脳をタイル状にするために、重複しない明確な領域を確立します。このプロトコルは、マウス脳からの自由浮遊組織切片を用いて、アストロサイト領域体積およびアストロサイトタイリングを分析するための確立された方法を提供する。まず、このプロトコルは、自由に浮遊する組織切片の組織収集、凍結切断、および免疫染色のステップを記述する。第2に、このプロトコルは、市販の画像解析ソフトウェアを用いて、アストロサイトの領域体積および領域重複体積の画像取得および分析を記述する。最後に、この原稿では、これらの方法の利点、重要な考慮事項、一般的な落とし穴、および制限について説明します。このプロトコルは、アストロサイトのスパースまたはモザイク蛍光標識を有する脳組織を必要とし、一般的なラボ機器、共焦点顕微鏡、および市販の画像解析ソフトウェアで使用するように設計されています。
概要
アストロサイトは、脳内で多くの重要な機能を果たす精巧に分岐した細胞です1。マウス皮質では、放射状グリア幹細胞は、後期胚期および出生後早期の段階2の間にアストロサイトを生じる。出生後最初の3週間の間に、アストロサイトはサイズと複雑さを増し、シナプスと直接相互作用する何千もの細かい枝を発達させます1。同時に、アストロサイトは隣接するアストロサイトと相互作用して、ギャップジャンクションチャネル4を介した通信を維持しながら、脳3をタイル状にするための離散的で重複しない領域を確立する。アストロサイトの形態および組織は、侮辱または傷害に続く多くの疾患状態において破壊され5、適切な脳機能のためのこれらのプロセスの重要性を示す。正常な発達、老化、および疾患中のアストロサイトの形態学的特性の分析は、アストロサイトの生物学および生理学に関する貴重な洞察を提供することができる。さらに、遺伝子操作後のアストロサイト形態の解析は、アストロサイトの形態学的複雑さの確立と維持を支配する細胞および分子メカニズムを識別するための貴重なツールです。
マウス脳におけるアストロサイト形態の解析は、アストロサイト分岐....
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プロトコル
全てのマウスを、ノースカロライナ大学チャペルヒル校および比較医学部の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)(IACUCプロトコル番号21-116.0)に従って使用した。出生後21日目に両性のマウス(P21)をこれらの実験に使用した。CD1マウスを市販品として入手し(材料表)、MADM9 WT:WTおよびMADM9 WT:KOマウスは、先に9に記載されていた。
注:このプロトコルは、アストロサイトのまばらな集団において蛍光タンパク質発現を有する脳を必要とする。蛍光タンパク質発現は、遺伝的、ウイルス的、またはエレクトロポレーションによって導入することができる。アストロサイトをまばらに標識する方法の詳細は、以前に発表された研究およびプロトコール1、7、8、9、10、11、12、13に記載され....
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結果
図 1 に、このプロトコルの主要なステップとワークフローの概略図を示します。 図 2 は、画像解析ソフトウェアを使用してサーフェスを生成し、サーフェスに近いスポットを生成し、凸包を生成するための主要な手順のスクリーンショットを示しています。 図3は 、アストロサイトの領域の重複/タイリングを決定するためのこの手法の適用を示しています。 図4において、以前に公開された原稿9 からの代表的な結果は、このプロトコルの適用を実証する。図 4A および 図4Bにおいて、アストロサイト富化細胞接着分子hepaCAMのノックダウンは、アストロサイト領域容積を有意に減少させる。図 4C および.......
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ディスカッション
このプロトコルは、マウス皮質におけるアストロサイトの領域体積およびアストロサイトタイリングを分析するための確立された方法を記述し、灌流から始まり画像解析で終わるすべての主要なステップを詳述する。このプロトコルは、アストロサイトのまばらまたはモザイク集団で蛍光タンパク質を発現するマウスの脳を必要とする。この要件の外では、灌流設定と埋め込み型に加えられた凍結培地の量を少し調整するだけで、このプロトコルにはあらゆる年齢のマウスを使用できます。脳組織切片7,11におけるアストロサイトの分岐の複雑さおよび体積の分析のために他の方法が公開されているが、このプロトコルにはいくつかのユニークな利点がある。まず、このプロトコルは、アストロサイト領域体積を取得するために使用できるカスタムコードを記述する。アストロサイト領域体積は、その分岐の複雑さにかかわらず、アストロサイトが占める空間全体を測定するという点で、アストロサイト細胞体積とは別個の測定値である。さらに、このプロトコルは、アストロサイト領域オーバーラップ体積、したがってアストロサイ.......
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開示事項
著者には利益相反はありません。
謝辞
顕微鏡検査はUNC神経科学顕微鏡コア(RRID:SCR_019060)で実施され、NIH-NINDS神経科学センター支援助成金P30 NS045892およびNIH-NICHD知的発達障害研究センター支援助成金U54 HD079124からの資金提供によって部分的に支援されました。図 1 は BioRender.com を使用して作成されました。図4の画像及びデータは、出版社の許可を得て、以前の刊行物9 から転載したものである。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| #5 鉗子 | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB シリンジ | ベクトン ディキンソン (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (トリス緩衝生理食塩水) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; 室温で保存 (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O;RT | ||
| 1x TBS + ヘパリン | 28.2 mg ヘパリン + 250 mL 1x TBS で保存; 4 度で保存;C | ||
| 24 ウェルプレート | ジェネシー サイエンティフィック | 25-107MP | |
| 30% スクロース TBS | 15 g スクロース、1x TBS 〜 50 mL; 4 °C; 4°C; | ||
| TB | 40 g PFA、4-6 NaOH ペレット、100 mL 10x TBS、dH2O to 1 L; 4 °C; 4°C;C | ||
| Avertin | 0.3125 g トリブロモエタノール、0.625 mL メチルブタノール、dH2O to 25 mL; 4 °Cで保存;C; | ||
| ブロッキングおよび抗体緩衝液 | 10%ヤギ血清をTBSTで作成してから2週間後に廃棄し、4°Cで保存してください。C | ||
| CD1 マウス | チャールズ リバー | 022 | |
| 脳用コレクションバイアル | フィッシャー・サイエンティフィック | 03-337-20 | |
| 共焦点取得ソフトウェア | オリンパス | FV31S-SW | |
| 共焦点顕微鏡 | オリンパス | FV3000RS | |
| カバースリップ | フィッシャー・サイエンティフィック | 12544E | |
| クライオスタット | サーモScientific | CryoStar NX50 | |
| クライオスタットブレード | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| 埋め込み型 | Polysciences | 18646A-1 | |
| 凍結培地 | 2:1 30% スクロース:OCT; RT | ||
| GFP 抗体 | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol で保存 | Thermo Scientific | 158920010 | |
| ヤギ抗ニワトリ 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| ヤギ抗ウサギ 594 | Invitrogen | A11037 | |
| ヤギ血清 | Gibco | 16210064 | |
| ヘパリン | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| 塩酸 | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch Tin | AQUARIUS | N/A | Amazonより、「DIY Large Fun Box」 |
| メチルブタノール | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| 実装媒体 | 20 mM Tris pH 8.0、90% グリセロール、0.5% N-プロピルガレート;4°Cで保管します。C;最長2ヶ月間有効 | ||
| マニキュア | VWR | 100491-940 | |
| N-プロピルガレート | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | フィッシャーサイエンティフィック | 23-730-571 | |
| オイル | オリンパス | IMMOIL-F30CC | 顕微鏡/対物レンズ |
| 操作はさみ6 " | Roboz | RS-6820 | |
| 軌道プラットフォームシェーカー | フィッシャーサイエンティフィック | 88861043 | 必要な最小速度:25 rpm |
| ペイントブラシ | Bogrinuo | N / A | アマゾンから、"詳細ペイントブラシ-ミニチュアブラシ「 |
| パラホルムアルデヒド | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| パスツールピペット (5.75インチ)」 | VWR | 14672-608 | |
| パスツールピペット (9インチ) | VWR | 14672-380 | |
| 塩化カリウム | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| カミソリ刃 | フィッシャーサイエンティフィック | 12-640 | |
| RFP抗体 | Rockland | 600-401-379 | |
| 切片化培地 | 1:1 グリセロール:1x TBS; RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| ナトリウム クロロイドナトリウム | フィッシャーサイエンティフィック | BP358-212 | |
| 水酸化ナトリウム | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| スクロース | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (高品質) | フィッシャーサイエンティフィック | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | カスタムXTensionは、補足材料として提供します |
参考文献
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-233 (2020).
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