厚い自由浮遊組織切片におけるアストロサイトの領域体積とタイリングの解析

アストロサイトは、脳内で多くの重要な機能を果たす精巧に分岐した細胞^です1。マウス皮質では、放射状グリア幹細胞は、後期胚期および出生後早期の段階²の間にアストロサイトを生じる。出生後最初の3週間の間に、アストロサイトはサイズと複雑さを増し、シナプスと直接相互作用する何千もの細かい枝を発達させます¹。同時に、アストロサイトは隣接するアストロサイトと相互作用して、ギャップジャンクションチャネル⁴を介した通信を維持しながら、脳³をタイル状にするための離散的で重複しない領域を確立する。アストロサイトの形態および組織は、侮辱または傷害に続く多くの疾患状態において破壊され⁵、適切な脳機能のためのこれらのプロセスの重要性を示す。正常な発達、老化、および疾患中のアストロサイトの形態学的特性の分析は、アストロサイトの生物学および生理学に関する貴重な洞察を提供することができる。さらに、遺伝子操作後のアストロサイト形態の解析は、アストロサイトの形態学的複雑さの確立と維持を支配する細胞および分子メカニズムを識別するための貴重なツールです。

マウス脳におけるアストロサイト形態の解析は、アストロサイト分岐の複雑さとアストロサイトタイリングの両方によって複雑になる。中間フィラメントグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)をアストロサイト特異的マーカーとして用いた抗体染色は、主要な枝のみを捕捉し、アストロサイトの形態学的複雑さを非常に過小評価している¹。グルタミン酸トランスポーター1(GLT-1;slc1a2)、グルタミン合成酵素、またはS100βなどの他の細胞特異的マーカーは、アストロサイト枝⁶を標識するより良い仕事をするが、新しい問題を導入する。アストロサイトの領域は大部分が重なり合っていないが、周辺縁にはわずかな程度の重なりが存在する。分岐の複雑さのために、隣接するアストロサイトが同じ色でラベル付けされている場合、一方のアストロサイトがどこで終わり、もう一方が始まるかを区別することは不可能である。内因性蛍光タンパク質によるアストロサイトのスパースまたはモザイク標識は、両方の問題を解決します:蛍光マーカーは、すべての枝を捕捉するために細胞を満たし、それらの隣人と区別することができる個々のアストロサイトのイメージングを可能にします。ウイルス注射、プラスミドエレクトロポレーション、またはトランスジェニックマウス系統を含む、遺伝子操作の有無にかかわらず、アストロサイトのまばらな蛍光標識を達成するために、いくつかの異なる戦略が使用されてきた。これらの戦略の実行に関する詳細は、以前に発表された研究およびプロトコル1、⁷、^8、9、¹⁰、¹¹、^12、13に記載されている。

この記事では、まばらなアストロサイトの集団において、蛍光標識を用いてマウス脳からのアストロサイト領域体積を測定する方法について説明します(図1)。マウス皮質におけるアストロサイトの平均直径は約60μmであるため、個々のアストロサイト全体を捕捉する効率を向上させるために、厚さ100μmの切片が使用される。免疫染色は必須ではありませんが、共焦点イメージングおよび分析のために内因性蛍光シグナルを増強するために推奨されます。免疫染色はまた、微細なアストロサイト枝のより良い検出を可能にし、画像取得中の内因性タンパク質のフォトブリーチングを低減する可能性がある。厚い切片への抗体の浸透を改善し、切片化からイメージングまでの組織体積を維持するために、自由に浮遊する組織切片が使用される。アストロサイト領域容積の解析は、市販の画像解析ソフトを用いて行う。さらに、このプロトコルは、隣接するアストロサイトが異なる蛍光標識を発現するモザイク標識を有する組織切片におけるアストロサイトタイリングの分析方法を記述する。このプロトコルは、正常な脳発達中のアストロサイト増殖、ならびにアストロサイト発達に対する遺伝子操作の影響を特徴付けるために、いくつかの最近の研究^1,8,9において首尾よく使用されている。

全てのマウスを、ノースカロライナ大学チャペルヒル校および比較医学部の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)(IACUCプロトコル番号21-116.0)に従って使用した。出生後21日目に両性のマウス(P21)をこれらの実験に使用した。CD1マウスを市販品として入手し(材料表)、MADM9 WT:WTおよびMADM9 WT:KOマウスは、先に⁹に記載されていた。

注:このプロトコルは、アストロサイトのまばらな集団において蛍光タンパク質発現を有する脳を必要とする。蛍光タンパク質発現は、遺伝的、ウイルス的、またはエレクトロポレーションによって導入することができる。アストロサイトをまばらに標識する方法の詳細は、以前に発表された研究およびプロトコール1、^7、8、⁹、^10、11、^12、13に記載されている。

1. 組織の採取と調製

警告: パラホルムアルデヒド(PFA)は有害な化学物質です。化学ヒュームフード内のPFAを使用してすべての手順を実行します。

1. 注射可能な麻酔薬(例えば、Avertin;0.8mg / kg)でマウスを麻酔し、つま先のピンチで麻酔の深さを確保する。蠕動ポンプを使用して、肝臓が透明になるまで(典型的には3〜5分)、続いて氷冷トリス緩衝生理食塩水(TBS)+ヘパリンを約3mL/分の速度で心臓内灌流を行い、続いて氷冷4%PFAをTBS中で約3mL/分の割合で5分間行う。
   注:流量と時間は、出生後21日目(P21)マウスに最適化されています。流量および灌流時間の調整は、異なる年齢のマウスに対して必要であり得る。
2. 灌流後、一対の操作はさみを使用して頭を取り外し、皮膚を取り外して頭蓋骨を露出させます。次に、一対のマイクロ解剖ハサミを使用して頭蓋骨の上部を取り除き、脳を露出させます。一対の鉗子または小さなヘラを使用して脳を取り出し、氷冷4%PFAを含むチューブに移し、4°Cで一晩インキュベートする。
   注:脳がチューブの底にくさび込まれて組織を圧縮し、アストロサイトの体積を変化させないように、7mLシンチレーションバイアルなどの平らな底のチューブを使用してください。
3. 翌日、チューブからPFAを注ぎ出す。5mLの1x TBSをチューブに加え、脳をすすぎ、残留PFAを除去する。TBSを注ぎ、このプロセスをさらに2回繰り返して、合計3回のすすぎます。
4. TBSに30%スクロースを4〜5mL加え、4°Cで1〜2日間、または脳がチューブの底に沈むまで脳をインキュベートする。
   注:脳は沈むと凍結する準備ができていますが、4°Cのスクロース溶液に数週間保存することができます。
5. TBS中の100%最適切断温度(OCT)化合物15mLと30mLの30%スクロースを混合して、50mLチューブ内の凍結培地を調製する。チューブをさらに1時間直立させ、泡が表面に浮かび上がるようにします。
   注:凍結媒体は、事前に調製し、室温で数週間保存することができます。
6. 血清学的ピペットを使用して、正方形の埋め込み型に凍結媒体を追加します(材料表)。媒体に気泡が入らないように注意してください。P21マウスの脳の場合、3mLで十分です。脳が完全に水没するように、異なる年齢のために必要に応じて音量を調整します。
7. 脳を培地に加え、#5鉗子のペアを使用して、脳が型に平らに座るのを妨げている可能性のある脳幹を取り除きます。脳の前部を金型の片方の端に並べます。
8. ドライアイスで冷却した平らな面に金型を移します。ドライアイスで満たされた金属製のランチ スズは、この目的に適しています。金型をドライアイス ペレットで囲み、ゆっくりと凍結するようにします。
9. 凍結媒体が完全に白色で固体になったら、金型を-80°Cで保管します。
   注:脳は-80°Cで数年間保存することができます。

2. サイロセクショニング

注: このセクショニング方法は、市販されているさまざまなクライオスタットで動作することを意図しています。ここで使用したクライオスタット(材料表)では、最適な試料ヘッド切断温度は-23 °Cで、周囲チャンバ温度は-23 °C ~ -25 °C です。

警告: クライオスタットブレードは非常に鋭くなっています。ブレードの操作やクライオスタットの操作には注意してください。

1. 50 mL チューブ中で 25 mL の 1x TBS と 25 mL のグリセロールを混合して、切片化培地を調製します。グリセロールをチューブに直接注ぎ、チューブのマーカーを測定に使用することによって、グリセロールを添加するのが最も簡単です。混合するチューブを振/渦巻きます。この溶液は、室温で数週間保存することができる。
2. 12ウェルプレートに1ウェルあたり2mLの切片培地を加えて組織切片を採取する準備をした。プレートの上部と下部にサンプル情報ラベルを付けます。プレートを他の消耗品(クライオスタットブレード、カミソリブレード、チャック、ペイントブラシ)とともにクライオスタットに直接置き、約5分間温度に順応させます。
3. 脳をクライオスタットチャンバーに移動し、供給物とともに温度に順応できるようにします。
4. カミソリの刃で金型の2つの角を切り取り、金型を組織から剥がして、凍結組織ブロックを金型から取り外します。脳の前面が上を向くようにブロックを向けます。
5. チャックの約2/3がOCTで覆われるようにOCTをチャックに加え、直ちに組織ブロックをチャックの上に置き、上記の向きを保ちます。ブロックをOCTに押し下げて、チャックの表面で平らにします。
6. OCTが完全に凍結し、組織ブロックがしっかりと固定されたら、チャックを試料ヘッドにクランプします。クライオスタットブレードを挿入し、ブレードを試料に近づけます。
7. 脳の関心領域に到達する直前まで、100 μm間隔で脳をトリミングします。切片化媒体に溶解するOCTの量を減らすには、カミソリの刃を使用して、組織ブロックの側面から余分な凍結媒体をトリミングします。
8. 関心領域に到達したら、厚さ100μmの断面の収集を開始します。アンチロールプレートを使用するか、片手でクライオスタットをゆっくりと前進させ、もう一方の手でペイントブラシを使用して、ブレードに当たるときにセクションをブロックから導き出すことによって、セクションを収集します。クライオスタットモデルにペダルがある場合は、ペダルを使用してクライオスタットを進め、両手でセクションをブロックから外すことができるようにします。
9. 切片をペイントブラシまたは鉗子を用いて12ウェルプレートに移す。各ウェルは、少なくとも10-12のセクションを保持することができます。セクションを媒体に追加する場合、通常、断面の下端を切片媒体に触れ、ブラシまたは鉗子を濡らすことなく断面が媒体に溶け込むようにするだけで十分です。ブラシが媒体に触れた場合は、過度に濡れたブラシは組織切片を移すことが困難になるため、ペーパータオルまたはティッシュで乾かしてください。
10. プレートをホイルまたはパラフィンフィルムで包んで固定します。必ずラベルを貼ってから、-20°Cで保管してください。
    メモ:ほとんどの染色プロトコルでは、切片は、信号を大幅に失うことなく、少なくとも1〜2年間-20°Cで保存することができます。

3. 免疫染色

注:すべての洗浄とインキュベーションは、約100rpmに設定したオービタルプラットフォームシェーカーで行います。全ての工程は、4°Cで行われる一次抗体インキュベーションを除き、室温で行われる。 50 mLチューブに材料を混ぜ合わせ、ナテーターで一晩混合して、前もってマウントメディアを準備します。光から保護し、4°Cで最大2ヶ月間保管してください。内因性蛍光シグナルが免疫染色を必要とせずにイメージングおよび分析に十分である場合、ステップ3.1〜3.9をスキップすることができる。免疫染色をスキップする場合は、TBSで10分間洗浄を3回行い、ステップ3.10に進みます。

1. 50 mL チューブに 10% Triton-X を 1 mL 加え、このチューブを 50 mL に 1x TBS で充填して、TBST (TBS で 0.2% Triton) の新鮮な溶液を調製します。脳ごとに 2 mL のブロッキング溶液と抗体溶液 (TBST で 10% ヤギ血清) を準備します。
   注:最良の結果を得るには、新しい染色実験ごとに新鮮なTBSTを作成し、10%水性Triton-X(材料表)の高品質のソースを使用してください。
2. 24ウェルプレートに概略に従ってラベルを付けます(図1)。異なるサンプルを異なる行に配置し、異なる溶液を異なる列に配置します。最初の 3 つのカラムに 1 mL の TBST を追加します (「ウォッシュ 1」、「ウォッシュ 2」、および「ウォッシュ 3」)。1 mLのブロッキング溶液を第4カラムに加える。
3. パスツールのピペットの5.75の端をブンゼンバーナーを使用して小さなフックに溶かして、ガラスピックを準備します。このピックを使用して、組織切片を 12 ウェルプレートから 24 ウェルプレートの Wash 1 カラムに移します。
   メモ: 最良の結果を得るには、染色を開始する前に各セクションをスクリーニングしてください。切片をスクリーニングするには、切片を1x TBSで満たされたシャーレに1つずつ移し、5倍または10倍の対物レンズを備えた蛍光顕微鏡を使用して切片を調べ、十分な数の蛍光標識細胞が存在することを確認します。ウェルあたり4~6セクションの染色が推奨されますが、必要に応じてウェルあたり最大8つのセクションを染色することもできます。
4. 切片をWash 1、2、および3ウェルでそれぞれ10分間洗浄し、続いてブロッキング溶液中で切片を1時間インキュベートした。ガラスピックを使用して、あるウェルから次のウェルにセクションを移します。ピックは、一度に複数の脳セクションを転送するために使用することができます。
5. 各サンプルに対して1mLの一次抗体溶液(例えば、ウサギRFP 1:2000またはニワトリGFP 1:2000)を調製する。抗体溶液に抗体を加え、短時間ボルテックスし、次いで4°Cで≥4,000 x g で5分間遠心分離した。 切片を一次抗体中で、振とうしながら4°Cで2~3晩インキュベートする。
6. 一次抗体インキュベーション後、洗浄ウェルからDay 1 TBSTを吸引し、各洗浄ウェルに1 mLの新しいTBSTを加え、切片を最初の洗浄ウェルに移動します。切片を3倍ずつ10分間洗います。
   注:吸引には、真空フラスコにチューブで接続されたパスツールピペットの9を使用してください。ハウス真空ラインまたは電動真空ポンプを真空源として使用できます。
7. 切片が洗浄されている間、抗体溶液に抗体を添加して1:200の濃度で二次抗体溶液を調製する(例えば、ヤギ抗ウサギ594、またはヤギ抗ニワトリ488)。渦を短時間、次いで4°Cで≥4,000 x g で5分間回転させる。
8. 切片を二次抗体中で室温で3時間インキュベートする。二次抗体の漂白を緩和するために、このステップおよび以下のすべてのステップの間に切片を光から保護する。
9. 二次抗体インキュベーション後、洗浄ウェルからDay 2 TBSTを吸引し、各洗浄ウェルに1 mLの新しいTBSTを加え、切片を最初の洗浄ウェルに移動する。セクションをTBSTで3倍にそれぞれ10分間洗浄します。
10. 最終洗浄中は、マウントメディアを4°Cから取り出し、室温まで温めます。1x TBS:dH 2 Oの₂:1混合物を準備し、これをペトリ皿に加える。表面に2:1TBS:dH2O_を800μL加えて顕微鏡スライドを作製した。
    メモ: 非硬化マウントメディアを使用することを強くお勧めします。マウント媒体を硬化させることは、アストロサイト領域体積の分析を混乱させる可能性のある組織の体積を変化させることができる。シンプルで安価な自家製マウントメディアのレシピは、 材料表に記載されています。
11. 細かい絵筆を使用して、ウォッシュ3ウェルからペトリ皿に一度に1つずつセクションを移します。このステップはトリトンを除去し、セクションを平坦化するのに役立ちます。次に、シャーレからスライド上の液体にセクションを移します。
12. ペイントブラシを使用すると、スライド上で平らになるようにセクションを配置できます。P1000ピペットでスライドから余分な液体を慎重に取り除き、続いて真空吸引します。
    メモ:パスツールピペットの端にP200ピペットチップを追加して、真空吸引をより細かく制御します。
13. 余分な液体をすべてスライドから取り除いたら、トランスファーピペットを使用してすぐに各セクションに1滴の取り付け媒体を追加し、カバースリップをスライドの上にそっと置きます。マウントメディアを数分間広げてから、カバースリップの下から出てくる余分なマウントメディアを真空吸引で取り外します。
    メモ: マウントメディアを追加する前に、セクションを乾かさないでください。マウント媒体が添加される前に切片が乾燥し始めると、組織体積に影響を与え、正確なデータ収集を妨げる可能性があります。
14. カバースリップの4つの端をすべて透明なマニキュアでシールします。スライドを室温で30分間乾燥させた後、4°Cで平らに保管します。 イメージングする前に少なくとも2時間待つか、翌日にイメージングしてください。
    注:GFPおよびRFPに対する抗体で染色された切片は、マニキュアで完全に密封されていれば、イメージング前に最大2週間保存することができます。

4. 共焦点イメージング

メモ:このプロトコルは、特定の共焦点およびソフトウェアインタフェースの特定の詳細ではなく、さまざまな共焦点顕微鏡に広く適用可能な一般的な画像取得ガイドラインを提供します。

1. 10倍の対物レンズを使用して、イメージング用の個々の細胞を特定し、実験に関連する特定の脳領域またはサブ領域(例えば、視覚野の層5)に注意する。フォーカスノブを使用して、アストロサイト全体がセクション内に含まれているかどうかを試してみます。
2. より高い倍率のオイル対物レンズ(例:40倍、60倍、63倍)に切り替えて、細胞に焦点を合わせます。接眼レンズを覗き込みながら、フォーカスノブを使用してセルの上から下に移動します。
   1. セルを目視で検査して、セル全体がセクション内に含まれていることを確認します。セルが突然焦点が合わなくなり、セクションの端で切り取られた場合は、このセルを除外して別のセルを見つけます。
3. 共焦点顕微鏡の関連集録ソフトウェアを使用して、集録パラメータを調整して、適切な信号対雑音比と詳細レベルを取得します(512 x 512の解像度は、テリトリー解析に十分なディテールを提供し、画像取得時間を短縮します)。40倍の対物レンズを使用する場合は2倍ズームを使用し、60倍または63倍の対物レンズを使用する場合はズームを使用できません。
4. Z スタックの上限と下限を設定します。アストロサイト全体が確実に捕捉されるようにするために、zスタックの最初および最後の画像には、細胞の蛍光標識が含まれてはならない。適切なサンプリングを行うには、0.5 μm のステップサイズを使用します。

5. 画像解析

メモ:このプロトコルでは、市販の画像解析ソフトウェア(Imaris、 材料表を参照)を使用して画像解析を実行する手順について説明します。本ソフトウェアの他のバージョンは、ワークフローに若干の変更を加えて使用することができます。このプロトコルでは、MATLAB が凸ハル XTension ファイル (補足ファイル) を実行する必要もあります。

1. 解析を開始する前に、XT フォルダの rtmatlab サブフォルダにファイルを貼り付けて、凸 ハル XTension ファイル XTSpotsConvexHull.m をインストールします 。
2. Imaris ファイルコンバータを使用して、画像を '.ims' 形式に変換します。画像解析ソフトで画像ファイルを開き、3D表示ボタンを選択して 3D 表示モードで画像を表示します。
3. 解析の前に、セルを検査して、包含基準を満たしていることを確認します。
   1. セル全体が画像内に存在することを確認します(つまり、画像からセルの一部を切り取ってはなりません)。画像を回転させて、前端と後端を調べます。
   2. セルにセル本体が 1 つだけあることを確認します。「 スライス」(Slice) ボタンをクリックし、画面の左側にあるカーソルをドラッグして Z スタック内を移動し、ラベル付けされたセルにセル本体が 1 つだけ含まれていることを確認します。
   3. 同じ色でラベル付けされた隣接するアストロサイトと区別できる個々のアストロサイトがあることを確認します。
4. サーフェスの作成
   1. [3D 表示] ボタンをもう一度選択した状態で、青色の [新しいサーフェスの追加] アイコンをクリックして、新しいサーフェスを作成します。
      1. ソフトウェアウィンドウの左下に表示される「作成」タブで、「アルゴリズム設定」で「関心領域のみをセグメント化」ボックスと「オブジェクト-オブジェクト統計」ボックスのみがチェックされており、「作成プリファレンス」の「スライサービューで作成を開始」ボックスがオフになっていることを確認します。青い矢印をクリックして続行します。
         メモ: 関心領域は、関心のある細胞の外側の画像に追加の蛍光シグナルがない場合、必要でない場合があります。この場合、「 関心領域のみをセグメント化」の チェックを外したままにして、ステップ 5.4.3 に進みます。
   2. セルの周囲に関心領域を作成するには、サーフェス作成ツールの「サイズ」の下のボックスに寸法を入力するか、黄色のボックスの端をドラッグします(図2A)。青い矢印をクリックして続行します。
   3. 分析のためにドロップダウンリストから正しいソースチャンネル(例えば、チャンネル1、または蛍光セルフィルを含む チャンネル )を選択します。 「サーフェスの詳細」(Surfaces Details) ボックスの 値は、ソフトウェアによって決定され、イメージ取得パラメータに基づいて決定されます。この値が実験のすべてのサンプルで一定であることを確認します。 青い矢印 をクリックして続行します。
   4. しきい値(絶対強度)を調整するには、黄色のバーをドラッグするか、ボックスに値を入力して、グレーの表面がセルの境界を超えずにセルの信号をできるだけ多く塗りつぶします。少量の蛍光シグナルが表面の端に見えます(図2B)。青い矢印をクリックして続行します。
   5. サーフェス作成ツールの最後のパネルでは、ソフトウェアのデフォルトの「下限しきい値」である最小品質値を設定します。ドロップダウン リストで、[ボクセルの数 Img=1] が選択されていることを確認します。[しきい値の下限]の左側の電源ボタンだけが緑色(アクティブ)であることを確認します。右側の電源ボタンは赤色(非アクティブ)にする必要があります。ソフトウェアのデフォルト設定値の下限値は 10 です。これを変更せずに緑色の矢印をクリックして、サーフェスの生成を終了します。
   6. 新しく生成された表面を慎重に検査します。セルの一部ではないサーフェス部分を選択するには、鉛筆 編集 ツールをクリックし、[ 削除 ]オプションをクリックします。
   7. 残りのサーフェスピースを統一するには、ファネル フィルタ アイコンをクリックしてすべてを選択し、鉛筆 の編集 アイコンをクリックして、[統一 ]オプションをクリックします(図2C)。
      メモ: イメージファイルが大きいと、このプロトコルの以降の手順でソフトウェアがクラッシュすることがあります。この時点でファイルを保存することをお勧めします。
5. 表面に近い斑点を生成する
   1. オレンジ色の[新しいスポットの追加]アイコンをクリックします。新しいスポット(「スポット 1」など)を選択したら、「作成」タブで、「アルゴリズム設定」の「オブジェクト-オブジェクト統計」ボックスのみがチェックされ、「作成」環境設定の「スライサービューで作成を開始」ボックスがオフになっていることを確認します。 青い矢印をクリックして続行します。
   2. ドロップダウンリストから正しい ソース チャンネル(チャンネル1など)を選択し、ボックスに0.400 μmの 推定XY直径 値を入力します。 「背景減算」 ボックスのみが選択されていることを確認します。 青い矢印 をクリックして続行します。
      メモ: 0.400 μm は、63 倍、60 倍、または 40 倍の対物レンズを使用する 1024 x 1024 または 512 x 512 の画像に適しています。他のイメージング条件の場合、直径はイメージング条件に基づいて決定し、すべての解析を通して一定に保つ必要があります。適切な値を指定すると、すべての正の信号をカバーするのに十分なスポットが作成されますが、バックグラウンド信号にスポットは追加されません。
   3. スポット作成ツールの最後のパネルでは、ソフトウェアのデフォルトの「下限しきい値」である最小品質値を設定します。スポットの配置/分布に顕著な違いがない限り(例えば、染色の品質が悪いため)、この値は変わらないことを確認してください。緑色の矢印をクリックして、スポットの作成を終了します。
   4. スポットをよりよく表示するには、サーフェスを選択し、マルチカラーカラーツールをクリックして、サーフェスの透明度を変更します。[マテリアル]で、セル全体のスポット(リストの4番目から最後のマテリアル)が表示されるほどサーフェスを透明にするマテリアルを選択します(図2D、E)。
   5. 「スポット」(Spots) を再選択し、「フィルタ」(Filter) アイコンをクリックし、ドロップダウンリストから「サーフェスサーフェス = サーフェス X」(「サーフェス X」は解析対象のサーフェス (サーフェス 1 など)です)を選択します。「しきい値の下限」と「しきい値の上限」の両方の電源ボタンが緑色(アクティブ)になっていることを確認します。
      1. 最小距離を「下限しきい値」(下限しきい値) ボックスに -1.0 μm (サーフェスの内側からのスポットの距離) を入力し、「最大しきい値」ボックスに最大距離 0.1 μm (外部からの距離) を入力します。「選択範囲を新しいスポットに複製」ボタンをクリックして、サーフェスに近いスポットの生成を終了します。
         メモ: 距離の最小値と最大値は、対物レンズ、ズーム、解像度などの画像取得パラメータによって異なる場合があります。これらの数値は経験的に決定する必要があります。透明なサーフェスは、サーフェスの形状を正確に表すすべてのスポットを値がキャプチャするかどうかを判断するのに役立ちます。
6. 凸包を生成し、テリトリー測定を収集する
   1. ソフトウェアウィンドウの左上のパネルで、新しく作成したスポットが選択されていることを確認します(例:「 スポット 1選択['最短距離...]」)。歯車 ツール アイコンをクリックし、 次に凸ハル プラグインをクリックします。プラグインを一度だけクリックし、MATLABウィンドウが表示されてから消えるのを待ちます(これには数秒かかることがあります)。ソリッド船体が 3D ビューに表示されます。
   2. 左上のパネルで、スポットX選択 の凸状船体['最短距離...]を選択し、「スポットX選択」は新しく作成されたスポット(例:スポット1選択)を選択し、 船体 をクリックして選択します(図2F)。
   3. グラフの [統計] アイコンをクリックし、[選択] タブを選択し、上部のドロップダウン リストから [特定の値] が選択されていることを確認し、下部のドロップダウン リストから [ボリューム] を選択します。船体の体積を記録します。ファイルを保存し、次の画像に進みます。
7. 異なる蛍光標識を有する隣接する細胞の領域重複体積の測定
   注:プロトコルのこのセクションは、サンプルに異なる蛍光標識を発現する隣接するアストロサイトが含まれている場合(例えば、アストロサイト1はGFPのみを発現し、アストロサイト2はRFPのみを発現する)使用することができる。この標識は、先に記載した^9、10 のようなウイルスまたは遺伝的戦略を用いて達成された(図3A)。
   1. ステップ5.4~5.6で詳述した手順を使用して、各アストロサイトのサーフェス、サーフェスに近いスポット、および凸包を作成します(図3B)。
   2. 「スポット 1 選択の凸状ハル...」を選択し、鉛筆の「編集」アイコンをクリックし、「マスク選択」をクリックします。「マスクチャンネル」ウィンドウで、チャンネル1(またはアストロサイト1を表すチャンネル)が選択されていることを確認し、マスクオプションを適用する前に複製チャンネルの横にあるボックスがオンになっていることを確認します。 「OK」をクリックして、チャネルマスク済み CH1 を作成します。
   3. スポット2選択の凸状船体で... を選択し、鉛筆編集アイコンをクリックして、マスク選択をクリックします。マスクチャンネルウィンドウで、ドロップダウンメニューからチャンネル2(またはアストロサイト2を表すチャンネル)を選択し、マスクを適用する前に複製チャンネルの横にあるボックスがオンになっていることを確認します。[OK]をクリックして、チャネルマスクCH2を作成します(図3C)。
   4. 画面上部の Coloc ボタンをクリックし、Coloc ツールを使用して、マスクされた 2 つのチャネルの共同ローカリゼーション チャネルを作成します。チャネルAをチャネル3(マスクされたCH1)に設定し、チャンネルBをチャネル4(マスクされたCH2)に設定します(図3D)。
   5. 両方のチャンネルの黄色の ヒストグラムバー を左にドラッグします。下の スライスビュー を使用して、グレーで表示される共局在化信号を観察します。2つの細胞の蛍光シグナルは実際には共局在化していないため、 閾値 を左に移動して、細胞間接触の点で偽の共局在が現れ始めるようにする必要があることに注意してください。
   6. 右側の [Colocチャンネルの構築 ]をクリックしてプロセスを完了します。3D ビューをクリックすると、標準の 3D ビュー に戻ります。 コローカリゼーション結果 チャンネルがグレーで表示され、表示調整ボックスに表示されます。
   7. 5.4 ~ 5.7 で説明されている手順を使用して、共局在化結果チャネルのサーフェス、サーフェスに近いスポット、および凸包を作成します (図 3E,F)。
   8. 凸包の体積を記録します。これは、テリトリーオーバーラップボリュームです。この数値を1つのアストロサイトのテリトリー体積で割って、テリトリーオーバーラップの割合を計算します。一方のアストロサイトが他方に対して遺伝的に操作されている場合は、対照型または野生型アストロサイトを選択する。

図 1 に、このプロトコルの主要なステップとワークフローの概略図を示します。 図 2 は、画像解析ソフトウェアを使用してサーフェスを生成し、サーフェスに近いスポットを生成し、凸包を生成するための主要な手順のスクリーンショットを示しています。 図3は 、アストロサイトの領域の重複/タイリングを決定するためのこの手法の適用を示しています。 図4において、以前に公開された原稿9 からの代表的な結果は、このプロトコルの適用を実証する。図 4A および 図4Bにおいて、アストロサイト富化細胞接着分子hepaCAMのノックダウンは、アストロサイト領域容積を有意に減少させる。図 4C および 図4Dでは、ダブルマーカー(MADM)によるモザイク分析を使用して、まばらなモザイク標識と同時遺伝子改変をマウス皮質に導入した。MADMでは、野生型アストロサイトが赤色蛍光タンパク質(RFP)を発現し、 ヘパカム ノックアウトアストロサイトが緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するマウスが作製された。上述のプロトコルを用いて、隣接するRFPとGFPアストロサイト対との間の領域重複の割合(WT:KO)を計算した。対照として、これは 、ヘパカム の遺伝子改変を有さないマウスにおける隣接するRFPおよびGFPアストロサイト対(WT:WT)と比較した。WT:KOアストロサイト対は、WT:WTアストロサイト対と比較して、領域重複体積の割合が有意に増加したことを示した。まとめると、これらの結果は、hepaCAMが正常なアストロサイト領域容積およびアストロサイトタイリングに必要であることを実証する。

図1:アストロサイトの領域体積を分析するためのワークフローの概要 (A)このプロトコルでは、アストロサイトのスパースまたはモザイク蛍光標識を有するマウスが必要である。(B)マウスを灌流し、脳を切除し、処理し、凍結する。(C)凍結した脳をクライオスタットを用いて切片化し、(D)自由に浮遊する組織切片を採取する。(E)切片化後、浮遊組織切片を免疫組織化学によって染色し、次いで(F)スライドに取り付ける。(g)装着された組織切片内のアストロサイトは、共焦点顕微鏡を用いて画像化される。(H)最後に、画像化された細胞の領域体積は、画像解析ソフトウェアを使用して定量化される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:アストロサイト領域容積の画像解析手順における重要なステップ。 (A)解析手順から画像内の他のシグナルを除外する関心領域ボックスを有する細胞のビュー。(B) 信号 (赤) を使用したサーフェス作成 (グレー) の許容可能な相対しきい値。(C) メインセルが選択された完成したサーフェス (黄色)。セルではないサーフェスの他の部分は削除されます (赤)。(D)斑点が作成された半透明の表面。(E)表面に対するスポットの許容可能な分布を示すために作成されたスポットを有する半透明表面のクローズアップ。(F)最終的な凸包。スケール バー = 20 μm 。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:アストロサイト領域オーバーラップ解析における重要なステップ(A)異なる蛍光マーカーを発現する2つのアストロサイトの代表的な画像、GFP(グリーン)およびRFP(マゼンタ)。(B)各アストロサイトに対する凸包の生成。(C) マスクされたGFPおよびRFPチャンネルのビュー(元のチャンネルは削除)。(D)「Coloc」ツールを使用して「共局在化結果」チャネルを作成するための閾値化の例。「共局在化」信号は灰色で表示されます。(E) マスクされた 2 つのチャンネルのビュー。(F)テリトリーオーバーラップボリュームを表す「共局在化結果」チャネル(灰色)の凸包の回転図。スケール バー = 20 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

(A)出生後21日目に野生型CD1マウスの視覚野において、mCherry-CAAX(シアン)および対照shRNA(shScramble)またはhepaCAM(shHepacam)を標的とするshRNAを発現するアストロサイト。アストロサイトの領域は赤で囲まれています。(B)hepaCAMの喪失は、アストロサイトの領域体積を有意に減少させる。データ ポイントは、個々のマウスの平均を表します。エラーバーは、ネストされたt検定±です。(c)出生後21日目にマウス皮質内に隣接するアストロサイトがGFP(緑色)またはRFP(マゼンタ)を発現する。MADM9 WT:WTマウスにおいて、両アストロサイトは野生型である。MADM9 WT:KOマウスでは、緑色のアストロサイトは野生型であり、マゼンタのアストロサイトはヘパカムに対してヌルである。テリトリーオーバーラップボリュームは青色で表示されます。(MADM9 WT:WT遺伝子型:MADM9TG/GT;EMX-CreTg/0;ヘパカム+/+。MADM9 WT:KO 遺伝子型: MADM9TG/GT;EMX-CreTg/0;ヘパカム+/-)。(D)テリトリーボリュームオーバーラップの割合の定量化。データ ポイントは、個々のマウスの平均を表します。エラーバーは、ネストされたt検定±です。スケールバー = 20 μm。この図のパネルは、出版社の許可を得てBaldwinら9から転載されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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