複数の蛍光染色および組織クリアリングアプローチを使用した3Dパターンでの毛状およびグラブラス皮膚神経支配の実証

サマリー

組織切片の厚さは、皮膚神経支配の形態学的研究を制限した。本プロトコールは、共焦点顕微鏡下で厚さ300μmの組織切片中の皮膚神経線維を可視化する独自の組織透明化技術を記載する。

要約

皮膚神経支配は末梢神経系の重要な部分です。皮膚神経線維の研究は急速に進歩しているが、それらの分布的および化学的特性の理解の大部分は、薄い組織切片に対する従来の組織化学的および免疫組織化学的染色から来ている。組織透明化技術の開発により、より厚い組織切片上の皮膚神経線維を見ることが可能となった。本プロトコールは、ラット後足の足底および背部皮膚から300μmの厚さで組織切片に複数の蛍光染色を記載する、2つの典型的な毛深いおよびグラブラスな皮膚部位である。ここで、カルシトニン遺伝子関連ペプチドは感覚神経線維を標識し、一方ファロイジン及びリンパ管内皮ヒアルロン酸受容体1は血液及びリンパ管をそれぞれ標識する。共焦点顕微鏡下では、標識された感覚神経線維は、より長い距離で完全に追跡され、深い皮膚層では束状に、表層ではフリースタイルで走った。これらの神経線維は血管と平行に走ったり、血管を囲んだりして、リンパ管は毛むくじゃらでグラブラスな皮膚に3次元(3D)ネットワークを形成しました。現在のプロトコルは、方法論の観点から既存の従来の方法よりも皮膚神経支配を研究するためのより効果的なアプローチを提供する。

概要

皮膚は、環境への重要なインターフェースとして機能する体内最大の器官であり、多くの神経線維^1,2,3によって密に神経支配されている。皮膚神経支配は、全マウント皮膚および組織切片^4,5,6に対する染色など、様々な組織学的方法を用いて以前に広く研究されてきたが、皮膚神経線維の詳細な効果的な実証は依然として課題である^7,8。これを踏まえ、本プロトコールは、厚い組織切片において皮膚神経線維をより明確に示すための独自の技術を開発した。

切片の太さによる限界のため、神経支配皮膚神経線維の観察は、取得した画像情報からカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)神経線維と局所組織・臓器との関係を正確に描くほど正確ではない。3D組織クリアリング技術の出現は、この問題を解決するための実行可能な方法を提供する^9,10。組織クリアリングアプローチの急速な発展は、近年、組織構造、器官全体、ニューロン突起、および動物全体を研究するための多くのツールを提供してきました¹¹。透明な皮膚組織は、共焦点顕微鏡によってはるかに厚い部分で画像化され、皮膚神経線維を視覚化するためのデータを得ることができる。

現在の研究では、ラット後足の足底および背部皮膚を、毛状およびグラブラス性皮膚の2つの標的部位として選択した³、^4、7。より長い距離で皮膚神経線維をトレースするために、皮膚組織を免疫組織化学的および組織化学的染色のために300μmの厚さでスライスし、続いて組織透明化処置を行った。CGRPは、感覚神経線維^12、13を標識するために使用した。さらに、組織背景上の皮膚神経線維を強調するために、ファロイジンおよびリンパ管内皮ヒアルロン酸受容体1(LYVE1)をさらに用いて、それぞれ血管およびリンパ管を標識した^14、15。

これらのアプローチは、皮膚神経線維の高解像度ビューを実証し、また、皮膚の神経線維、血管、およびリンパ管間の空間的相関を視覚化するために適用することができる直接的な方法を提供し、正常な皮膚の恒常性および病理学的条件下での皮膚の変化を理解するためのはるかに多くの情報を提供し得る。

プロトコル

本研究は、中国医学科学院鍼灸研究所倫理委員会(参照番号D2018-04-13-1)により承認された。すべての手順は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイド(National Academy Press、Washington、D.C.、1996)に従って実施されました。3匹の成体雄ラット(Sprague-Dawley、体重230±15g)を本研究に使用した。すべての動物は、温度と湿度を制御した12時間の明暗サイクルで飼育され、食物と水への自由なアクセスが許されました。

1. 灌流とサンプル調製

1. 250mg/kgのトリブロモエタノール溶液( 材料表参照)をラットの腹腔内に注入し、安楽死を誘発する。
2. 呼吸が止まったら、ステンレス製の外科用はさみを使用してラットの胸腔を開きます。20 G 針を使用して、左心室^{13 を 3} mL/分の速度で 100 mL の 0.9% 正常生理食塩水で灌流し、続いて 0.1 M リン酸緩衝液 (PB、pH 7.4) に 250 ~ 300 mL の 4% パラホルムアルデヒドを注入します (図 1A、B)。
3. 灌流後、メスを使用して背骨と足裏の皮膚を後足から取り除きます。
   1. 凍結切片を必要とするサンプルについては、組織を0.1M PB中の4%パラホルムアルデヒドに2時間固定する。その後、0.1M PB中の25%スクロース中の組織を4°Cで24時間以上凍結保護します
   2. 組織透明化を必要とする厚いセクションを有するサンプルの場合、1xリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)中の4%パラホルムアルデヒド中の組織を2時間後固定する。その後、4°Cで1x PBSで組織を凍結保護します(図1C-E)。

2. CGRP、ファロイジン、LYVE1によるトリプル蛍光染色とそれに続く組織透明化処理

注:CGRP、ファロイジンおよびLYVE1によるトリプル蛍光染色を適用して、組織透明化処理後の厚さ300μmの組織切片上の毛状およびグラブラスな皮膚の神経線維、血管、およびリンパ管を明らかにした。

1. アガロースが溶解するまで電子レンジで2分間加熱することにより、1x PBS中の2%アガロースを調製する(材料表を参照)。
2. 洗浄後、皮膚組織を37°Cで2%アガロースに包埋し、冷却用のアイスボックス内に置きます(図1F、G)。
3. 取り付けた組織を氷水で振動ミクロトームに固定し、横方向に500μmの厚さでスライスする。振動スライサーを設定し、スライスを終了するには、速度 0.50 mm/s および振幅 1.5 mm のパラメータを使用します (図 1H-K)。
4. スライス後、切片からアガロースを取り出し、1x PBS(pH 7.4)を含む6ウェルプレートに保存します(図1L)。
5. 組織切片を1x PBS(TriX-PB)中の2%Triton X-100の溶液中で4°Cで一晩インキュベートする。 以下の手順については、 図 2 を参照してください。
6. 組織切片をブロッキングバッファーに入れ、シェーカー上で72rpmで4°Cで一晩回転させる。
   注:ブロッキングバッファー組成は、1x PBS中の10%正常ロバ血清、1%Triton-X 100、および0.2%アジ化ナトリウムです( 材料表を参照)。
7. マウスモノクローナル抗CGRP(1:500)及びヒツジポリクローナル抗LYVE1抗体(1:500)の一次抗体を微量遠心管内の希釈緩衝液( 材料表参照)に含む溶液に組織切片を移し、シェーカー上で4°Cで2日間回転させた。
   注:希釈バッファー組成は、1x PBS中の1%正常ロバ血清、0.2%Triton-X 100、および0.2%アジ化ナトリウムです。
8. 組織切片を室温の洗浄バッファーで2回洗浄し、次いで洗浄バッファー中で4°Cで一晩シェーカーに保管する。
   注:洗浄バッファー組成は、0.1M PB(pH 7.4)中の0.2%Triton-X 100です。
9. 翌日、ロバ抗マウスIgG H&L Alexa-Flour488(1:500)およびロバ抗ヒツジIgG H&L Alexa-Flour405(1:500)、ならびにAlexa-Flour594ファロイジン(1:1000)( 材料表参照)の二次抗体を含む混合溶液に組織切片を微小遠心管に移し、シェーカー上で72rpmで4°Cで5時間回転させる。
10. 6ウェルプレートの組織切片を洗浄バッファーで室温で1時間、2回洗浄する。組織切片をシェーカー上の洗浄バッファーに入れて4°Cで一晩保管する。
11. 組織切片を組織透明化試薬( 材料表を参照、その体積は試料体積の5倍以上であった)に移し、シェーカー上で60rpmで室温で1時間穏やかに回転させた。
    注:この治療後、組織切片は透明になる(図2B)。
12. クリアしたティッシュをスライドに取り付け、スペーサーでティッシュを丸め、新鮮なティッシュクリアリング試薬とカバースリップで隙間を貼り付けます。

3. 従来のアプローチに従ったCGRP、ファロイジン、LYVE1によるトリプル蛍光染色

注:比較として、従来の技術に従って厚さ30μmの組織切片に対して同様の染色を実施した。

1. ミクロトーム上で組織切片を横方向に30μmでスライスし、スライドに取り付けます。
2. 0.1 M PBに3%正常ロバ血清および0.3%Triton X-100を含むブロッキング溶液を加え、室温で30分間切片をインキュベートする。
3. ブロッキング溶液を除去し、切片をマウスモノクローナル抗CGRP(1:500)およびヒツジポリクローナル抗LYVE1抗体(1:500)の一次抗体を含む溶液と共に4°Cで一晩希釈緩衝液中でインキュベートする。
4. 翌日、組織切片を0.1M PB(pH 7.4)で3回洗浄し、ロバ抗マウスIgG H&L Alexa-Flour488(1:500)およびロバ抗ヒツジIgG H&L Alexa-Flour405(1:500)、ならびにAlexa-Flour594ファロイジン(1:1000)の二次抗体を含む混合溶液を切片に加え、室温で1時間インキュベートする。
5. 顕微鏡観察の前に、切片を0.1M PB(pH 7.4)で3回洗浄し、50%グリセリンのカバースリップで覆う。

4. イメージングと解析

1. 染色した試料を蛍光顕微鏡で観察し、共焦点顕微鏡で画像を撮影します。
2. 厚さ300 μmの各セクションから、それぞれ10 μmフレームの30枚の画像(Zスタック)をキャプチャし、共焦点顕微鏡システムのイメージプロセッサを使用して単一のピントが合った画像を統合します( 材料表を参照)。
   1. 3次元(3D)解析用の共焦点セットアップの画像処理ソフトウェアで、次の手順を実行します: [焦点面の開始]|焦点面の終了|の設定ステップサイズ|を設定する深度パターン|を選択画像キャプチャ|Zシリーズ。
      注:青色蛍光シグナルの励起波長と発光波長は、それぞれ401nmと421nmでした。緑色蛍光シグナルの励起波長および発光波長は、それぞれ499nmおよび519nmであった。赤色蛍光シグナルの励起波長および発光波長は、それぞれ591nmおよび618nmであった。152μmは共焦点ピンホール(10倍対物レンズ、NA:0.4)の直径である。画像キャプチャ解像度は1024×1024ピクセルであった。
3. 従来のサンプル(ステップ3)では、厚さ30μmの断面から1μmフレームに30枚の画像(Zスタック)をキャプチャし、さらにこれらの画像を上記のように処理します(ステップ4.1-4.2)。
4. 画像処理システムによる3D再構成のパターンで画像を実演する。
5. Zスタック共焦点画像をImaris 9.0(細胞イメージングソフトウェア、 材料表を参照)にインポートして3D再構成を実行し、汚れの強度に基づいてサーフェスレンダリングを作成する: 新しいサーフェス|追加するソースチャンネル|を選択「サーフェスの詳細」(Surfaces) |の「スムーズ」(smooth) オプションでパラメータを決定します。「絶対強度」のしきい値オプションのパラメータを決定|サーフェスの分類|終了です。
6. 陽性神経線維の表面積のデータを細胞イメージングソフトウェアで取得します。 レンダリング イメージ |を選択します。統計|詳細な|特定の値|ボリューム。

結果

トリプル蛍光染色後、神経線維、血管、リンパ管を、毛むくじゃらの皮膚およびグラブラス皮膚において、それぞれCGRP、ファロイジン、およびLYVE1で明確に標識した(図3、4)。クリアリング治療により、CGRP陽性神経線維、ファロイジン陽性血管、およびLYVE1陽性リンパ管をより高い深さで画像化し、皮膚の完全な構造情報を取得することができます(図3)。これらの組織構造を3Dパターンでさらに再構築すると、その分布を追跡しやすくなりました。CGRP陽性神経線維が皮下組織と真皮を通って表皮に伝わることが示された。これらの神経線維は皮下組織で束となって走り、真皮内で分岐し、表皮で終端した(図3)。これに対し、ファロイジン陽性血管およびLYVE1陽性リンパ管は、皮下組織および真皮に分布している(図3)。一般に、CGRP陽性神経線維は、血管およびリンパ管に平行に走るか、または血管を囲...

ディスカッション

本研究は、皮膚神経支配をよりよく理解するために、より厚い組織切片に免疫蛍光を用いて、より厚い組織切片に免疫蛍光を用いて、皮膚神経支配をよりよく理解することによって、毛状およびグラブラス皮膚における皮膚神経線維の詳細な実証を提供する。抗体インキュベーション時間は最大1〜2日で、一晩の洗浄プロセスが重要です。これら2つの重要なステップは、厚い切片の免疫蛍光染色効果に直接影響します。抗体の選択からさらなる問題が提起されたが、そのすべてが厚い切片に適しているわけではない。我々は、分子量の小さい抗体が、厚い切片の免疫蛍光染色に理想的であるかもしれないと推測している。したがって、抗体選択の難しさは、このアプローチの主要な限界である。本研究は、ラットの毛むくじゃらで無毛の皮膚上の血管、リンパ管、神経の分布の違いを観察した。人間にとって、皮膚の構造はげっ歯類の構造とは非常に異なります。次のステップでは、組織クリアリング技術を使用して人間の皮膚を観察し、研究することを楽しみにしています。

これまでの研究では、皮膚神経線維^...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1x リン酸緩衝生理食塩水	Solarbio Life Sciences	P1020	pH 7.2-7.4, 0.01 Mol
2,2,2-トリブロモエタノール	Sigma Life Science	T48402-5G
共焦点蛍光顕微鏡	オリンパス株式会社	Fluoview FV1200
ロバ 抗マウス IgG H&L アレクサ-小麦粉488アブ	カムplc。	ab150105
ロバ反ヒツジIgG H&L アレクサ-小麦粉405	カムplc。	ab175676
EPチューブ	錫NESTバイオテクノロジー株式会社	615001	1.5mL
凍結ステージスライド式ミクロトームシステム	ライカバイオシステム	CM1860
Imaris Software	Oxford Instruments	v.9.0.1
IRIS標準シザー	WPI(ワールド・プレシジョンズ社製)
503242 iSpacer	SunJin Lab co. (株)	IS005
マイクロ鉗子-Str	RWD	F11020-11
マウスモノクローナル抗CGRP抗体	Santa cruz biotechnology, Inc.	sc-57053
中性緩衝ホルマリン	Solarbio Life Sciences	G2161	10%
正常ロバ血清	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-12	10 mL
蠕動ポンプ	Longer Precision Pump Co., Ltd	BT300-2J
ファロイジン Alexa-Fluor 594	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A12381
ラピクリア 1.52ソリューション	SunJin Lab co.	RC152001	10 mL
レギュラー アガロース	Gene Company Limited	G-10
SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str	RWD	F13038-12
ヒツジ ポリクローナル抗LYVE1抗体	R&Dシステムズ株式会社	AF7939
6ウェルプレート	コーニング社	3335
アジ化ナトリウム	シグマライフサイエンス	S2002	25 g
ショ糖	シグマライフサイエンス	V900116	500 g
瞬間接着剤	Henkel AG & Co.	Pattex 502
サージカル ハンドル	RWD	S32003-12
Triton X-100	Solarbio Life Sciences	9002-93-1	100 mL
ウレタン	Sigma Life Science	U2500	500 g
VANNAS スプリングハサミ	RWD	S1014-12
振動ミクロトーム	ライカ バイオシステムズ	VT1200S