循環器疾患大型動物モデルにおける心臓の解剖技術と組織学的サンプリング

サマリー

複雑な解剖学的構造のため、心臓サンプルの一貫して再現可能な解剖および採取プロトコルを実装するのは難しい場合があります。この原稿は、いくつかの標準的な心臓解剖プロトコルの重要な要素を提示し、肉眼検査アプローチと組織病理学的検査に一般的に使用されるサンプリング部位の両方を強調しています。

要約

標準的な肉眼検査とサンプリングは、大型動物で実施された心血管疾患の実験的研究の再現性と成功における重要な要素です。心臓の複雑な解剖学的構造、種間の違い、代償的および病理学的反応の種類を考慮すると、一貫したプロトコルを実装することは困難です。複数の解剖プロトコルの利用は通常、プロセクターの経験に合わせて調整されており、個人的な好みは引き続き実験的および観察者間の変動の原因となっています。ここでの目的は、心血管疾患のモデルとして、いくつかの一般的に使用される種(犬、豚、反芻動物、猫を含む)における心臓の主な解剖学的特徴とランドマーク、解剖プロトコル、および組織学的サンプリング標準を提示することです。

ここでは、2つの標準的な総検査プロトコルを示します。第一に、心臓と大血管を通る生理的な血流方向に従う流入流出法(犬、反芻動物、豚で頻繁に使用される)、第二に、4室解剖法(猫に例示)である。どちらの技術も、特定の実験状況においてあらゆる種に適応することができる。サンプリングプロトコルには、関心のあるすべての領域(洞房結節、心室、心室中隔、心房、弁、大動脈)が含まれ、適切に実施されれば、実験研究の再現性と信頼性の両方が向上します。

概要

複雑な解剖学的構造と初期の厳密さのために、心臓壁の厚さの評価を妨げる可能性があるため、心臓の肉眼検査は困難であり、いくつかの技術関連または解釈エラーが発生しやすくなります。これは、種間形態学的変異と、多くの臨床的、主要な心臓病(冠状動脈性心臓病、線維症、動脈炎、およびアミロイドーシスの初期症例を含む)が、本質的に組織学的病理である全体的な変化と関連していないという事実によって増幅されます。標準化された解剖および組織学的サンプル採取プロトコルは、観察者間の一貫性をもたらすと同時に、心血管疾患の実験的研究の比較可能性と再現性をもたらすことができます。

サンプルは、2匹の犬(Canis lupus familiaris)(3歳のオスのフレンチブルドッグと8歳のメスの雑種)、ネコ(Felis catus)(6歳、オスのヨーロッパショートヘア)、飼いならされたブタ(Sus scrofa domestic us)(1歳、オスのラージホワイト)、および牛(Bos taurus)(生後2か月のメスのホルスタイン)から収集されました。選択された種のそれぞれは、異なる疾患の心血管モデルとして特に使用されています。たとえば、犬は不整脈モデリングに適したモデルです。猫は肥大型心筋症(HCM)に好まれます、なぜならそれはHCMの有病率が最も高い種だからです。ブタは急性心筋梗塞のモデルとして使用されます。そして反芻動物は牧草地¹¹で容易に見つけることができる毒素への彼らの暴露のために中毒のモデルとして使用されます。

この原稿では、実験的心血管疾患における心臓の肉眼的および組織学的検査を改善するように設計された、心臓の1つの剖検プロトコルと2つの解剖プロトコルが提示されています。記載されているプロトコルは、獣医学の教科書1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12、ジャーナル文献^3,13,14、公式文書¹⁵、および^{ウェビナー16}からの情報に基づいて開発されました。^、17。この研究で使用されたサンプルは、定期的な剖検診断のためにUSAMVクルージュナポカの病理学部に提出された死体から採取されました。

プロトコル

実験プロトコルは生命倫理協定(311年から第2022号)を受け、国内(43年の法律第2014号)とヨーロッパ(63年のEU指令第2010号)の両方の法律に準拠して、クルジュナポカ農業獣医大学の生命倫理委員会によって承認されました。このプロトコルで使用されるすべての材料と機器の詳細については、 材料の表 を参照してください。

1.剖検プロトコル

注:実行した場合のアクセスが容易であるため、提示されたすべての種に同じ剖検プロトコルを使用することをお勧めします^2,12。次の手順は、中型犬で行われる剖検を表しています。さまざまな被験者に剖検を行う際の手順を適応させます。

1. 被験者の体重を量り、左側の剖検台に置きます(図1A)。被験者の外部検査に進みます(皮膚と粘膜の検査と触診、色、一貫性、体積のすべての変化に注意してください)。
2. ナイフ(またはメス)を使用して、右腋窩を7 cmの切開を行います(図1A)。
3. 肛門大腿骨接合部の位置を確認します(図1A、B)。ナイフでカプセルを開けます。大腿骨頭の靭帯を切断します(図1B)。
4. ナイフを使用して、腋窩頭蓋の皮膚切開を下顎結合まで、尾側を会陰まで伸ばします(図1B)。
5. メスで皮膚を取り除き、腹側の正中線から胸壁と腹壁を椎骨横断突起のレベルまで露出させます(図1B)。
6. メスと鉗子を使用して、腹壁、腹尾から右肋骨弓までのフラップを作成します。ハサミで腹腔を開きます-右心気症の尾側に従います(図1B)。
7. 切開部を右傍腰椎領域に沿って尾方向に外側腸骨稜まで伸ばします。その後、リネアアルバの恥骨挿入まで切開を延長します。
8. 簡単に言えば、腹部臓器をその場で調べます(臓器の色、一貫性、体積、および位置の変化に注意することによって)。
9. メスと鉗子を使用して、横隔膜の最高点に穴を開けます(図1B)。
10. 骨切断鉗子を使用して2つの縦断面を持つ右胸郭を取り外すことにより、胸腔に入ります。肋骨の胸骨傍軟骨部分を切片化する。次に、肋骨の背側セグメントを、肋骨関節の近位部に切片化します(図1C)。
11. 心臓を その場で 調べます(図1C)。サイズ、位置、色、隣接する組織との接続、および触診によって、一貫性の変化に注意してください⁹。
    注:血栓症または先天性心疾患が存在する場合は、心臓を その場で 解剖する必要があります(このアプローチにより、大血管を完全に検査できます)。
12. はさみを使用して、心臓の基部から頂点までの縦断面で心膜腔を調べて開きます。心膜腔と心外膜を調べます(色、一貫性、および体積の変化に注意してください)¹²。
13. ハサミで心臓を解放し、大動脈、肺幹、および両方の大静脈の横断切片を生成します。クリスタターミナルを保存するために、右心房への入り口の少なくとも1 cm上の上大静脈をセクションします^11,13。
14. 臓器の輪郭、心外膜の外観、心外膜の透明度による心筋の外観、および大きな血管の外観を調べます(図2A)。
    注:一般に、心膜の開放と検査には、種間でいくつかの違いがあります。心膜腔の検査は、心膜内容物全体の心膜の透明性による外部検査および評価から始まる^1,2。猫または犬では、心膜には通常、約0.25 mL / kgの薄く、透明で、半透明から淡黄色の液体が含まれています⁹。病理学的滲出液がある場合は、滅菌注射器または真空管で採取する必要があります。

2.解剖プロトコル

注:心臓にはいくつかの剖検技術が使用されており、それぞれにいくつかの利点があります。このプロトコルでは、最も使用されている2つの技術が選択されました:1)弁と心内膜のより良い検査を可能にし、^{ほとんどの種2}、¹¹、¹²、¹⁶に使用されるプロトコルである「流入流出法」^、および2)猫または小型犬に通常使用される「4室解剖」/「心エコー検査面」技術^1、17.

1. 心臓解離のための「流入流出法」2,11,12,16
   1. 心房を上にして心臓を置きます(図2A)。
   2. はさみと歯のない鉗子を使用して、尾大静脈から右心房に沿って広く切り取ります(図2B)。右耳介付属器への切断を続け、 クリスタ終末/洞房結節(SA結節)を露出させます。三尖弁を背側から調べます。
   3. 右心房から右心室と心室中隔の間の接合部までのセクションを切り取ります(図2C)。右房室弁を表示します。
   4. 心室中隔に沿って右心室自由壁を切片化する。肺動脈幹の起点までセクションを続けます(図2C、D)。
   5. 脊索腱を含む右房室弁と乳頭筋を徹底的に調べます(図2D)。脊索腱を切る。
   6. 鉗子を肺幹に通し、体幹を縦方向に切断します(図2E)。肺流出路、肺幹の起点、および半月弁を調べます。
   7. 左心房を肺静脈から左耳介の先端まで切り取ります(図2F)。背側から二尖弁(僧帽弁)を調べます。
   8. 心室中隔を下に向けて心臓を置きます(図2F)。心室の基部から心尖までの心室自由壁に大きな切開を行います。左房室弁を完全に表示します。
   9. 左房室弁の尖端の 脊索腱 を切断します。
   10. 鉗子を左心室流出路に通し、大動脈を開くためのガイダンスとして使用します(図2G)。
   11. 生理食塩水を使用して、すべての血栓を取り除きます。すべての血栓が除去されたら、心臓重量を評価し、体重または標準的な心臓重量表と比較します(表1)^11,13。
   12. 心臓の重さを量る。
   13. SA結節のみが対象点である場合は、左心室検査後、心臓全体を10%中性緩衝ホルマリン(NBF)に24時間置き、右心房をトリミングして クリスタ終末をサンプリングします。
       注:この技術により、左心室と右心室を簡単に理解できます。左右の心室壁の厚さの比率は3:1で、種や品種によってわずかな違いがあります。動物の胎児の心臓の場合、比率は1:1¹²です。

3. 組織学のためのサンプリングプロトコル¹⁶

1. メスを使用して、右心房、三尖弁、および右心室自由壁を含む2つの縦方向の平行なカット(約5 mm間隔)を作成します(図2I)。
2. 左心房、僧帽弁、背側乳頭筋、左心室を含む2つの縦方向の平行なカット(約5 mm間隔)を作成します(図2H)。
3. 心臓の背側上3分の1内で、心室中隔、右心房、大動脈、大動脈弁、三尖弁を含む線に沿って心臓の基部を横方向に切断します(図2J)。
4. 大動脈の基部と心室中隔を含む2つの縦方向の平行なカットを行います(図2J)。
5. クリスタターミナルの周りの右心房をトリミングし、クリスタの縦軸に横方向(約3〜4 mm間隔)を向けたいくつかの平行セクションを提供して、6個のSAノードを取得します(図3、図4I、および図5H)。
6. 得られた組織を組織学的カセットでトリミングします。
   注:推奨されるブロッキングプロトコル:ステップ3.1.-組織学的ブロック1(図6はこのブロックの結果のスライドを示しています)、ステップ3.2.-組織学的ブロック2(図7はこのブロックの結果のスライドを示しています)、ステップ3.4.-組織学的ブロック3(図8はこのブロックからの結果のスライドを示しています)、ステップ3.5.-組織学的ブロック4(図9はこのブロックからの結果のスライドを示しています)。
7. 組織を10%NBFに少なくとも48時間浸します。

4.冠状動脈のサンプリング3,10,14

1. 鉗子とメスを使用して、心臓傍円錐溝から冠状動脈を解剖します(図4K)。冠状動脈を10%NBFで一晩固定します。
2. 必要に応じて、8%ギ酸と塩酸の1:1混合物で適切に脱灰します。
3. 3mm間隔で複数の横方向のカットを行います。切片をカセットに入れ、埋め込むまで10%NBFに入れます。
   注:ブタは、特に冠状動脈性心臓病に関しては、人間の心臓モデルとして使用できます。したがって、冠状動脈の補足サンプルおよび組織学的切片が推奨される3,10,14。

5. 心臓の「4室」/「心エコー面」解剖技術 ^1,17

注:4室解剖技術は、標準図¹を得るために心臓の基部から頂点まで切断することからなる。「4チャンバー」技術は、固定組織に最適です。

1. 心臓全体を10%NBFに少なくとも48時間入れます。
2. 心臓を10%NBFで少なくとも48時間固定した後(図10A)、2つの歯のないまっすぐな解離鉗子を配置し、1つは頭蓋大静脈-右心房-三尖弁-右心室に、もう1つは肺静脈-左心房-僧帽弁-左心室に通します(図10B)。
3. 鉗子の腕の間のスペースを、心臓の基部から頂点までの切断刃のガイダンスとして使用します(図10C)。手順5.2で説明したセクションから約5mm離れた追加の縦セクションを提供します。大動脈を含む心臓セグメント。
4. 横切開で、心臓基部を頂点から完全に分離します。各組織セグメントを組織学的カセットに入れます。
   注:推奨されるブロッキングプロトコル:心臓頂点-組織学的ブロック5(図11Aはこのブロックから得られたスライドを示す)、心臓基盤-組織学的ブロック6(図11Bはこのブロックから得られたスライドを示す)。
5. 埋め込むまでカセットを10%NBFに入れます。すべての心臓サンプルを10%NBF(組織の体積の10倍以上)で固定し、パラフィンワックスで日常的に処理し、4μmの厚さで切片化し、前述のプロトコル¹⁰に従ってヘマトキシリンおよびエオジン染色(H&E染色)で染色します。
   注:心筋炎が疑われる場合は、「新鮮な心臓組織の一部を、微生物学的およびウイルス学的研究のために滅菌手術材料と滅菌サンプル容器を使用して無菌条件下で保持する必要があります」¹³。

6.写真の文書化

注:写真の記録は、剖検検査のオプションステップです。ただし、写真とビデオの記録は、「正常および異常な解剖学的構造の正確な^{文書化」3}を持つために不可欠です。

1. 適切な写真記録のために、「心臓組織の漸進的解剖」¹³を実行しながらデジタル画像を撮影してください。写真の文書化と写真¹⁵の一般的なビューの前部と後部のガイドラインを参照してください。心のスライス。および疑わしい病変。

結果

このプロトコルは、解剖学的特徴を視覚化し、4つの異なる種(犬、猫、豚、牛)の心臓の組織学的検査のためのサンプルを収集するために使用されました。剖検プロトコルは上記の種のそれぞれで繰り返されましたが、犬でのみ示されています。剖検プロトコルは、体(図1A)(皮膚、探索可能なリンパ節、および外部粘膜を含む)の広範な外部検査、全体的な体重の測定、および動物の一般的な状態のスコアリングから始まります。外部検査の後、剖検は体の部分的な皮剥ぎ(皮下筋と表在筋を徹底的に検査するように指示された)と本体の空洞の開口部を伴って続きます(図1B-D)。

腹腔は通常、最初に検査され(図1C)、次に腹腔と腹部臓器の広範なin situ検査、次に横隔膜の切片、そして最後に右半胸部の除去が続きます(図1D

ディスカッション

現在のプロトコルを実行するときは、一貫した結果を得るために、いくつかの重要な手順を慎重に検討する必要があります。若い動物では、心臓の測定値は成人の測定値とは異なり(心室壁の厚さを含む)、一般的に、心臓は体重のより大きな割合を占めています^11,12。心室肥大の程度は、一般的な体重式を適用して定量化でき、左心室と中隔の比率を自由右心室重量で割ったもので、通常の条件下では成熟動物では2.8〜4.0である必要があります(表1)。この比率が4.0を超える場合は左室肥大を示し、2.8未満の場合は右心室肥大4,11,12を示します。チャンバーの値を得るためには、右心室自由壁を心室間壁および冠状動脈溝に沿って解剖して右心房から分離しなければならない。左心房からの左心室の解剖は房室輪

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.9%生理食塩水	B. BRAUN MELSUNGEN AG		心臓からすべての血液と血栓を洗浄するため。
10%中性緩衝ホルマリン(NBF)	Q Path	11699404	病理組織サンプルを採取するための材料です。
骨切断鉗子	HELEN SRL	LS109HV	骨を切断するための頑丈な器具です。
まな板	の野心	86304	より簡単な操作のために、そして臓器を切断します。
脱灰液	Thermo Scientific TBD-2	6764004	8% ギ酸と塩酸の 1:1 混合物
デジタルカメラ	キヤノン(株)	PowerShot SX540 HS	写真およびビデオグラフィックの文書化用。
鉗子	MKD-Medicale	15-430	解剖器具。
組織型カセット	Q Path	720-2215	組織病理学サンプルを収集するための材料. 寸法:3 × 2.5 × 0.4 cm
ナイフ	TEHNO FOOD COM SERV SRL	D2006/15	軟部組織を切断するための鋭利な刃。
ラテックス手袋	MKD-Medicale	SANTEX-S	保護装置。
マスク	MKD-Medicale	21221	保護装置。
ペトリ皿	MKD-Medicale	0598-1V	補助的な試験サンプルを収集するための材料。
プラスチックレシピエン	コーニングゴセリン	TP200-02	病理組織サンプルを収集するための材料。
スケール	エスペランサ	MEEKS008	臓器の重さを量ります。
スケール	ホワイト ディール	72	被験者の体重を量る場合。
メス	MKD-Medicale	10322E	軟部組織を切断するための鋭い刃。
はさみ	MKD-Medicale	13-260	剖器具。
スクラブ	MKD-Medicale	410100-52	保護装置。
シリンジ	MKD-Medicale	10573EU	補助的なテストサンプルを収集するための材料。