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方法論記事

新たに単離された初代マウス肝細胞へのCas9リボヌクレオタンパク質およびmRNAのエレクトロポレーション媒介送達

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DOI:

10.3791/63828

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2022年6月2日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Clemson University, 2Godley Snell Research Center, Clemson University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、初代マウス肝細胞を肝臓から単離し、CRISPR-Cas9をリボヌクレオタンパク質およびmRNAとしてエレクトロポレーションして、肝臓の遺伝性代謝疾患に関連する治療標的遺伝子を破壊する技術について記載している。記載された方法は、エレクトロポレーション後に高い生存率および高レベルの遺伝子改変をもたらす。

要約

このプロトコルは、初代マウス肝細胞を単離し、続いてCRISPR-Cas9をリボヌクレオタンパク質(RNP)およびmRNAとしてエレクトロポレーション媒介送達するための迅速かつ効果的な方法を記載している。初代マウス肝細胞を3段階逆行性灌流法を用いて単離し、肝臓あたり最大50×106 細胞の高収率および>85%の細胞生存率をもたらした。このプロトコルは、肝細胞のプレーティング、染色、および培養に関する詳細な手順を提供します。この結果は、エレクトロポレーションが緑色蛍光タンパク質(GFP)陽性細胞の割合およびマウス肝細胞における>35%の適度な細胞生存率によって測定されるように、89%の高いトランスフェクション効率を提供することを示している。

このアプローチの有用性を実証するために、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ遺伝子を標的とするCRISPR-Cas9を、肝臓の遺伝性代謝疾患(IMD)に関連する治療遺伝子を破壊するための原理実証遺伝子編集として初代マウス肝細胞にエレクトロポレーションした。mRNAによる47%の編集効率と比較して、RNPでは78%の高いオンターゲット編集が観察された。肝細胞の機能性を、RNPおよびmRNAとしてCRISPR-Cas9を送達することが初代マウス肝細胞において同等の細胞生存率をもたらすことを示したアルブミンアッセイを用いてイン ビトロ で評価した。このプロトコルの有望な用途は、肝臓に影響を及ぼすヒト遺伝性疾患のマウスモデルの生成である。

概要

肝臓のIMDは、毒性代謝産物の蓄積につながる代謝に関与する重要な肝酵素の欠乏を特徴とする遺伝性疾患である。治療がなければ、肝臓のIMDは臓器不全または早期死亡をもたらす1,2。肝臓のIMDを有する患者のための唯一の治癒的選択肢は、ドナー臓器の可用性が低いため、および手順3,4に続く免疫抑制療法による合併症のために制限されている同所性肝移植である。臓器調達移植ネットワークが収集した最近のデータによると、肝移植待機リストに載っている成人患者の40%〜46%のみが臓器を受けており、これらの患者の12.3%が待機リストで死亡しています5。さらに、すべてのまれな肝疾患のわずか5%がFDA承認の治療を受けています6。肝臓のIMDに対する新規治療が決定的に必要であることは明らかです。しかし、新しい治療選択肢を開発するには、適切な疾患モデルが必要です。

インビトロおよびインビボシステムを使用してヒト疾患をモデル化することは、効果的な治療法を開発し、肝臓のIMDの病理を研究するための障害であり続けている。まれな肝疾患を有する患者からの肝細胞は、7を得ることが困難である。動物モデルは、疾患病理学の理解を深め、治療戦略をテストするために不可欠です。しかし、1つの障害は、致命的な変異を持つ胚からモデルを生成することです。例えば、Jag1遺伝子の5'末端付近に5kb配列のホモ接合型欠失を含む胚を有するアラギル症候群(ALGS)のマウスモデルを作成しようとする試みは、胚の早期死をもたらした8。さらに、胚性幹細胞における遺伝子編集によるマウスモデルの生成は、時間とリソースを大量に消費する可能性がある9。最後に、突然変異は標的組織の外側に現れ、交絡変数をもたらし、疾患の研究を妨げる可能性がある9。体細胞遺伝子編集は、肝臓組織における編集を容易にし、胚性幹細胞を用いたモデル生成に関連する課題を迂回するであろう。

エレクトロポレーションは、高電圧電流を印加して細胞膜を透過させることにより、CRISPR-Cas9を核に直接送達することを可能にし、ヒト胚性幹細胞、多能性幹細胞、ニューロンなどのトランスフェクション技術に非妥協的なものを含む多くの細胞型と適合性である10,11,12.しかし、低い生存率はエレクトロポレーションの潜在的な欠点である。手順を最適化すると、毒性を制限しながら高レベルの送達をもたらすことができます13。最近の研究は、非常に効率的なアプローチとして、CRISPR-Cas9成分を初代マウスおよびヒト肝細胞にエレクトロポレーションすることの実現可能性を実証している14。肝細胞におけるエクスビボエレクトロポレーションは、肝臓のヒトIMDsのための新しいマウスモデルを生成するために適用される可能性を有する。

このプロトコルは、肝臓からマウス肝細胞を単離し、続いてCRISPR-Cas9を、Cas9タンパク質と合成シングルガイドRNA(sgRNA)、またはCas9 mRNAとsgRNAを組み合わせて高レベルのオンターゲット遺伝子編集を得るためのRNP複合体としてエレクトロポレーションするための詳細なステップバイステップ手順を提供します。さらに、このプロトコルは、新たに単離されたマウス肝細胞へのCRISPR-Cas9のエレクトロポレーション後の遺伝子編集効率、生存率、および機能性を定量する方法を提供する。

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プロトコル

動物実験はすべて、クレムソン大学で承認された動物ケアおよび使用委員会のガイドラインおよび承認されたプロトコルに準拠して実施された。外科的処置は、麻酔をかけた野生型C57BL/6Jマウスにおいて、生後8〜10週齢の間に実施された。

1. 動物手術

  1. 溶液および器具の調製
    注:灌流溶液および麻酔カクテルレシピは、 材料表に示されています。
    1. 灌流溶液1(HEPES、EGTA、およびEBSS)、灌流溶液2(HEPES、EGTA、EBSS、CaCl 2、およびMgSO4)、および灌流溶液3(溶液2およびリベラーゼ)を調製する。解決策がよく混在していることを確認してください。
    2. 手順を開始する前に、ウォーターバスを42°Cに設定し、灌流ソリューション1、2、および3を最低30分間予温し、ウォーターバスに保管してください。
      注:灌流溶液1および2はカルシウムをキレートし、肝臓の血液を洗い流します。灌流液3は、細胞外マトリックスを解離させる消化酵素リベラーゼを含有する。
    3. 150mLのDMEM + 10%ウシ胎児血清(FBS)を円錐管に入れ、氷の上に置きます。
      注:この培地は、肝臓カプセルから細胞を放出し、それぞれステップ2.1および2.2で単離された肝細胞を洗浄するために使用されます。
    4. 遠心分離機を4°Cに設定する。
    5. 70%エタノールで満たされたフラスコにチューブの両端を置き、エタノールを3回循環させて、ポンプチューブを滅菌する。
    6. チューブを蒸留水で洗って空にします。
    7. チューブを予温した30mLの灌流溶液1で満たし、続いて8mLの灌流溶液2で満たします。チューブにまだより多くの流体を入れるスペースがある場合は、チューブの残りの部分に灌流溶液3を満たします。チューブに気泡を導入しないように、別の灌流溶液に切り替えるときにポンプを停止します。
    8. 余分なチューブを42°Cのウォーターバスに入れて、灌流溶液を暖かく保ちます。
    9. ポンプチューブの端部を灌流液3の入った円錐管に入れ、水浴中に保管したままにする。
      注:このステップは、灌流中にポンプが灌流溶液3を連続的に充填できるようにするために必要です。
  2. 動物の準備
    1. 麻酔薬カクテルを10-11.7μL/g体重の用量で腹腔内に注射することによってマウスを麻酔する。麻酔カクテルの最終濃度は、7.5 mg/mL ケタミン、0.25 mg/mL アセプロマジン、1.5 mg/mL キシラジンです。
    2. マウスの呼吸を監視し、マウスが痛みに反応していないことを確認します。マウスが毎分〜55〜65回の呼吸数を持ち、つま先をつまんでも反応せず、弛緩した尾を持つまで待ちます。さらに、閉じた目の内側の皮膚に軽く触れて、眼瞼(まばたき)反射を確認してください。マウスがまばたきをしたり、目の筋肉がけいれんしたりする場合は、麻酔カクテル全体の用量を5〜10μL増やしてください。
    3. マウスを仰臥位に置き、ピンまたはテープを使用して四肢を表面に固定します(補足図S1)。
    4. 腹部に70%エタノールを噴霧し、綿球で拭き取って乾かします。
  3. 肝臓灌流
    1. はさみを使って腹部の皮膚にU字型の横切開を行い、側面を通して穴を広げます。
    2. 引き続き皮膚を胸郭に開放する。
    3. はさみを使用して、腹膜を切り取って腹腔を胸郭まで露出させ、臓器を傷つけないように注意してください。鉗子の裏側またははさみの鈍い表面を使用して腸を右側に動かします。下大静脈と門脈を特定する(補足図S1)。
    4. ポンプを起動して、予温された灌流溶液をカテーテルを通して洗い流す。
    5. ポンプを停止し、すべての空気がシステムを通して洗い流されたら、カテーテルを取り外します。カテーテルに接続された針の先端を静脈に対して10°-20°の角度で下大静脈に挿入します。カテーテルから針を取り外し、静脈に平行な動きでカテーテルを静脈に静かに押し込みます。
      注:ユーザーは、静脈内の適切なカニューレを確認するために、カテーテル内の血液のフラッシュバックを観察する必要があります。
    6. カテーテルを静脈内にさらに移動させることなく、チューブをカテーテルに接続します。
    7. 2 mL/分の流量でポンプを起動します。灌流が成功したという兆候として、すぐに青白くなる肝臓を探してください。
    8. はさみで門脈を切ってください。
    9. 徐々に流量を5mL/minに増やします。
    10. おおよその切断部位の門脈に定期的に圧力をかけ、鉗子または綿棒を使用して排水を遮断し、良好な灌流を促進する。
    11. 灌流溶液3が流れたら、肝臓の弾力性を注意深く監視する。肝臓が柔らかくなっているかどうかを判断するには、綿棒または鉗子で肝臓を静かに押し、肝臓にくぼみが形成されているかどうかを確認します。細胞生存率の損失を避けるために、過剰に灌流しないように注意してください。











    6. figure-protocol-1



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結果

肝臓からの平板状初代肝細胞の単離
肝臓灌流および肝細胞単離の全体的なプロセスを 図1に示します。本実験では、野生型、8~10週齢のC57BL6/6Jマウスを用いた。この手順は、マウスあたり20〜50個×106 個の細胞を産出し、生存率は85%〜95%であると予想されます。生存率が<70%の場合、死細胞を除去するためにパーコール処理に従うべきである。新たに単離した肝細胞は、コラーゲンIコートまたは窒素含有組織培養プレートに播種する必要があります。めっきから3〜12時間以内に、肝細胞はプレートに接着すると予想され、細胞形態は24時間以内に典型的な多角形または六角形の外観を想定する(図2)。肝細胞は、グリコーゲンの形でグルコースを貯蔵する肝臓で唯一の細胞である。単離された細胞の純度を検証するために、グリコーゲン染色は、メッキ後24時間で過ヨウ素酸-シッフ試薬を用いて行われる。染色された肝細胞の細胞質はマゼンタ色に見える(

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ディスカッション

肝細胞単離のためのプロトコルに概説されているステップは挑戦的であり、熟練のための練習を必要とする。肝臓からの肝細胞単離を成功させるためのいくつかの重要なステップがあります。まず、下大静脈の適切なカニューレレーションは、完全な肝臓灌流に不可欠です。灌流後の肝臓におけるブランチングの不在は、カテーテルの変位を示す(表1)。下大静脈(逆行性灌流)は、門脈(順行性灌流)よりも簡単でアクセスしやすいため、手順でカニューレ採取されました17,18。いくつかのプロトコルは、カテーテル19を固定するために縫合糸を使用する。しかし、縫合糸はプロセスを複雑にする。カテーテルを縫合すると、カテーテルの配置ミスや位置の調整が不可能になるなど、望ましくない結果が生じる可能性があります。また、針を抜くことなく肝臓でカニューレを行うことができるため、肝臓灌流をさらに簡略化することができる。ポンプをカテーテルに接続することは、静脈内の針で不要である。さらに、誤ってカテーテ...

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開示事項

著者らは、開示すべき競合する利害関係はない。

謝辞

RNCは、米国国立衛生研究所の国立一般医学研究所(NIGMS)、米国肝疾患研究協会財団、および米国遺伝子細胞療法学会の支援を受けて、サウスカロライナ州バイオエンジニアリングセンターから助成金番号P30 GM131959、2021000920、 と2022000099それぞれ。内容は著者の責任であり、必ずしも米国遺伝子細胞療法学会または米国肝疾患学会財団の公式見解を表すものではありません。図1の回路 図 は、BioRender.com で作成しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
機器
0.2 mL PCR 8チューブ FLEX-FREEストリップ、クリアフラットキャップ付き、ナチュラルUSA Scientific1402-4700
6ウェルコラーゲンプレートAdvanced Biomatrix5073
accuSpin Micro 17RFisher Scientific13-100-675
オールインワン蛍光顕微鏡キーエンスBZ-X810
アナログボルテックスミキサーVWR97043-562
ARTワイドボアフィルターチップ1,000µLThermoFisher Scientific2079GPK
全自動セルカウンターBio-Rad LaboratoriesTC20
Blue Wax Dissection TrayBraintree Scientific Inc.DTW19インチ x 6.5インチ x 1/2インチ + F21
セルスクレーパー/リフターアルゴステクノロジーズ UX-04396-53非発熱性、滅菌
コニカルチューブ (15 mL)フィッシャーサイエンティフィック339650
コニカルチューブ (50 mL)フィッシャーサイエンティフィック14-432-22
コットンアプリケーターフィッシャーサイエンティフィ22-363-170
湾曲はさみのクーパー外科62131
使い捨てペトリ皿ファルコン351029100mm、滅菌
使い捨てペトリ皿VWR25373-10035mm、滅菌
エポックマイクロプレート分光光度計BioTek250082
ファルコン細胞ストレーナー(70 & マイクロ;m)フィッシャーサイエンティフィック08-771-2
鉗子クーパーサージカル61864ユーロメッド広告ソン組織鉗子
IVカテーテル BD38261224 G x 0.75
in IV 輸液セットBaxter2C6401
MyFuge 12 Mini CentrifugeBenchmarkScientific 1220P38
NeedlesFisher Scientific05-561-2025 G
Nucleofector 2b DeviceLonzaAAB-1001Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes
蠕動ポンプマスターフレックス HV-77120-4210 から 60 rpm; 90 から 260 VAC
精密ポンプ管MasterflexHV-96410-1425 ft, シリコーン
Primaria 培養プレートCorning Life Sciences353846窒素含有組織培養プレート
セロロジカルピペット (25 mL)フィッシャーサイエンティフィ12-567-604
シリンジBD3294641 mL, 滅菌
T100 サーマルサイクラーバイオ・ラッド・ラボラトリーズ1861096
ウォーターバスALT27577Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 シリーズ、2.5 L
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3IDT1081058
Beckman Coulter AMPure XP、5 mLFisher ScientificNC9959336
CleanCap Cas9 mRNATrilink BiotechnologiesL-7606-100
CleanCap EGFP mRNATrilink BiotechnologiesL-7201-100
Corning Matrigel MatrixCorning Life Sciences356234
DMEMThermoFisher Scientific11885076低グルコース、ピルビン酸
エタノール 70%VWR71001-652
ウシ胎児血清Thermoscientific26140-079
肝細胞のメンテナンスミディアム (MM)ロンザMM250
肝細胞プレーティング メディウム (PM)ロンザMP100
マウスアルブミン ELISA キットフィッシャーサイエンティフィックNC0010653
マウス/ラット肝細胞ヌクレオフェクターキットロンザVPL-1004
OneTaq HotStart DNA ポリメラーゼニューイングランド バイオラボM0481L
PBS 10x pH 7.4 Thermoscientific70011-044塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムなし
Percoll (PVP 溶液)Santa Cruz Biotechnologysc-500790A
過ヨウ酸Sigma-AldrichP7875-25G
Permount Mounting MediumVWR100496-550
QuickExtract DNA 抽出液Lucigen CorporationQE05090
シフフクシン亜硫酸試薬Sigma-AldrichS5133
トリプシン-EDTA (0.25%)ThermoFisher Scientific25200056Phenol red
Vybrant MTT Cell Viability AssayThermoFisher ScientificV13154
Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized) 4°で安定しています。C 2ヶ月間
EBSSフィッシャーサイエンティフィック14155063まで完全 200 mL
Bioworld40520008-1200 µL
HEPES (pH 7.3, 1 m)ThermoFisher ScientificAAJ16924AE2 mL 
<ストロング>灌流液2(pH7.4、フィルター滅菌済み) 4°で安定しています。C 2ヶ月間
CaCl2·2H20 (1.8 mM)シグマC7902-500G360 &L of 1 M stock 
EBSS (カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなし)Fisher Scientific14-155-063まで 200 mL まで完了
ThermoFisherScientificAAJ16924AE2 mL 
MgSO4·7H20 (0.8 mM)Sigma30391-25G160 & マイクロ;L of 1 M stock
灌流溶液 3 使用前に新鮮に調製
溶液 250 mL
リベラロシュ54011270010.094 Wunsch 単位/mL
マウス麻酔カクテル 
acepromzine0.25 mg/mL 最終濃度
ケタミン7.5 mg/mL 最終濃度
キシラジン1.5 mg/mL 最終濃度
SoftwareURL
Benchlinghttps://www.benchling.com/
ImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/
TIDE:分解によるインデルの追跡https://tide.nki.nl/
ック 機器ック 200 mL EGTA(0.5 M) HEPES (1 M)ーゼ

参考文献

  1. Pampols, T. Inherited metabolic rare disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).
  2. Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction. Journal of Inherited Metabolic Disease. 29 (2-3), 261-274 (2006).
  3. Arnon, R., et al. Liver transplantation in children with metabolic diseases: the studies of pediatric liver transplantation experience. Pediatric Transplantation. 14 (6), 796-805 (2010).
  4. Maiorana, A., et al. Preemptive liver transplantation in a child with familial hypercholesterolemia. Pediatric Transplantation. 15 (2), 25-29 (2011).
  5. OPTN/SRTR 2019 Annual Data Report: Liver. , Available from: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx (2019).
  6. Fabris, L., Strazzabosco, M. Rare and undiagnosed liver diseases: challenges and opportunities. Translational Gastroenterology and Hepatology. 6, (2020).
  7. Haugabook, S. J., Ferrer, M., Ottinger, E. A. In vitro and in vivo translational models for rare liver diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1865 (5), 1003-1018 (2019).
  8. Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
  9. Lima, A., Maddalo, D. SEMMs: Somatically engineered mouse models. a new tool for in vivo disease modeling for basic and translational research. Frontiers in Oncology. 11, 1117(2021).
  10. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  11. Ye, L., et al. Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9591-9596 (2014).
  12. Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584(2014).
  13. Hoban, M. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+ cells. Molecular Therapy. 24 (9), 1561-1569 (2016).
  14. Rathbone, T., et al. Electroporation-mediated delivery of Cas9 ribonucleoproteins results in high levels of gene editing in primary hepatocytes. The CRISPR Journal. , (2022).
  15. Benchling [Biology Software]. , Available from: https://benchling.com (2022).
  16. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).
  17. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).
  18. Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475 (7356), 386-389 (2011).
  19. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  20. Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222(2020).
  21. Kim, Y., et al. Three-dimensional (3D) printing of mouse primary hepatocytes to generate 3D hepatic structure. Annals of Surgical Treatment and Research. 92 (2), 67-72 (2017).
  22. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  23. Lattanzi, A., et al. Optimization of CRISPR/Cas9 delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells for therapeutic genomic rearrangements. Molecular Therapy. 27 (1), 137-150 (2019).
  24. Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).
  25. Grompe, M. Hereditary Tyrosinemia: Pathogenesis, Screening and Management. Tanguay, R. M. , Springer International Publishing. 215-230 (2017).

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