このプロトコルは、解剖されたマウス胚の顔面プロセスまたは培養マウス胚口蓋間葉系細胞から全細胞タンパク質溶解物を単離し、その後のウェスタンブロッティングを実行してリン酸化タンパク質レベルを評価する方法を提示する。
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方法論記事
リンタンパク質分析のためのマウスフェイシャルプロセスおよび培養口蓋間葉系細胞からの全細胞タンパク質溶解物の単離
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
哺乳類の頭蓋顔面発達は、複数の細胞集団が調整して前頭鼻骨格を生成する複雑な形態学的プロセスである。これらの形態学的変化は、キナーゼによるタンパク質リン酸化を含むことが多い多様なシグナル伝達相互作用によって開始され、維持される。ここでは、哺乳類の頭蓋顔面発達中のタンパク質のリン酸化を研究する生理学的に関連する文脈の2つの例が提供される:マウス顔面プロセス、特にE11.5上顎プロセス、およびE13.5二次口蓋棚に由来する培養マウス胚性口蓋間葉間膜細胞。タンパク質単離中の脱リン酸化の一般的な障壁を克服するために、リンタンパク質の単離を可能にする標準的な実験室法への適応および改変が議論される。さらに、全細胞タンパク質溶解物のウェスタンブロッティング後のリンタンパク質の適切な分析および定量化のためのベストプラクティスが提供される。これらの技術は、特に薬理学的阻害剤および/またはマウス遺伝子モデルと組み合わせて、頭蓋顔面発達中に活性な様々なリンタンパク質の動態および役割についてのより大きな洞察を得るために使用することができる。
概要
哺乳類の頭蓋顔面発達は、複数の細胞集団が調整して前頭鼻骨格を生成する複雑な形態学的プロセスである。マウスでは、このプロセスは胚期(E)9.5に始まり、前頭鼻突出部および上顎および下顎突起のペアの形成が起こり、それぞれに回遊後頭蓋神経堤細胞が含まれる。側方および内側の鼻プロセスは、鼻孔の出現を伴う前頭鼻突出部から生じ、最終的に融合して鼻孔を形成する。さらに、内側鼻プロセスと上顎プロセスが融合して上唇を生成する。同時に、口蓋形成は、E11.5で上顎突起の口腔側から明確な外生(二次口蓋棚)の形成によって開始される。時間が経つにつれて、口蓋棚は舌の両側で下方に成長し、舌の上の反対の位置に上昇し、最終的に正中線で融合して、E16.51によって鼻腔と口腔を隔てる連続的な口蓋を形成する。
頭蓋顔面発達全体にわたるこれらの形態学的変化は、キナーゼによるタンパク質リン酸化を含むことが多い多様なシグナル伝達相互作用によって開始および維持される。例えば、骨形成タンパク質受容体(BMPR)を含む形質転換成長因子(TGF)β受容体のサブファミリー、および種々の受容体チロシンキナーゼ(RTK)ファミリーなどの細胞膜受容体は、頭蓋神経堤細胞におけるリガンド結合および活性化時に自己リン酸化される2,3,4。
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プロトコル
動物を含むすべての手順は、コロラド大学アンシュッツメディカルキャンパスの施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、施設のガイドラインおよび規制に準拠して実施されました。生後1.5~6ヶ月の雌129S4マウスを21~23°Cの亜熱中性温度で飼育し、胚採取に用いた。プロトコルの概略ワークフローを 図1に示します。このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、ソフトウェア、試薬、および動物の詳細については、 材料表 を参照してください。
1. E11.5マウス胚の採取
- 約50%の変位(3チャンバーで2.95L/分)および曝露期間に必要なIACUC承認のCO2流量を使用して、CO2チャンバーでの時限交配中の膣プラグの検出後11.5日後に妊娠中のメスマウスを安楽死させる(材料表を参照)。安楽死の二次的方法として子宮頸部脱臼を行う。すぐに解剖に進みます。
- マウス本体を腹側を上に向けて解剖ボードの上に置きます。マウス腹部に70%エタノールを噴霧する。
- まっすぐなせんけ鉗子で前部の皮膚を膣口につまんで持ち上げ、持ち上げられた皮膚と下層の層をまっすぐな刃の手術用はさみ....
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結果
マウスの顔面プロセスおよび/または培養口蓋間葉系細胞から単離されたタンパク質のリン酸化を特徴付けようとする場合、代表的な結果は、対応する総タンパク質バンドの高さまたはその近くで実行される抗リンタンパク質抗体によるウェスタンブロッティング後の、明確で再現性のあるバンドを理想的に明らかにするであろう(図3).しかしながら、タンパク質の広範なリン酸化が起こる場合、全タンパク質バンドのそれと比較してリンタンパク質バンドのわずかな上方シフトがあり得る。さらに、タンパク質の複数のアイソフォームが組織内に存在し、それぞれがリン酸化されている場合、またはタンパク質が可変的に追加のPTMを受ける場合、抗リンタンパク質抗体によるウェスタンブロットに複数のバンドが現れ得る。目的のリンタンパク質についてシグナルが観察されない場合、目的の全タンパク質が検出されているにもかかわらず、タンパク質が選択されたコンテキストでリン酸化されないか、またはプロトコルに技術的な問題が生じている可能性があります。後者の場合、全細胞溶解物のウェスタンブロッティングを抗ホスホセリン/スレオニンおよび/または抗ホスホチロシン抗.......
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ディスカッション
ここで説明するプロトコルにより、研究者は頭蓋顔面発達中の重要なリン酸化依存性シグナル伝達事象を堅牢かつ再現可能な方法でプローブすることができます。このプロトコルには、データの適切な収集と結果の分析を保証するいくつかの重要なステップがあります。マウスの顔面プロセスおよび/または培養口蓋間葉細胞からリンタンパク質を単離するかどうかにかかわらず、指示されたときにすべての試薬および材料を氷上に保持しながら、迅速かつ効率的に移動することが不可欠です。氷の低温は細胞内の代謝活性を低下させ、それによってリン酸化タンパク質をホスファターゼ活性38から保護し、高いタンパク質収率を維持する。上顎プロセスの解剖中に3つの別々の10cmペトリ皿を使用することにより、すべての解剖が十分に予冷された組織学PBSで行われることを確実にする。関連して、このタンパク質単離プロトコルの追加的で必須の成分は、すべての溶解緩衝液におけるホスファターゼ阻害剤の使用である。これらの試薬はまた、目的のタンパク質39、40上のリン酸基を保護し.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もありません。
謝辞
129S4マウスは、シナイ山のアイカーン医科大学のフィリップ・ソリアーノ博士からの贈り物でした。この研究は、国立衛生研究所(NIH)/国立歯科頭蓋顔面研究所(NIDCR)R01 DE027689およびK02 DE028572からK.A.F.、F31 DE029976からM.A.R.、F31 DE029364からB.J.C.D.への資金で支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 機器 | |||
| Block | Research Products International Corp | 400783 | |
| Image Lab ソフトウェア付き | Bio-Rad | 1708265 | 化学発光イメージャー |
| CO2 インキュベーター、エアジャケット | VWR | 10810-902 | |
| 解剖ボード、11 x 13 in | Fisher Scientific | 09 002 12 | |
| 電気泳動細胞、4ゲル、ミニトランスブロットモジュール付きミニプレキャストゲル用 | Bio-Rad | 1658030 | |
| ハイブリダイゼーションオーブン | Fisher Scientific | UVP95003001 | |
| Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) | Sigma Aldrich | Z604062 | |
| Mini dry bath | 研究製品International Corp | 400780 | |
| オービタルシェーカー | VWR | 89032-092 | |
| pH メーター | VWR | 89231-662 | |
| SDS-PAGE | Bio-Rad | 1645050 | |
| 長方形のアイスパン、マキシ 9 L | フィッシャーサイエンティフィック | 07-210-093 | |
| スタンド付き Stemi 508 実体顕微鏡 K LAB、LED リングライト | Zeiss | 4350649020000000 | 解剖顕微鏡 |
| タイマー | VWR | 62344-641 | |
| チューブリボルバー | フィッシャーサイエンティフィック | 11 676 341 | |
| ボルテックスミキサー | フィッシャーサイエンティフィック | 02 215 414 | |
| ウォーターバス | VWR | 89501-472 | |
| ウエスタンブロットボックス | フィッシャーサイエンティフィック | NC9358182 | |
| <ストロング>材料 | |||
| 細胞培養皿、6 cm | フィッシャーサイエンティフィック | 12-565-95 | |
| 細胞培養プレート、12ウェル | フィッシャーサイエンティフィック | 07-200-82 | |
| セルリフター | フィッシャーサイエンティフィック | 08-100-240 | |
| CO2 | sub>Airgas | CD USP50 | |
| コニカルチューブ、ポリプロピレン、50mL | フィッシャーサイエンティフィック | 05-539-13 | |
| デュモン #5 ファイン フォーセプス | ファイン サイエンス ツール | 11254-20 | |
| 胚スプーン | ファイン サイエンス ツール | 10370-17 | |
| マイクロ遠心チューブ、0.5 mL | VWR | 89000-010 | |
| マイクロ遠心チューブ、1.5 mL | VWR | 20170-038 | |
| パスツールピペット、5.75インチ | フィッシャーサイエンティフィック | 13-678-6A | |
| パスツールピペット、9 インチ | VWR | 14672-380 | |
| シャーレ、10 cm | フィッシャー サイエンティフィック | 08-757-100D | |
| シャーレ、35 mm | フィッシャー サイエン | FB0875711YZ | |
| ポーチ、透明、ポリエチレン ライニング | フィッシャー サイエンティフィ | 01-812-25B | |
| PVDF メン | レン フィッシャー科学 | IPVH00010 | |
| セムケン鉗子 | ファインサイエンスツール | 11008-13 | |
| 小さなラテックス電球、2 mL | VWR | 82024-554 | |
| 手術用ハサミ | ファインサイエンスツール | 14002-12 | |
| シリンジフィルター、25 mm、0.2 μm 細孔径 | フィッシャー・サイエンティフィック | 09-740-108 | |
| ルアーチップ付きシリンジ、10 mL | VWR | BD309604 | |
| トランスファーピペット | フィッシャー・サイエンティフィック | 13-711-22 | |
| ウェスタンブロットカセット開口レバー | バイオ・ラッド | 4560000 | |
| Whatmann 3MM chr クロマトグラフィーペーパー | フィッシャー・サイエンティフィック | 05-714-5 | |
| 試薬 | |||
| 4-15% プレキャストタンパク質ゲル、10ウェル、30 & マイクロ;L | バイオ・ラッド | 4561083 | |
| β;-グリセロリン酸二ナトリウム塩水和物 | Sigma Aldrich | G5422-25G | ストック濃度 1 M |
| &β;-メルカプトエタノール | Sigma Aldrich | M3148-100ML | |
| ウシ血清アルブミン、フラクションV、ヒートショック試験 | フィッシャーサイエンティフィック | BP1600-100 | |
| ブロモフェノールブルー | フィッシャーサイエンティフィック | ||
| 完全ミニプロテアーゼ阻害剤カクテル | Sigma Aldrich | 11836153001 | ストック濃度 25x |
| DC タンパク質アッセイキット II | Bio-Rad | 500-0112 | |
| DMEM、高グルコース | Gibco | 11965092 | |
| E7、マウスモノクローナルβチューブリン一次抗体、濃縮物 0.1 mL | Developmental Studies Hybridoma Bank | E7 | 1:1,000 |
| ECL ウェスタンブロッティング基質 | Fisher Scientific | PI32106 | 低ピコグラム範囲 |
| ECL ウェスタンブロッティング基質 | Genesee Scientific | 20-302B | 低フェムトグラム範囲 |
| 電気泳動バッファー、5 L | バイオ・ラッド | 1610772 | ストック濃度 10x |
| エタノール、200プルーフ、1 ガロン | Decon Laboratories, Inc. | 2705HC | EtOH |
| エチレンジアミン四酢酸、Di Na塩二水素。(結晶性POWD./電気泳動。 | Fisher Scientific | BP120-500 | EDTA |
| ウシ胎児血清、特性評価済み、米国原産、500 mL | HyClone | SH30071.03 | |
| グリセロール (認定 ACS) | Fisher Scientific | G33-4 | |
| HRP 標識二次抗体、ヤギ抗マウス IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-146 | 1:20,000 |
| HRP 標識二次抗体、ヤギ抗ウサギIgG | ジャクソン免疫研究所 | 111-035-003 | 1:20,000 |
| 塩酸溶液、6N (認証) | フィッシャーサイエンティフィック | SA56-500 | HCl |
| イゲパル Ca - 630 非イオン性洗剤 | フィッシャーサイエンティフィ | ICN19859650 | ノニデット P-40 |
| イソプロパノール (HPLC) | フィッシャーサイエンティフィック | A451-1 | |
| L-グルタミン | ギブコ | 25030081 | ストック濃度 200 mM |
| メタノール | Fisher Scientific | A454-4 | |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) 一次抗体 | Cell Signaling Technology | 9102S | 1:1,000; 抗 Erk1/2 |
| PDGF-BB 組換えリガンド, ラット | Fisher Scientific | 520BB050 | |
| PDGF Receptor β 一次抗体 | Cell Signaling Technology | 3169S | 1:1,000 |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | Gibco | 15140122 | ストック濃度 100 U/mL、100 & マイクロ;g/mL |
| フェニルメタンスルホニルフッ化物、99% | Fisher Scientific | AC215740100 | PMSF; ストック濃度 100 mM |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) 一次抗体 | Cell Signaling Technology | 9101S | 1:1,000, 抗リン酸化 Erk1/2 |
| Phospho-PDGF 受容体 & α; /PDGF 受容体 &β; 一次抗体 | Cell Signaling Technology | 3170S | 1:1,000 |
| 塩化カリウム(白色結晶) | フィッシャーサイエンティフィック | BP366-500 | KCl |
| リン酸カリウム一塩基性(白色結晶) | フィッシャーサイエンティフィック | BP362-500 | KH<サブ>2PO<サブ>4 |
| >SDS溶液、10% | バイオ・ラッド | 161-0416 | |
| 塩化ナトリウム(結晶性/生物学的、認証) | フィッシャーサイエンティフィック | S671-3 | NaCl |
| フッ化ナトリウム(粉末/認定ACS) | フィッシャーサイエンティフィック | S299-100 | NaF;1回限りの使用のためのアリコート;ストック濃度1 M |
| オルトバナジン酸ナトリウム、99% | フィッシャーサイエンティフィ | AC205330500 Na<サブ>3VO<サブ>4;ストック濃度100 mM | |
| リン酸二塩基性無水ナトリウム(粒状または粉末/認定ACS) | フィッシャーサイエンティフィック | S374-500 | Na2HPO4 |
| Tissue culture PBS | Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Transfer buffer, 5 L | Bio-Rad | 1610771 | Stock Concentration 10x |
| Tris base (白色結晶または結晶性粉末/分子生物学) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Trypsin | BioWorld | 21560033 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| ウェスタンブロット分子量マーカー | Bio-Rad | 1610374 | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of Health | ||
| Animals | |||
| Female 129S4 mice | フィリップ・ソリアーノ博士、マウントサイナイのアイカーン医科大学からの贈り物 |
参考文献
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling a....
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