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方法論記事

リンタンパク質分析のためのマウスフェイシャルプロセスおよび培養口蓋間葉系細胞からの全細胞タンパク質溶解物の単離

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DOI：

10.3791/63834

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2022年4月1日

 ,  , 
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、解剖されたマウス胚の顔面プロセスまたは培養マウス胚口蓋間葉系細胞から全細胞タンパク質溶解物を単離し、その後のウェスタンブロッティングを実行してリン酸化タンパク質レベルを評価する方法を提示する。

要約

哺乳類の頭蓋顔面発達は、複数の細胞集団が調整して前頭鼻骨格を生成する複雑な形態学的プロセスである。これらの形態学的変化は、キナーゼによるタンパク質リン酸化を含むことが多い多様なシグナル伝達相互作用によって開始され、維持される。ここでは、哺乳類の頭蓋顔面発達中のタンパク質のリン酸化を研究する生理学的に関連する文脈の2つの例が提供される:マウス顔面プロセス、特にE11.5上顎プロセス、およびE13.5二次口蓋棚に由来する培養マウス胚性口蓋間葉間膜細胞。タンパク質単離中の脱リン酸化の一般的な障壁を克服するために、リンタンパク質の単離を可能にする標準的な実験室法への適応および改変が議論される。さらに、全細胞タンパク質溶解物のウェスタンブロッティング後のリンタンパク質の適切な分析および定量化のためのベストプラクティスが提供される。これらの技術は、特に薬理学的阻害剤および/またはマウス遺伝子モデルと組み合わせて、頭蓋顔面発達中に活性な様々なリンタンパク質の動態および役割についてのより大きな洞察を得るために使用することができる。

概要

哺乳類の頭蓋顔面発達は、複数の細胞集団が調整して前頭鼻骨格を生成する複雑な形態学的プロセスである。マウスでは、このプロセスは胚期(E)9.5に始まり、前頭鼻突出部および上顎および下顎突起のペアの形成が起こり、それぞれに回遊後頭蓋神経堤細胞が含まれる。側方および内側の鼻プロセスは、鼻孔の出現を伴う前頭鼻突出部から生じ、最終的に融合して鼻孔を形成する。さらに、内側鼻プロセスと上顎プロセスが融合して上唇を生成する。同時に、口蓋形成は、E11.5で上顎突起の口腔側から明確な外生(二次口蓋棚)の形成によって開始される。時間が経つにつれて、口蓋棚は舌の両側で下方に成長し、舌の上の反対の位置に上昇し、最終的に正中線で融合して、E16.51によって鼻腔と口腔を隔てる連続的な口蓋を形成する。

頭蓋顔面発達全体にわたるこれらの形態学的変化は、キナーゼによるタンパク質リン酸化を含むことが多い多様なシグナル伝達相互作用によって開始および維持される。例えば、骨形成タンパク質受容体(BMPR)を含む形質転換成長因子(TGF)β受容体のサブファミリー、および種々の受容体チロシンキナーゼ(RTK)ファミリーなどの細胞膜受容体は、頭蓋神経堤細胞におけるリガンド結合および活性化時に自己リン酸化される2,3,4。.さらに、平滑化されたGタンパク質共役型膜貫通型受容体は、Patched1受容体に結合するソニックヘッジホッグ(SHH)リガンドの下流の頭蓋神経堤細胞および頭蓋顔面外胚葉においてリン酸化され、毛様体膜およびSHH経路活性化5における平滑化蓄積をもたらす。このようなリガンド-受容体相互作用は、頭蓋顔面状況におけるオートクリン、パラクリン、および/またはジュクスタクリンシグナル伝達を介して起こり得る。例えば、BMP6は軟骨細胞分化6中にオートクリン様式でシグナル伝達することが知られており、一方、線維芽細胞増殖因子(FGF)8は咽頭弓外胚葉に発現し、咽頭弓間葉に発現するRTKのFGFファミリーのメンバーにパラクリン様式で結合して咽頭弓7のパターニングおよび外生を開始し、8,9,10。さらに、Notchシグナル伝達は、膜貫通デルタおよび/またはギザギザリガンドが隣接する細胞上の膜貫通Notch受容体に結合し、その後切断およびリン酸化されるときに、傍タクリンシグナル伝達を介して、頭蓋顔面骨格発達中に軟骨細胞および骨芽細胞の両方で活性化される11。しかし、頭蓋顔面発達にとって重要な他のリガンドおよび受容体対は、オートクリンおよびパラクリンシグナル伝達の両方において機能する柔軟性を有する。一例として、マウス歯の形態形成中に、血小板由来成長因子(PDGF)−AAリガンドがオートクリン様式でシグナル伝達し、エナメル器官上皮12中のRTK PDGFRαを活性化することが実証された。対照的に、妊娠中期のマウス顔面突起では、リガンドPDGF-AAおよびPDGF-CCをコードする転写産物が頭蓋顔面外胚葉で発現し、一方、PDGFRα受容体は下層の頭蓋神経堤由来間葉系で発現され、パラクリンシグナル伝達をもたらす13、14、15、16、17.シグナル伝達機構にかかわらず、これらの受容体リン酸化事象は、しばしばアダプタータンパク質および/またはシグナル伝達分子の動員をもたらし、それらはしばしばそれ自体がリン酸化されてマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)経路などの細胞内キナーゼカスケードを開始する18,19。

これらのカスケードの末端細胞内エフェクターは、転写因子、RNA結合、細胞骨格および細胞外マトリックスタンパク質などの基質の配列をリン酸化することができる。Runx220、Hand1 21、Dlx3/5 22、23、24、Gli1-3 25、およびSox9 26は、頭蓋顔面発達の文脈でリン酸化された転写因子の1つである。この翻訳後修飾(PTM)は、他の活性の中でも特に、代替PTMに対する感受性、二量体化、安定性、切断、および/またはDNA結合親和性に直接影響し得る20、21、25、26。さらに、RNA結合タンパク質Srsf3は、頭蓋顔面発達の文脈でリン酸化され、その核移行をもたらす27。一般に、RNA結合タンパク質のリン酸化は、その細胞内局在化、タンパク質間相互作用、RNA結合、および/または配列特異性に影響を及ぼすことが示されている28。さらに、アクトミオシンのリン酸化は、頭蓋顔面発生29、30全体にわたる細胞骨格再配列をもたらし得、小さなインテグリン結合リガンドN結合型糖タンパク質などの細胞外マトリックスタンパク質のリン酸化は、骨格発生中のバイオミネラリゼーションに寄与する31。上記および他の多くの例を通して、頭蓋顔面発達中のタンパク質リン酸化に幅広い意味合いがあることは明らかである。さらなるレベルの調節を加えると、タンパク質リン酸化はホスファターゼによってさらに調節され、ホスファターゼはリン酸基を除去することによってキナーゼを打ち消す。

受容体レベルとエフェクター分子レベルの両方でのこれらのリン酸化事象は、シグナル伝達経路の伝播にとって重要であり、最終的には核内の遺伝子発現の変化をもたらし、遊走、増殖、生存、分化などの特定の細胞活性を駆動し、哺乳動物の顔の適切な形成をもたらす。キナーゼおよびホスファターゼとのタンパク質相互作用の状況特異性、PTMの結果生じる変化、および細胞活性に対するそれらの影響を考慮すると、これらのパラメータを生理学的に関連する設定で研究することが重要であり、頭蓋顔面発達に対するリン酸化事象の寄与を完全に理解する。ここでは、タンパク質のリン酸化、したがって哺乳類の頭蓋顔面発達中のシグナル伝達経路の活性化を研究するための2つの文脈の例が提供される:マウスの顔面プロセス、特にE11.5上顎プロセス、およびE13.5二次口蓋棚に由来する培養マウス胚性口蓋間葉細胞 - 一次32および不死化33の両方.E11.5では、上顎突起は側鼻突起および内側鼻突起1と融合する過程にあり、それによってマウス頭蓋顔面発達中の臨界時点を表す。さらに、口蓋棚に由来する上顎プロセスおよび細胞がここで選択されたのは、後者の構造が前者の誘導体であり、それによって研究者に、関連する文脈においてインビボおよびインビトロでタンパク質リン酸化を調査する機会を提供するからである。しかし、このプロトコルは、代替の顔のプロセスや発達の時点にも適用できます。

リン酸化タンパク質を研究する上で重要な問題は、豊富な環境ホスファターゼによってタンパク質単離中に容易に脱リン酸化されることである。この障壁を克服するために、リン酸化タンパク質の単離を可能にする標準的な実験室法への適応および改変が議論される。さらに、リン酸化タンパク質の適切な分析と定量のためのベストプラクティスが提供されています。これらの技術は、特に薬理学的阻害剤および/またはマウス遺伝子モデルと組み合わせて、頭蓋顔面発達中に活動する様々なシグナル伝達経路のダイナミクスおよび役割についてのより大きな洞察を得るために使用することができる。

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プロトコル

動物を含むすべての手順は、コロラド大学アンシュッツメディカルキャンパスの施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、施設のガイドラインおよび規制に準拠して実施されました。生後1.5~6ヶ月の雌129S4マウスを21~23°Cの亜熱中性温度で飼育し、胚採取に用いた。プロトコルの概略ワークフローを 図1に示します。このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、ソフトウェア、試薬、および動物の詳細については、 材料表 を参照してください。

1. E11.5マウス胚の採取

  1. 約50%の変位(3チャンバーで2.95L/分)および曝露期間に必要なIACUC承認のCO2流量を使用して、CO2チャンバーでの時限交配中の膣プラグの検出後11.5日後に妊娠中のメスマウスを安楽死させる(材料表を参照)。安楽死の二次的方法として子宮頸部脱臼を行う。すぐに解剖に進みます。
  2. マウス本体を腹側を上に向けて解剖ボードの上に置きます。マウス腹部に70%エタノールを噴霧する。
  3. まっすぐなせんけ鉗子で前部の皮膚を膣口につまんで持ち上げ、持ち上げられた皮膚と下層の層をまっすぐな刃の手術用はさみで両側に45°の角度で切断して腹腔を開き、前肢と後肢のほぼ半分の各側面に広がる「V」形状を生成します。
  4. Semken鉗子を使用して、子宮角の1つをつかみ、外科用はさみで卵管の下と子宮頸部の上を切断します。子宮角を完全に除去できるようにメソメトリウムを切り取ります。
  5. 解剖した子宮角を10 mLの組織学リン酸緩衝生理食塩水(PBS)[0.137 M NaCl, 2.68 mM KCl, 1.76 mM KH2PO4 一塩基, 10.14 mMNa2HPO 4二塩基, pH7.4] に10 cmのシャーレに移す。
  6. 腹腔の反対側にある第2の子宮角は、ステップ1.4-1.5で説明したのと同じ手順を使用して除去する。
  7. 個々の胚の解剖に直ちに進まない場合(すなわち、2匹目の雌マウスが解剖される場合)に、両方の子宮角を含む10cmのシャーレを氷の上に置く。
  8. 解剖実体顕微鏡下で、デュモン#5の細かい鉗子で子宮角から各胚を慎重に解剖します。子宮筋層、デシドゥア、および絨毛膜をゆっくりと引き離す。胚を囲む比較的透明な羊膜を引き裂いて取り除き、胚と胎盤をつなぐ臍帯を切断する。
  9. 切断したプラスチック転写ピペットまたは胚スプーンを用いて、氷上の12ウェル細胞培養プレートの個々のウェル中の組織学PBSの2.5mLに各解剖胚を移す。
    注:複数の遺伝子型の胚を含む可能性のあるごみを扱う場合は、氷上の独自のラベル付き0.5 mLマイクロ遠心チューブにそれぞれを入れて、ジェノタイピングのために各胚を囲む羊膜を保存します。

2. E11.5マウス胚からの上顎突起を解剖する

  1. 組織学PBS10mLを含む3つの10cmペトリ皿を準備し、胚間の回転に使用するためにそれらを氷上に保管する。
  2. 12ウェル細胞培養プレートの個々のウェルから、切断されたプラスチック転写ピペットまたは胚スプーンを用いて氷上の組織学PBSを有する10cmペトリ皿の1つに1つの胚を移す。
  3. 解剖顕微鏡下で、微細な鉗子を使用して顔から各上顎プロセスを分離する。まず、側鼻突起と上顎突起とを隔てる自然圧痕に沿って1つの上顎突起の前側を切断する(図2A)。
  4. 第2に、上顎突起と下顎突起とを隔てる自然のくぼみに沿って上顎突起の後側を切断する(図2A)。
  5. 第3に、上顎突起を完全に分離するために、上顎突起の前側から後側に向かって、上顎突起の眼側で、上顎突起の端部を基準とした垂直方向の切り込みを行う(図2A-C)。
  6. 顔の反対側の上顎プロセスに対してこれらの3つのカットを繰り返します。
  7. 2 mL の小型ラテックス電球を備えた 9 インチパスツールピペットを使用して、解剖した一対の上顎プロセスと約 30 μL の組織学 PBS の小さな液滴を、氷上の標識された 35 mm シャーレに移します (図 2D)。
  8. 各胚についてステップ2.3〜2.7に従い、組織学PBSを含む3つの10cmペトリ皿を胚間の氷上で回転させる。解剖された上顎突起の個々のペアを氷上の別々の35mmペトリ皿に入れる。
    注:上顎プロセス外胚葉および間葉の分離(ステップ2.9〜2.17)は、同腹仔内のすべての胚の上顎プロセスを解剖した後に行うことができる。外胚葉と間葉の両方を含む無傷の上顎突起が必要な場合は、以下のステップ2.18に進みます。
  9. 組織培養PBSに新鮮な2%トリプシン250 μL、組織培養PBSに10%ウシ胎児血清(FBS)250 μLを調製し、氷上で保存する。
  10. 上顎プロセスを含む組織学PBSの最初の小さな液滴とは別の35mmシャーレに、約30μLの2%トリプシンの第2の小さな液滴を置く。パスツールピペットを使用して、一対の上顎プロセスを2%トリプシンの小さな液滴に移します(図2D)。
  11. 皿を氷の上で15分間インキュベートする。
  12. 氷から35mmのペトリ皿を取り出し、解剖顕微鏡の下に置きます。
  13. 微細な鉗子を用いて、各上顎突起から外胚葉の層をゆっくりと慎重に引き離す(図2E)。
    注:外胚葉が無傷のシートで間葉から分離していない場合は、分離を続行する前に、室温(RT)で2%トリプシン中で最大5分間インキュベートしてください。組織が2%トリプシンで崩壊し始めたら、以下に説明するように上顎プロセスを10%FBSに移動してトリプシンを中和し、外胚葉と間葉の分離を終了します。
  14. 上顎突起外胚葉と間葉が分離されたら(図2F)、パスツールピペットを使用して、一対の上顎突起から、約30μLの10%FBSの3番目の小さな液滴に所望の組織を移します(図2D)。
  15. 35mmペトリ皿を氷の上に置き、トリプシン処理を停止します。
  16. 上顎突起組織を氷上で10%FBS中で1〜2分間インキュベートし、その後、パスツールピペットを使用して、両方の上顎突起から、氷上の約30μLの予冷組織学PBSの第4の小さな液滴に組織を移す(前の3つの小さな液滴とは分離する)(図2D)。
  17. 上顎プロセス組織を組織学PBS中で1分間インキュベートし、パスツールピペットの先端で上顎プロセス組織の周りに組織学PBSを穏やかに旋回させ、すべてのFBSが組織から洗い流されるようにする。
  18. パスツールピペットを使用して、一対の上顎プロセス組織を氷上の標識された1.5mL微量遠心チューブに移し、組織学PBSの移送を最小限に抑えた。パスツールピペットで1.5mL微量遠心チューブ内の過剰な組織像PBSを除去します。
  19. 上記の手順に従って、同腹仔の各胚から上顎プロセスを解剖する。
  20. サンプルを直ちに処理して、全細胞タンパク質溶解物(下記)を単離するか、-80°Cで長期間保存します。長期保存する前に、1.5 mL マイクロ遠心チューブをドライアイス上の 100% EtOH の浴中で 5 分間スナップフリーズします。

3. マウス上顎突起から全細胞タンパク質溶解物を単離する

  1. 上顎プロセスが以前に-80°Cで凍結していた場合は、氷上で解凍する。
  2. 0.1 mLの氷冷NP-40溶解緩衝液(20 mM Tris HCl pH 8、150 mM NaCl、10% グリセロール、1% ノニデット P-40、2 mM EDTA、4 °C 保存)をプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤 (1x 完全ミニプロテアーゼ阻害剤カクテル [水に溶解; -20 °C 保存]、1 mM PMSF [イソプロパノールに溶解; 4°C 保存]) と共に加えます。 氷上で使用直前に10 mM NaF[-20°Cで保存;凍結/解凍を避け]、1 mMNa3VO4[-20°Cで保存]、25 mM β-グリセロリン酸[4°Cで保存])を加えた。
    注:細胞分画は、細胞質、核、膜、またはミトコンドリアタンパク質画分を単離するために代替的に行うことができる。
  3. ピペットマンを200μLで10回上下させる。
  4. ボルテックスを10秒間、次いで200μLのピペットマンで上下に10回ピペットする。気泡の発生を避けてください。
  5. チューブリボルバー付きの1.5 mL/2 mLパドルを使用して端から端まで回転させながら、4 °C で 2 時間インキュベートします。
  6. サンプルを13,500 × g で4°Cで20分間遠心分離します。
  7. 上清を200 mLピペットマンで氷上の新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに集めます。
  8. 実験サンプル用のタンパク質溶解液10 μL+NP-40溶解バッファー10 μL、およびNP-40溶解バッファー(画分V)のウシ血清アルブミン(画分V)(BSA)を3~5希釈液(BSA)をNP-40溶解バッファーでタンパク質標準として0.25~2.0 mg/mLの範囲で使用して、タンパク質アッセイキットでタンパク質濃度を定量します。
  9. ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) (ステップ 5) を続行するか、残りの溶解物をドライアイス上で急速凍結し、-80 °C で長期間保存します。

4. 初代および/または不死化マウス胚性口蓋間葉(MEPM)細胞から全細胞タンパク質溶解物を単離する

注:E13.5マウス胚および不死化MEPM細胞からの初代MEPM細胞の単離および培養は、以前に記載されている32、33、34。成長因子による細胞の刺激(ステップ4.1〜4.7)は、細胞溶解の前に行うことができる。非刺激細胞が必要な場合は、以下のステップ4.8に進みます。

  1. 真空システムに取り付けられた5.75インチパスツールピペットを使用して、6cm細胞培養皿中の約70%コンフルエントでMEPM細胞から増殖培地[ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)を50U/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、10%FBSで吸引する。
  2. 1mLの組織培養PBSで細胞を洗浄する。
  3. 37°Cの水浴中で予備加温した血清飢餓培地3mL[DMEMとペニシリン50U/mL、ストレプトマイシン50μg/mL、2mM L-グルタミン、0.1%FBS]を加える。
  4. 37°Cおよび5%CO2で23 時間インキュベートする。
  5. 血清飢餓培地を、3 mL の新鮮な、予め加温した血清飢餓培地と交換する。
  6. 37°Cおよび5%CO2 で1時間インキュベートする。
  7. 所望の時間の間、経験的に決定された濃度で選択した成長因子で細胞を刺激する。
  8. 真空システムに取り付けられた5.75インチパスツールピペットを使用して、MEPM細胞から80%〜100%コンフルエントで培地を吸引する。
  9. 氷冷組織培養PBS(6cm細胞培養皿の場合は1mL)で細胞を2回洗浄する。最後の洗浄中にプレートを横に傾けて、すべての組織培養PBSが吸引されるようにする。
  10. 使用直前にプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加した氷冷NP-40溶解バッファー(6cm細胞培養皿の場合は0.1mL)を氷上に加えて細胞を溶解する。
  11. プレートを氷上で5分間インキュベートし、プレートを完全にカバーできるようにします。
  12. 予冷されたセルリフターを使用してプレートから細胞をこすり落とし、細胞懸濁液を氷上の予冷された1.5mLマイクロ遠心チューブに移す。
  13. 細胞懸濁液を4°Cで30分間インキュベートし、チューブリボルバーを備えた1.5mL/2mLパドルを用いてエンドオーバーエンドを回転させた。
  14. 上記の手順 3.6 ~ 3.9 に進みます。

5. リンタンパク質に対するマウスフェイシャルプロセスおよび/またはMEPM細胞からの全細胞タンパク質溶解物のウェスタンブロッティング

  1. SDS-PAGE用の全細胞タンパク質溶解物サンプルを調製する。
    1. ロードするタンパク質の量を決定します, 組織/細胞内のタンパク質の存在量に応じて;12.5μgは、通常、全細胞タンパク質溶解物中の強固に発現されたタンパク質に十分である。
    2. 等量の2x Laemmli緩衝液[20%グリセロール、4%SDS、0.004%ブロモフェノールブルー、0.125MトリスHCl pH 6.8]を、使用直前に10%β-メルカプトエタノールを加えて加える。
      警告: β-メルカプトエタノールは、皮膚または眼に腐食性があり、有毒で、飲み込むと危険であり、水生毒性があります。手袋、実験用コート、フェイスシールド、安全メガネを着用して、化学ヒュームフードで取り扱います。環境安全衛生ガイドラインに従って廃棄してください。
    3. ボルテックスでミックスします。
    4. サンプルをミニドライバス中で100°Cで5分間加熱する。
    5. ボルテックスで混合し、サンプルを氷の上に置きます。
    6. 9,400 × g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。
    7. SDS-PAGEゲルにロードする前にサンプルを氷上に短時間置くか、-20°Cで長期間保存してください。
  2. 4%〜15%プレキャストタンパク質ゲルおよび電気泳動緩衝液35を有する電気泳動細胞を用いてSDS−PAGEを行う。
  3. 使用直前に0%〜20%メタノール(100kDaを超えるタンパク質の場合は0%〜10%、100kDa未満のタンパク質の場合は20%)を添加した転写緩衝液を使用して、タンパク質をポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜に電気転写する35。
  4. 目的のリンタンパク質の膜およびプローブを遮断する。
    1. 転写後、膜を1xトリス緩衝生理食塩水(TBS)[20mM Tris、0.137M NaCl、pH 7.6]でウェスタンブロットボックスで5分間洗浄する。
    2. 膜を5 mLのブロッキングバッファー[1x TBS、0.1% Tween 20、5% w/v BSA;よく混合し、ルアーチップ付き10 mLシリンジを使用して0.2 μmの孔を有する25 mmシリンジフィルターでろ過]で1時間、オービタルシェーカーで攪拌しながらウェスタンブロットボックスで1時間インキュベートする。
      注:牛乳にはリンタンパク質カゼインが含まれており、高い非特異的なバックグラウンドシグナルを引き起こす可能性があるため、リンタンパク質を特徴付ける際にブロッキング剤として使用しないでください。
    3. TBS-T[1x TBS, 0.1% Tween 20]で膜を3回ずつ5分間洗浄し、オービタルシェーカーで攪拌しながらウェスタンブロットボックスに入れます。
    4. ブロッキングバッファーで希釈した5 mLの一次抗体のメンブレンを、チューブリボルバーを備えた50 mLパドルを用いて50 mL円錐形チューブ中で4°Cで一晩インキュベートする。
      注: ウェスタンブロッティングの適切な濃度については、抗体データシートを参照してください。
    5. TBS-TでRTで3回、それぞれ5分間、オービタルシェーカーで攪拌しながらウェスタンブロットボックスで膜を洗浄します。
    6. 膜を、ブロッキングバッファーで希釈した適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体の5mL中で、オービタルシェーカー上で撹拌しながらウェスタンブロットボックス内で1時間インキュベートする。
    7. オービタルシェーカーで攪拌しながら、ウェスタンブロットボックス内のTBS-Tで膜を5分間3回洗浄する。
    8. 膜を増強化学発光(ECL)ウェスタンブロッティング基質[ボトル1および2から等容量を混合;大型(8.6cm×6.7cm)膜に対してそれぞれ0.5mL]で1分間インキュベートし、膜全体がECLウェスタンブロッティング基質に継続的に曝露されるようにする。
    9. 余分なECLウェスタンブロッティング基板の膜をドレインし、化学発光イメージャーを用いて直ちに現像する。
  5. メンブレンを剥ぎ取り、目的のタンパク質全体を再プローブします。
    1. PVDF膜を、使用直前に8 μL/mLのβ-メルカプトエタノールを加えた5 mLのストリッピングバッファー[2% SDS、62.5 mM Tris HCl pH 6.8]を含むポリエチレンライニング付きの透明パウチに入れます。
    2. ハイブリダイゼーションオーブン中で毎分11回転でロッキングしながら、50°Cで30分間インキュベートする。
    3. TBS-TでRTで3回、それぞれ5分間、オービタルシェーカーで攪拌しながらウェスタンブロットボックスで膜を洗浄します。
    4. 上記の手順 5.4.2-5.4.9 に進みます。
  6. ImageJソフトウェアを用いてウェスタンブロットバンド密度を定量し、目的のリン酸化タンパク質のレベルを目的の総タンパク質のレベル36に正規化する。

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結果

マウスの顔面プロセスおよび/または培養口蓋間葉系細胞から単離されたタンパク質のリン酸化を特徴付けようとする場合、代表的な結果は、対応する総タンパク質バンドの高さまたはその近くで実行される抗リンタンパク質抗体によるウェスタンブロッティング後の、明確で再現性のあるバンドを理想的に明らかにするであろう(図3).しかしながら、タンパク質の広範なリン酸化が起こる場合、全タンパク質バンドのそれと比較してリンタンパク質バンドのわずかな上方シフトがあり得る。さらに、タンパク質の複数のアイソフォームが組織内に存在し、それぞれがリン酸化されている場合、またはタンパク質が可変的に追加のPTMを受ける場合、抗リンタンパク質抗体によるウェスタンブロットに複数のバンドが現れ得る。目的のリンタンパク質についてシグナルが観察されない場合、目的の全タンパク質が検出されているにもかかわらず、タンパク質が選択されたコンテキストでリン酸化されないか、またはプロトコルに技術的な問題が生じている可能性があります。後者の場合、全細胞溶解物のウェスタンブロッティングを抗ホスホセリン/スレオニンおよび/または抗ホスホチロシン抗...

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ディスカッション

ここで説明するプロトコルにより、研究者は頭蓋顔面発達中の重要なリン酸化依存性シグナル伝達事象を堅牢かつ再現可能な方法でプローブすることができます。このプロトコルには、データの適切な収集と結果の分析を保証するいくつかの重要なステップがあります。マウスの顔面プロセスおよび/または培養口蓋間葉細胞からリンタンパク質を単離するかどうかにかかわらず、指示されたときにすべての試薬および材料を氷上に保持しながら、迅速かつ効率的に移動することが不可欠です。氷の低温は細胞内の代謝活性を低下させ、それによってリン酸化タンパク質をホスファターゼ活性38から保護し、高いタンパク質収率を維持する。上顎プロセスの解剖中に3つの別々の10cmペトリ皿を使用することにより、すべての解剖が十分に予冷された組織学PBSで行われることを確実にする。関連して、このタンパク質単離プロトコルの追加的で必須の成分は、すべての溶解緩衝液におけるホスファターゼ阻害剤の使用である。これらの試薬はまた、目的のタンパク質39、40上のリン酸基を保護し...

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開示事項

著者らは開示するものは何もありません。

謝辞

129S4マウスは、シナイ山のアイカーン医科大学のフィリップ・ソリアーノ博士からの贈り物でした。この研究は、国立衛生研究所(NIH)/国立歯科頭蓋顔面研究所(NIDCR)R01 DE027689およびK02 DE028572からK.A.F.、F31 DE029976からM.A.R.、F31 DE029364からB.J.C.D.への資金で支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
機器
BlockResearch Products International Corp400783
Image Lab ソフトウェア付きBio-Rad1708265化学発光イメージャー
CO2 インキュベーター、エアジャケットVWR10810-902
解剖ボード、11 x 13 inFisher Scientific09 002 12
電気泳動細胞、4ゲル、ミニトランスブロットモジュール付きミニプレキャストゲル用Bio-Rad1658030
ハイブリダイゼーションオーブンFisher ScientificUVP95003001
Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf)Sigma AldrichZ604062
Mini dry bath研究製品International Corp400780
オービタルシェーカーVWR89032-092
pH メーターVWR89231-662
SDS-PAGEBio-Rad1645050
長方形のアイスパン、マキシ 9 Lフィッシャーサイエンティフィック07-210-093
スタンド付き Stemi 508 実体顕微鏡 K LAB、LED リングライトZeiss4350649020000000解剖顕微鏡
タイマーVWR62344-641
チューブリボルバーフィッシャーサイエンティフィック11 676 341
ボルテックスミキサーフィッシャーサイエンティフィック02 215 414
ウォーターバスVWR89501-472
ウエスタンブロットボックスフィッシャーサイエンティフィックNC9358182
<ストロング>材料
細胞培養皿、6 cmフィッシャーサイエンティフィック12-565-95
細胞培養プレート、12ウェルフィッシャーサイエンティフィック07-200-82
セルリフターフィッシャーサイエンティフィック08-100-240
CO2sub>AirgasCD USP50
コニカルチューブ、ポリプロピレン、50mLフィッシャーサイエンティフィック05-539-13
デュモン #5 ファイン フォーセプスファイン サイエンス ツール11254-20
胚スプーンファイン サイエンス ツール10370-17
マイクロ遠心チューブ、0.5 mLVWR89000-010
マイクロ遠心チューブ、1.5 mLVWR20170-038
パスツールピペット、5.75インチフィッシャーサイエンティフィック13-678-6A
パスツールピペット、9 インチVWR14672-380
シャーレ、10 cmフィッシャー サイエンティフィック08-757-100D
シャーレ、35 mmフィッシャー サイエンFB0875711YZ
ポーチ、透明、ポリエチレン ライニングフィッシャー サイエンティフィ01-812-25B
PVDF メンレン フィッシャー科学IPVH00010
セムケン鉗子ファインサイエンスツール11008-13
小さなラテックス電球、2 mLVWR82024-554
手術用ハサミファインサイエンスツール14002-12
シリンジフィルター、25 mm、0.2 μm 細孔径フィッシャー・サイエンティフィック09-740-108
ルアーチップ付きシリンジ、10 mLVWRBD309604
トランスファーピペットフィッシャー・サイエンティフィック13-711-22
ウェスタンブロットカセット開口レバーバイオ・ラッド4560000
Whatmann 3MM chr クロマトグラフィーペーパーフィッシャー・サイエンティフィック05-714-5
試薬
4-15% プレキャストタンパク質ゲル、10ウェル、30 & マイクロ;Lバイオ・ラッド4561083
β;-グリセロリン酸二ナトリウム塩水和物Sigma AldrichG5422-25Gストック濃度 1 M
&β;-メルカプトエタノールSigma AldrichM3148-100ML
ウシ血清アルブミン、フラクションV、ヒートショック試験フィッシャーサイエンティフィックBP1600-100
ブロモフェノールブルーフィッシャーサイエンティフィック
完全ミニプロテアーゼ阻害剤カクテルSigma Aldrich11836153001ストック濃度 25x
DC タンパク質アッセイキット IIBio-Rad500-0112
DMEM、高グルコースGibco11965092
E7、マウスモノクローナルβチューブリン一次抗体、濃縮物 0.1 mLDevelopmental Studies Hybridoma BankE71:1,000
ECL ウェスタンブロッティング基質Fisher ScientificPI32106低ピコグラム範囲
ECL ウェスタンブロッティング基質Genesee Scientific20-302B低フェムトグラム範囲
電気泳動バッファー、5 Lバイオ・ラッド1610772ストック濃度 10x
エタノール、200プルーフ、1 ガロンDecon Laboratories, Inc.2705HCEtOH
エチレンジアミン四酢酸、Di Na塩二水素。(結晶性POWD./電気泳動。Fisher ScientificBP120-500EDTA
ウシ胎児血清、特性評価済み、米国原産、500 mLHyCloneSH30071.03
グリセロール (認定 ACS)Fisher ScientificG33-4
HRP 標識二次抗体、ヤギ抗マウス IgGJackson ImmunoResearch Laboratories115-035-1461:20,000
HRP 標識二次抗体、ヤギ抗ウサギIgGジャクソン免疫研究所111-035-0031:20,000
塩酸溶液、6N (認証)フィッシャーサイエンティフィックSA56-500HCl
イゲパル Ca - 630 非イオン性洗剤フィッシャーサイエンティフィICN19859650ノニデット P-40
イソプロパノール (HPLC)フィッシャーサイエンティフィックA451-1
L-グルタミンギブコ25030081ストック濃度 200 mM
メタノールFisher ScientificA454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) 一次抗体Cell Signaling Technology9102S1:1,000; 抗 Erk1/2
PDGF-BB 組換えリガンド, ラットFisher Scientific520BB050
PDGF Receptor β 一次抗体Cell Signaling Technology3169S1:1,000
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15140122ストック濃度 100 U/mL、100 & マイクロ;g/mL
フェニルメタンスルホニルフッ化物、99%Fisher ScientificAC215740100PMSF; ストック濃度 100 mM
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) 一次抗体Cell Signaling Technology9101S1:1,000, 抗リン酸化 Erk1/2
Phospho-PDGF 受容体 & α; /PDGF 受容体 &β; 一次抗体Cell Signaling Technology3170S1:1,000
塩化カリウム(白色結晶)フィッシャーサイエンティフィックBP366-500KCl
リン酸カリウム一塩基性(白色結晶)フィッシャーサイエンティフィックBP362-500KH<サブ>2PO<サブ>4
>SDS溶液、10%バイオ・ラッド161-0416
塩化ナトリウム(結晶性/生物学的、認証)フィッシャーサイエンティフィックS671-3NaCl
フッ化ナトリウム(粉末/認定ACS)フィッシャーサイエンティフィックS299-100NaF;1回限りの使用のためのアリコート;ストック濃度1 M
オルトバナジン酸ナトリウム、99%フィッシャーサイエンティフィAC205330500 Na<サブ>3VO<サブ>4;ストック濃度100 mM
リン酸二塩基性無水ナトリウム(粒状または粉末/認定ACS)フィッシャーサイエンティフィックS374-500Na2HPO4
Tissue culture PBSFisher Scientific21-031-CV
Transfer buffer, 5 LBio-Rad1610771Stock Concentration 10x
Tris base (白色結晶または結晶性粉末/分子生物学)Fisher ScientificBP152-1
TrypsinBioWorld21560033
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
ウェスタンブロット分子量マーカーBio-Rad1610374
Software
ImageJ softwareNational Institutes of Health
Animals
Female 129S4 miceフィリップ・ソリアーノ博士、マウントサイナイのアイカーン医科大学からの贈り物
ミニドライバス用ティフィック ック ブ済み AC403140050ック ック

参考文献

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