蛍光タンパク質マーカーによる酵母オルガネラの可視化

サマリー

ここでは、出芽酵母 Saccharomyces cerevisiaeの生細胞イメージングにおける蛍光タンパク質ベースのオルガネラマーカーのセットの使用について説明します。

要約

出芽酵母である Saccharomyces cerevisiaeは、オルガネラの機能とダイナミクスを研究するための古典的なモデルシステムです。これまでの研究では、核、小胞体(ER)、ゴルジ体、エンドソーム、液胞、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、脂肪滴、オートファゴソームなどの主要なオルガネラや膜内構造に対する蛍光タンパク質ベースのマーカーを構築してきました。ここで紹介するプロトコールでは、酵母形質転換のためのDNA調製、形質転換体の選択と評価、蛍光顕微鏡観察、期待される結果など、これらのマーカーを酵母で使用する手順を説明しています。このテキストは、他のバックグラウンドから酵母オルガネラ研究の分野に参入している研究者を対象としています。重要な手順のほか、顕微鏡ハードウェアに関する考慮事項やいくつかの一般的な落とし穴に関する技術的な注意事項についても説明します。これは、人々が生細胞蛍光顕微鏡で酵母の細胞内実体を観察するための出発点を提供します。これらのツールや方法を使用して、タンパク質の細胞内局在を特定し、タイムラプスイメージングで目的のオルガネラを追跡することができます。

概要

膜結合オルガネラへの細胞内区画化は、真核細胞の組織化における一般的な原則です。各細胞小器官は特定の機能を果たします。真核生物生物学の他の多くの側面と同様に、出芽酵母であるSaccharomyces cerevisiaeは、オルガネラの組織化とダイナミクスの基本原理を解明する古典的なモデルシステムとなっています。例としては、タンパク質分泌経路、ペルオキシソームタンパク質インポート経路、オートファジー経路^1,2,3の独創的な発見があります。

典型的な栄養豊富な条件では、成長の早い酵母細胞には、小胞体(ER)、初期ゴルジ体、後期ゴルジ体/初期エンドソーム、後期エンドソーム、液胞、およびミトコンドリアが含まれます。一部のペルオキシソーム、脂質液滴、およびオートファゴソーム(最初の2つよりもさらに少なく、主にCvt小胞型で、栄養豊富な条件^{で存在する4})も存在しますが、特定の培養条件(脂質が豊富な培地、飢餓培地など)下ほど目立ちません。他の一般的な真核生物モデルと比較して、酵母細胞は非常に小さいです。一般的な酵母細胞の直径は約5μmですが、ほとんどの動物細胞や植物細胞の直....

プロトコル

1.酵母株の構造

1. マーカープラスミドと適切な酵母株を入手します。
   注:プラスミドはAddgeneから入手できます。このプロトコルは、例として TN124 (MATa ura3 trp1 pho8Δ60 pho13Δ::LEU2)、BY4741 (MATa leu2Δ0 ura3Δ his3Δ1 met15Δ0)、および DJ03 (BY4741 trp1Δ::MET15) を例に利用します。科学的な問題の性質以外に、系統選択に関する重要な考慮事項の1つは、選択マーカーの適合性です。ここで説明するオルガネラマーカープラスミドは、選択マーカーとして URA3 と TRP1 を使用します。したがって、レシピエント株の遺伝子型は ura3 および trp1である必要があります。それ以外の場合は、菌株またはプラスミドを変更する必要があります。
2. 以下のレシピに従って酵母培地を調製します。
   注:SMD(合成最小デキストロース;2%グルコース、0.67%酵母窒素塩基(YNB)、アミノ酸なし、30 mg / Lアデニン、30 mg / Lリジン、30 mg / Lメチオニン、20 mg / Lヒスチジン、20 mg / Lウラシル、50 mg / Lトリプトファン、50....

結果

細胞小器官の形態とダイナミクスは、酵母細胞が外部および内部のシグナルに応答するにつれて変化する可能性があります。ここでは、中対数期の酵母オルガネラの代表的な画像を示します(図3A、B)。前述のように、いくつかのオルガネラは明確な形態学的特徴を持っているため、他のオルガネラマーカーと広範囲に比較しなくても簡単に認識できます。これらには、ER、ミトコンドリア、および液胞が含まれます。ここで示しているものを含む一部の実験室株では、液胞の核分裂融合バランスが歪んでおり、多くの対数期細胞が単一の液胞を含んでいることに注意してください。ゴルジ体装置、エンドソーム、脂肪滴、およびペルオキシソームは、一般に、通常の光学顕微鏡で輪郭を分解するには小さすぎます。したがって、それらはすべて細胞質のドットとして表示されます。それらの同一性を確かめるためには、他のオルガネラマーカーとの相互比較が必要であり、我々は本マーカーセットを対数期細胞⁷に対して行った。

イントロ.......

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、他の研究分野からエントリーしてイメージング酵母オルガネラを探索する人々にとって簡単なスタートを提供します。特定のトピックに移る前に、イメージングソフトウェアの自動機能の過度の使用を控える必要があることをもう一度強調したいと思います。顕微鏡画像は単なる美しい画像ではなく、科学的なデータであるため、その取得と解釈はそれに応じて扱われるべきです。特に重要なのは、画像収集パラメーターを慎重に選択し、16 ビット画像と 8 ビット画像の概念に慣れ親しんでいることです。

このプロトコルには、SMD、SMD+CA、YPD、SD-Nの4種類の酵母メディアがリストされています。SMDは「合成最小デキストロース」の略です。SMDの利点は、自家蛍光が少ないことです。したがって、SMDは蛍光イメージングに適した媒体です。SMD+CAにはカサミノ酸が含まれており、SMDよりも栄養が豊富ですが、純粋に合成ではなくなったという制限があります。栄養が豊富なYPDは、酵母細胞の培養のための一般的な培地としては適しています.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アデニン	サンゴン バイオテック	A600013
カサミノ酸	サンゴン バイオテック	A603060
コンカナバリン A from canavalia ensiformis (ジャックビーン)	シグマ アルドリッチ	L7647
D-グルコース	サンゴン バイオテック	A501991
フィジー			https://fiji.sc/
ガラス底ペトリ皿	ネスト	706001	Φ35 mm
ImajeJ			https://imagej.net/
UPLXAPO 100X油浸対物レンズ、Lumencor Spectra X光源、浜松オルカFlash4.0 LTカメラを搭載した	倒立蛍光顕微鏡	リンパス
L-ヒスチジン	サンゴン バイオテック	A604351
L-ロイシン	サンゴン バイオテック	A100811
L-リジン	サンゴン バイオテック	A602759
L-メチオニン	サンゴン バイオテック	A100801
L-トリプトファン	サンゴン バイオテック	A601911
顕微鏡カバーガラス	CITOTEST	102222222C	22 mm x 22 mm、0.16–0.19 mm
顕微鏡スライド	CITOTEST	1A5101	25 mm x 75 mm、1–1.2 mm
ペプトン	サンゴン バイオテック	A505247
ウラシル	サンゴン バイオテック	A610564
Visiview	Visitron System GmbH		https://www.visitron.de/products/visiviewr-software.html
酵母抽出	サンゴン バイオテック	A100850
アミノ酸を含まない酵母窒素塩基	サンゴン バイオテック	A610507
アミノ酸・硫酸アンモニウム不使用YNB	Sangon Biotech	A600505

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