Method Article

マイクロプレートリーダーを使用した細菌増殖データのハイスループット定量の再現性と精度の向上

DOI:

10.3791/63849

⸱

July 27th, 2022

 ,  ,  , 
1Chemical and Biological Engineering Department, University of British Columbia, 2Process Engineering and Applied Science, Dalhousie University, 3Food Science and Technology, Dalhousie University, 4Center for Water Resources Studies, Civil and Resource Engineering, Dalhousie University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、成長曲線、成長率、最大成長率などの成長データを測定するためのハイスループットプロトコルを紹介します。このプロトコルは、2つのバイオフィルム産生細菌を使用して検証および検証されました。この研究で適用された結果とアプローチは、マイクロプレートリーダーを使用して他のハイスループットプロトコルに拡張できます。

Abstract

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この研究は、96ウェルプレートでの細菌の増殖をモニタリングし、最大増殖速度を分析するための、再現性と信頼性に優れたハイスループットプロトコルを開発することを目的としています。2つの細菌種の成長曲線と最大成長率を決定しました。(i)まぶたの結露、(ii)光路長補正、(iii)接種サイズ、(iv)サンプリング時間間隔、(v)空間バイアスなどの問題を調査しました。プロトコルの再現性は、3 つの独立した技術的複製によって評価され、実行間の標準偏差は 0.03 でした。 Bacillus mycoides および Paenibacillus tundrae の最大成長率は、それぞれ(平均±SD)0.99 h-1 ± 0.03 h-1 および0.85 h-1 ± 0.025 h-1であると決定されました。これらの細菌は、凝集する親和性があるため、光学的に監視するのがより困難です。この研究は、マイクロプレートリーダーで信頼性、正確性、再現性のあるデータを得るためには、接種サイズ、経路長補正、蓋の温暖化、サンプリング時間間隔、ウェルプレートの空間バイアスが非常に重要であることを示しています。開発されたプロトコルとその検証ステップは、マイクロプレートリーダーやハイスループットプロトコルを使用して他の方法に拡張できるため、研究者の生来のエラーと材料コストを削減できます。

Introduction

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細菌のメカニズムや代謝の研究など、マルチオミクス操作への関心が高まるにつれ、成長データの記録など、ハイスループットで自動化された方法の重要性が強調されています1,2。最大成長率などの速度論的パラメータを含む成長データは、さまざまな物理的、化学的、および抗菌的条件に対する細菌の応答を特徴付けるのに役立ちます。成長率データは、潜在的な遺伝子型と表現型の連鎖1を明らかにしたり、食品生産物3,4の微生物安全性と貯蔵寿命を示すために利用される標準的な応答変数です。適応的実験室進化5,6,7、ゲノムワイドスクリーニング、特定の化学アッセイ8、およびさまざまな前方遺伝スクリーニング9などの技術は、結果を評価するために成長率に依存しています。

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Protocol

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注:このプロトコルのすべての手順は、無菌状態(つまり、2つの炎またはバイオセーフティキャビネットの間)で実行する必要があります。すべての材料とツールは20分間オートクレーブ処理されます。このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、およびソフトウェアの詳細については、 資料の表 を参照してください。手袋をはめた手は消毒し、手指消毒剤または70%アルコール溶液で少なくとも1分間濡らし、その後安全キャビネットから取り出さないでください。そうでない場合は、安全キャビネットに手を戻す前に消毒手順を繰り返す必要があります。注意: 直火を使用する前に、消毒剤が完全に蒸発していることを確認してください。

注:2つの細菌は、バイオフィルムを生成する能力について前に説明したように、飲料水の生物濾過から分離されました27 。これらは、full-16S rRNAシーケンシングによって同定され、 Bacillus mycoides(SAMN10518261) および Paenibacillus tundrae(SAMN10452279)としてNCBIに提出されました。

1. グリセロール中のバクテリアストックの調製

  1. 3 gのトリプシン大豆ブロス(TSB)粉末を秤量し、100 mLの蒸留水に溶解します。ブロ....

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Results

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OD読み取り検証とパス長補正係数
B. mycoides培養物の分割サンプルを異なる時点で採取し、マイクロプレートリーダーと分光光度計を使用して測定しました(図1A)。この手順は、さまざまなデバイス間で結果を検証するために行われました。OD600 のデータは相関していましたが、一致しませんでした(図 1B)。相関は0.55(95%信頼区間[CI]:0.53-0.58、R2 = 0.99)の傾きで線形であり、2つの機器間のオフセット(傾き)が一定であることを示しています。適合度検定では、二乗平均平方根誤差(RMSE)と推定標準誤差(Sy.x)が0.01であり、高い相関精度が確認されました。

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Discussion

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マイクロプレートリーダーは、一貫した再現性のある成長率を得ることができます。この技術により、人為的ミスが最小限に抑えられ、ハイスループットなサンプリングが可能になります。サンプルあたりに必要な培養量が少ないため、このアプローチは、フラスコや試験管を使用した細胞数に代わる魅力的で低コストの代替手段となります。マイクロプレートリーダーは、大きなサンプルサイズを可能にするため、統計検出力が向上し、コストと労力を低く抑えながら信頼性の高い成長率の計算が容易になります。

この記事では、成長データを測定および分析するための詳細なプロトコルについて説明します。このプロトコルは 、B. mycoides および P. tundrea で検証されました。これらの細菌は、バイオフィルムを生成する能力があるため、実物大の飲料水バイオフィルターから分離され、成長データの評価がより困難になりました。

信頼性と精度の高い測定のためのいくつかの重要な要因.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

Acknowledgements

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この研究は、Natural Sciences and Engineering Research Council(NSERC)/Halifax Water Industrial Research Chair in Water Quality and Treatment(助成金番号)によって資金提供されました。IRCPJ 349838-16)。著者チームはまた、この記事のレビューにAnita Taylorの助けに感謝したいと思います。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
遠心分離機 Eppendorf5810 R
遠心分離チューブ - 15 mL サーモフィッシャー - サイエンティフィック 339650滅菌
遠心チューブ-50mL サーモフィッシャー - サイエンティフィック 339652滅菌
使い捨て接種ループ、10&マイクロ;Lコール・パーマー UZ-06231-08滅菌三
角フラスコ - 250 mL コール・パーマー  UZ-34502-59ガラス 
イソプロパノール サーモフィッシャー - サイエンティフィック 396982500≥99.0
リン酸緩衝生理食塩水 シグマ-アルドリッチP4417
ピペットチップ1,000&マイクロ;Lサーモフィッシャー - サイエンティフィック  UZ-25001-76
ピペットチップ 10mL サーモフィッシャー - サイエンティフィック UZ-25001-83
ペットチップ200µLサーモフィッシャー - サイエンティフィック UZ-25001-85
ピペットチップ 5mL サーモフィッシャー - サイエンティフィック  UZ-25001-80
ピペッター1,000µLコール・パーマー UZ-07909-11
ピペッター10mLコールパーマー UZ-07909-15
ピペッター200&マイクロ;Lコール・パーマー  UZ-07909-09
ペッター5mL コール・パーマー UZ-07859-30
トリプシン大豆ブロス Millipore22091微生物学に適しています
ピピ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reuß, D. R., et al. Large-scale reduction of the Bacillus subtilis genome: Consequences for the transcriptional network, resource allocation, and metabolism. Genome Research. 27 (2), 289-299 (2017).
  2. Sparkes, A., et al.

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Bacterial GrowthMicroplate ReaderHigh Throughput QuantificationGrowth Rate Analysis96 Well PlatesPathlength CorrectionInoculation SizeSampling IntervalSpatial BiasTechnical Replication
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