方法論記事

液体および氷中のウイルス集合体の高解像度イメージングの進歩

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DOI：

10.3791/63856

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2022年7月20日

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1Department of Biomedical Engineering, Pennsylvania State University, 2Department of Materials Science and Engineering, McMaster University, 3Bioinformatics and Genomics Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 4Molecular, Cellular, and Integrative Biosciences Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 5Materials Research Institute, Pennsylvania State University, 6Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 7Applications team, Direct Electron, 8Application Scientist, Protochips, Inc., 9Department of Biology, Wake Forest University

* These authors contributed equally

この記事について

Retraction Notice

This article, Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice, has been retracted at the request of the Editors-in-Chief due to concerns about the integrity of the data presented. These concerns included: (a) Figure 3 was found to contain noise without structural features expected for a protein capsid; (b) critical half-map data necessary to verify resolution claims were not deposited; (c) there was a lack of system logs or controls to rule out stage drift regarding observed movements in Figure 3; and (d) the absence of protocols to address Brownian motion and beam-induced drift significantly weakened the reliability of the findings.<br/><br/>The corresponding author's indication she principally relied on RMEASURE program did not sufficiently address the publisher's concerns. After consulting external experts, the Editors-in-Chief concluded that the issues remain unresolved, and the data do not meet JoVE's standards for scientific reliability and reproducibility, requiring retraction. The corresponding author disagrees with the grounds for retraction. Co-authors DiCecco, Grandfield and Bator agree with the retraction. Other co-authors were unavailable for comment.

サマリー

ここでは、透過型電子顕微鏡を使用してナノスケールでの液体EMおよびクライオEM分析に適したウイルスアセンブリを調製するためのプロトコルについて説明します。

要約

液体電子顕微鏡(液体EM)への関心は、科学者がナノスケールでリアルタイムのプロセスを観察できるようになったため、近年急上昇しています。高解像度のクライオEM情報と動的観測を組み合わせることは、ミリ秒以上の速いタイムスケールで多くのイベントが発生するため、非常に望ましいです。柔軟な構造に関する知識の向上は、SARS-CoV-2などの新たな病原体と戦うための新しい試薬の設計にも役立ちます。さらに重要なことに、流動環境で生物学的材料を見ると、人体におけるそれらの性能を垣間見ることができます。ここでは、液体およびガラス質氷中のウイルス集合体のナノスケールの特性を調べるために新しく開発された方法を示します。この目標を達成するために、明確に定義されたサンプルがモデルシステムとして使用されました。サンプル調製方法と代表的な構造情報を並べて比較します。サブナノメートルの特徴は、~3.5-Å-10 Åの範囲で分解された構造について示されています。この補完的なフレームワークをサポートする他の最近の結果には、ワクチン候補の動的な洞察と液体で画像化された抗体ベースの治療法が含まれます。全体として、これらの相関アプリケーションは、分子動力学を視覚化する能力を向上させ、人間の健康と病気での使用に関する独自のコンテキストを提供します。

概要

生物医学研究は、新技術の開発を通じて人間の健康と病気についての理解を深めます。高解像度イメージングは、ナノワールドに対する私たちの見方を変えており、細胞や分子を絶妙な詳細で研究することを可能にします1,2,3,4,5。ソフトポリマー、タンパク質集合体、ヒトウイルスなどの動的コンポーネントの静的な情報は、それらの複雑な物語の限られたスナップショットしか明らかにしません。分子実体がどのように機能するかをよりよく理解するためには、それらの構造と機能を共同で調査する必要があります。

原子レベルで薄いグラフェンやシリコンベースのマイクロチップなどの材料の製造における最近の進歩は、透過型電子顕微鏡(TEM)を使用したリアルタイムの構造機能解析の新しい機会を提供します。これらの材料は、ライブEMイメージング6、7、8、9、10、11用の密閉チャンバーを作成できます。室温がクライオEMと相関する液体EMの新しい分野は、溶液中の硬質または軟質材料の前例のないビューを提供し、科学者が標本の構造とダイナミクスを同時に研究することを可能にします。液体EMアプリケーションには、癌幹細胞と相互作用する治療用ナノ粒子のリアルタイム記録や、ウイルス病原体の分子的複雑さの変化が含まれます12,13,14。

方法論の進歩がクライオEM分野の分解能革命に拍車をかけたように、科学界のハイスループットツールとしての液体EMの使用を拡大するには、新しい技術と方法が必要です。ここで紹介する方法の全体的な目標は、液体EM試料調製プロトコルを合理化することです。開発された技術の背後にある理論的根拠は、液体とクライオEMの両方のデータ収集に適した新しいマイクロチップ設計とオートローダーデバイスを採用することです(図1)7、14、15、16、17。アセンブリは、セッションごとに複数のサンプルを収容できるKriosやF200C TEMなどの自動機器用の標準グリッドクリップを使用して機械的にシールされています(図2)。この方法論は、標準的なクライオEMアプリケーションを超えて高解像度イメージングの使用を拡大し、リアルタイムの材料分析のより広い目的を実証します。

現在のビデオ記事では、市販の検体ホルダーの有無にかかわらず、液体中のウイルスアセンブリを調製するためのプロトコルが提示されています。液体EM専用の試料ホルダーを使用することで、薄い液体試料は、クライオEM試料に匹敵する構造情報と、試料の動的な洞察を得ることができます。また、ハイスループットルーチン用のオートローダーツールを使用して液体試料を準備する方法も実証されています。他の技術に対する主な利点は、自動試料作製により、データ収集前にサンプルの最適な厚さと電子投与量を迅速に評価できることです。このスクリーニング技術は、液体または氷中のリアルタイム記録に理想的な領域を迅速に特定します12、14、18、19。3D構造決定の目的で、液体EMは、クライオEMで実装されている長年のクライオEMメソッドを補完する可能性があります。従来のTEMまたはクライオEM技術を採用している読者は、液体EMワークフローを使用して、現在の戦略を補完する方法でサンプルの新しい動的観察を提供することを検討できます。

このプロトコルで使用されるウイルスサンプルには、ギフトとして取得され、標準条件下で培養された精製アデノ随伴ウイルスサブタイプ3(AAV)が含まれます12。また、COVID-19患者の血清12に由来し、市販の供給源から入手した非感染性SARS CoV-2サブウイルスアセンブリも使用されました。最後に、精製されたサルロタウイルス(SA11株)二重層粒子(DLP)をウェイクフォレスト大学のSarah M. McDonald Esstman博士の研究室から入手し、標準条件6,17を用いて培養した。ここで説明するソフトウェアパッケージは無料で入手でき、リンクは「材料表」セクションにあります。

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プロトコル

1. 液体EM用試料ホルダーの装填

  1. 窒化ケイ素(SiN)マイクロチップを洗浄するには、各チップを150 mLのアセトン中で2分間インキュベートした後、150 mLのメタノール中で2分間インキュベートします。層流で切りくずを乾燥させます。
  2. プラズマは、アルゴンガスを使用して30 W、15 mA、45秒間の標準条件下で動作するグロー放電装置を使用して、乾燥したチップを洗浄します。
  3. ドライベースマイクロチップを試料ホルダーの先端に装填します。~0.2 μLのサンプル(50 mM HEPES、pH 7.5、150 mM NaCl、10 mM MgCl 2、10 mM CaCl2中のウイルス集合体0.2-1 mg/mL)をベースチップに追加します。1〜2分のインキュベーションステップに続いて、サンプルを含むウェットベースチップ上にトップチップを置きます。
  4. アセンブリをクランプして密閉されたエンクロージャを形成し、3本の真ちゅう製のネジで機械的に固定します。アセンブリを密封したら、ターボポンプ式ドライポンプステーションを使用してチップを10-6Torr までポンプで送ります。これで、ホルダーをTEMに挿入する準備が整いました。
    注意: セレクトホルダーには冷却機能がなく、クライオEMには使用されません。

2. マイクロチップサンドイッチアッセンブリーの製造

注:出荷されたゲルパックから直接、さまざまなSiNまたは二酸化ケイ素(SiO)マイクロチップを使用できます。カーボンコーティングされた金グリッドは、供給されたとおりに直接使用することもできます。

  1. プラズマは、アルゴンガスを使用して30 W、15 mAの標準条件下で45秒間動作するグロー放電装置を使用して、マイクロチップとカーボングリッドを洗浄します。
  2. 50 mM HEPES、pH 7.5に含まれるサンプルを~2 μL添加します。150 mM NaCl;10 mM MgCl2;10mMCaCl2をゲルパック上に載せてグロー放電したマイクロチップとする。ろ紙またはピペットを使用して余分な溶液(~50%)を除去します。1〜2分のインキュベーションステップに続いて、グロー放電されたカーボングリッドをサンプルを含むウェットマイクロチップに追加します。
  3. シングルチルト試験片ホルダーまたはオートローダーグリッドクリップを使用してアセンブリを室温でクランプし、密閉されたエンクロージャを形成します。オートローダークランプの場合は、サンドイッチアセンブリを下部のCクリップに配置し、上部のクリップをアセンブリの上に置き、標準のクランプツールを使用してアセンブリを一緒にシールします。
    注意: ここで実行されるクランプ手順は、クライオEMグリッドクランプと同じ手順を使用しますが、室温で行います。クランプされたサンプルは、エンクロージャ内の液体を維持したまま、イメージングの前に2か月以上保存できます。室温の試験片ホルダーやオートローダーではリークチェックは行われません。
  4. これで、試料をTEMに挿入する準備が整いました。低温条件下または室温でオートローダーに入れられたサンプルを調べます。

3. 透過型電子顕微鏡による試料のイメージング

  1. 液体電子顕微鏡イメージング
    1. フィールドエミッションガン(FEG)を装備し、200kVで動作するTEMに試料ホルダーを装填します。
    2. ガンの電源を入れ、ワブラー機能を使用して顕微鏡ステージのユーセントリック高さを調整し、カラム内のサンプルを-15°から+15°に傾けます。この手順では、サンプルの厚さに合わせてステージをZ方向に調整します。また、画像記録中に正確な倍率を確保するのに役立ちます。
    3. 画素間隔6μmのダイレクトディテクタを内蔵した in situ パッケージ(動画1、 動画2)で長額動画として記録します。個々の画像はまた、自動画像化ルーチンを実装するシリアルデータ収集ソフトウェアパッケージ20を使用して記録され得る。低線量条件下で、28,000倍から92,000倍の範囲の倍率と毎秒40フレームの画像を取得します。
    4. 露光時間(0.25〜1秒)を調整して、試験片へのビーム損傷を最小限に抑えます。指定された倍率で-1〜4μmの焦点ずれ範囲を使用してください。濃厚な溶液が検出された場合は、より高い焦点ぼけ値を使用するか、別の関心領域を選択します。
    5. 気泡が形成されるまで、データ収集に使用されない犠牲領域に電子ビームを集中させることにより、イメージングセッション全体を通して溶液がサンプルに存在することを確認します(補足図1)。
  2. クライオ電子顕微鏡イメージング
    1. クリップされたEMグリッドまたはマイクロチップサンドイッチをFEGを装備し、300kVで動作するTEMにロードします。ガンの電源を入れ、上記の液体TEMで説明したのと同様の手順を使用して、顕微鏡ステージのユーセントリック高さを調整します(ステップ3.1.2)。
    2. 顕微鏡システムに統合された単粒子分析システムを使用して個々の画像を記録し、自動イメージングルーチンを実装します。画素間隔14μmの単粒子分析直接電子検出器を用いて、倍率59,000倍、毎秒40フレームで低線量条件下で画像を記録します。
    3. 指定された倍率で1〜4μmの焦点ずれ範囲を使用してください。ガラス質の氷の厚い層に遭遇した場合は、より高い焦点ぼけ値を使用するか、データ収集のために別の領域を選択します。

4. データ解析と3次元構造比較

  1. 液体およびガラス質氷中のアデノ随伴ウイルス(AAV)の分析
    1. RELION−3.08プログラム21 または他の画像処理ソフトウェア22を使用して、液体および氷中のAAV粒子に対するムービーを処理する。モーションコア2 v1.2.3を使用してモーション補正を実行します。
    2. 修正したら、プログラムソフトウェアパッケージの自動ピッキングツールを使用してパーティクルを抽出します。一般的な箱のサイズは、液体試料の場合は330ピクセル、氷試料の場合は350ピクセルです。
    3. プログラムの3D初期モデルルーチンおよび/またはデータ処理ソフトウェアパッケージの ab-initio モデルオプションを使用して、C1対称を使用して初期再構成を計算します。プログラムでは、正則化パラメータを T = 4、液体標本の場合は 1.01 Å、氷標本の場合は 1.13 Å のピクセル サイズを使用します。
    4. 絞り込み手順全体で 300 Å のマスク値を使用します。I1対称性を使用してデータ処理ソフトウェアで改良プロトコルを実行し、複数のEMマップを取得します。期待される構造分解能は、4 Å以上の範囲であり得る。液体の場合は16,800、氷の場合は15,240で正二十面体対称性を実装する粒子等価を使用します12,14。
      注:分解能の推定値は、ゴールドスタンダードのフーリエシェル相関(FSC)基準に基づいています。
    5. ~250 ÅでEMマップをマスクし、分子構造解析ソフトウェアパッケージ23,24を使用して結果を調べます。図 3 では、スライスは ~5 nm の増分で示されています。
    6. 比較のためにEMマップからカプシドタンパク質(VP1)サブユニットを抽出します。粒子径の測定値に基づいてEM構造の動的変化を定量化し(補足図2)、ソフトウェアのモーフマップ機能を使用して視覚化します。
  2. 液体中のSARS-CoV-2サブウイルス集合体の分析
    1. RELION-3.08プログラムを使用してムービーを処理します。MotionCor2 v1.2.3を使用して、画像のドリフトとビーム誘起モーションを修正します。顕微鏡のコントラスト伝達関数(CTF)を修正します。
    2. プログラムのオートピッキングツールを使用して、ボックスサイズが800ピクセルのウイルスアセンブリを選択します。計算効率を上げるために、抽出されたパーティクルは256ピクセルに再スケーリングできます。プログラムでC1対称性を使用して、正則化パラメータがT = 2、ピクセルサイズが1.66 Åの初期モデルを取得します。
    3. プログラムで3Dリファインを実行してEMマップを取得し、標準のFSC基準に従って~8.25 Åに例を示します(図4)。 図4に示すように、分子構造解析ソフトウェアを使用して、スライスを25 nmでインクリメントしたEMマップを視覚化します。
  3. ガラス質氷中のロタウイルス二重層粒子(DLP)の分析
    1. 他の画像処理ソフトウェアを使用してロタウイルスDLPの動画を処理します。MotionCor2 v1.2.3を使用して、画像のドリフトを補正します。パッチCTF推定を使用して、画像に対するレンズ効果を補正します。
    2. ソフトウェアのオートピッキングツールを使用して、ボックスサイズが950ピクセルのパーティクルを抽出します。コンピューティングの目的で必要に応じてボックスサイズをダウンサンプリングします。
    3. ab-initioオプションとC1対称性を使用して初期モデルを計算します。1.47 Å のピクセル サイズと 800 Å のマスク値を含む細分化パラメーターを使用します。
    4. I1対称性を課しながら、追加の改良ルーチンを実行します。結果の例には、ゴールドスタンダードのFSC基準に従った10.15 Å EMマップが含まれています。使用された粒子の総数は2050で、これは二十面体対称演算子による123,000プロトマーユニットに相当します(図5)。
    5. ~750 Åで最終マップをマスクし、分子構造解析ソフトウェアパッケージで結果を視覚化します。EMマップのスライスの例を~10nm刻みで 図5 に示します。

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結果

すべての液体EMイメージング実験には200 kVで動作する液体TEMを使用し、すべてのクライオEMデータ収集には300 kVで動作するクライオTEMを使用しました。複数のウイルスの代表的な画像と構造を提示して、さまざまな被験者にわたる方法の有用性を実証します。これらには、組換えアデノ随伴ウイルスサブタイプ3(AAV)、患者血清に由来するSARS-CoV-2サブウイルスアセンブリ、およびサルロタウイルス二重層粒子(DLP)、SA11株が含まれます。まず、液体緩衝溶液(50 mM HEPES、pH 7.5;150 mM NaCl;10 mM MgCl2;10 mM CaCl2)およびガラス質氷中で画像化された同じAAVサンプル(1 mg/mL)についての比較が実証されます(図3A-C;補足図2)。液体EMサンプルは、SiNベースのマイクロチップと特殊なサンプルホルダーを使用して準備されました。クライオEMサンプルは、標準的なホールカーボン...

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ディスカッション

クライオEM分野から適応された新しい自動化ツールと技術を使用することにより、現在の液体EMワークフローを合理化する新しい機会が提示されます。新しいマイクロチップサンドイッチ技術を含むアプリケーションは、液体またはガラス質の氷中での高解像度のイメージング分析を可能にするため、他の方法に関して重要です。プロトコルの最も重要なステップの1つは、ナノスケールレベルで絶妙な詳細を視覚化するための理想的な液体厚さの標本を作成することです。理想的な関心領域は、自動データ収集のためのハイスループットルーチンを実装する前にサンプル全体をスクリーニングすることにより、低倍率で特定されます。液体または氷の標本で特定された領域にビーム損傷アーティファクトが含まれている場合、または視覚的に鮮明な個々の粒子を識別できないほど厚すぎると思われる場合は、データ収集から除外する必要があります。高分解能データ取得の制限には、液体サンプルのビーム誘起運動とブラウン運動が含まれます。クライオEM法は、生物学的サンプルの動きを最小限に抑えることを目的としています。ただし、モーション補正方法は、これらの解像度制限要因を軽減するのに計算的に堅牢です。液体サンプルが長距離ドリフトおよ...

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開示事項

著者は、競合する経済的利益はないと宣言しています。著者のMadeline J. Dressel-DukesはProtochips, Inc.の従業員であり、Michael SpilmanはDirectElectronの従業員です。

謝辞

著者らは、Luk H. Vandenberghe博士(ハーバード大学医学部眼科)が精製AAV-3を提供したことを称賛しています。この研究は、国立衛生研究所および国立がん研究所(R01CA193578、R01CA227261、R01CA219700からD.F.K.)の支援を受けた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アセトンフィッシャーサイエンティフィック A11-11リットル
ローダークリッピングツールサーモフィッシャーサイエンティフィックN/Aまた SubAngstromサプライヤー
オートローダーグリッドクリップサーモフィッシャーサイエンティフィックN/A 上部および下部クリップ
カーボンコーティングされた金 EMグリッド電子顕微鏡科学CF400-AU-50400メッシュ、5nm
COVID-19患者血清RayBiotechCoV-Pos-S-500500マイクロリットルのPCR+血清
メタノールッシャーサイエンティフィ A412-11リットル
マイクロウェルインテグラードマイクロチップProtochips, Inc.EPB-42A1-1010mmウィンドウアレイ
TEMWindows microchips株式会社シンポアSN100-A10Q33B9つの大きな窓、10nnの厚さ
のTEMウィンドウズマイクロチップSimpore, Inc. SN100-A05Q33A5nm厚 小窓9
トップマイクロチップProtochips, Inc.EPT-50W500 mm x 100 mm 窓
Whatman #1 濾紙Whatman1001 090100 個 90 mm
<強力> 備品 
DirectView 直接電子検出器直流電子6ミクロン ピクセル間隔
Falcon 3 EC 直達電子検出器サーモフィッシャーサイエンティフィック14ミクロン ピクセル間隔
Gatan 655 ドライポンプステーションGatan, Inc. 10-6 range
Mark IV VitrobotThermoFisher Scientificの最先端の試料作製ユニットへのポンプホルダー先端 
PELCO easiGlow、グロー放電ユニットTed Pella、Inc. ネガティブ極性モード
ポセイドンセレクト 試料ホルダープロトチップス社 FEI対応;試料ホルダー
Talos F200C TEMThermoFisher Scientific200 kV;液体TEM
Titan Krios G3ThermoFisher Scientific300 kV;クライオTEM
無料公開ソフトウェアWebsite linkコメント (オプション)
cryoSPARChttps://cryosparc.com/CTF
探索プログラム
RELIONhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEMhttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimerahttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/分子構造解析ソフトウェアパッケージ
オート厚 フィック個 MotionCorr2 https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 その他の画像処理ソフトCTFFIND4 https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software

参考文献

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