ここでは、単一細胞における絶対ミトコンドリア(mt)DNAコピー数とmtDNA欠失ヘテロプラスミーレベルを測定するためのプロトコルを紹介します。
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この記事について
サマリー
要約
哺乳類のミトコンドリア(mt)DNAは、電子伝達鎖の13サブユニットをコードする、小さな環状の二本鎖ミトコンドリア内DNA分子です。二倍体核ゲノムとは異なり、ほとんどの細胞にはmtDNAのコピーが多く含まれており、細胞の種類に応じて100コピー未満から200,000コピーを超える範囲です。MtDNAコピー数は、多くの加齢に伴う変性状態や疾患のバイオマーカーとしてますます使用されているため、mtDNAコピー数の正確な測定は、研究と診断の両方の設定において重要なツールになりつつあります。mtDNAの変異は、一塩基多型(SNP)または欠失として発生することが多く、細胞内のmtDNAのすべてのコピーに存在するか(ホモプラスミーと呼ばれる)、変異したmtDNAコピーとWTmtDNAコピーの混合物として存在する可能性があります(ヘテロプラスミーと呼ばれます)。ヘテロプラズマmtDNA変異は、希少疾患またはパーキンソン病などの一般的な遅発性疾患の増加のいずれかにおいて、臨床ミトコンドリア病理の主な原因です。細胞内に存在するヘテロプラスミーのレベルを決定することは、まれなミトコンドリア病の診断およびミトコンドリアが役割を果たす可能性のある一般的な遅発性疾患を理解することを目的とした研究において重要なステップです。MtDNAコピー数とヘテロプラスミーは、従来、定量的(q)PCRベースのアッセイまたはディープシーケンシングによって測定されてきました。しかし、ddPCR技術の最近の導入は、両方のパラメータを測定するための代替方法を提供しました。絶対mtDNAコピー数を測定する能力や、低いコピー数でも単一細胞から正確な測定を行うのに十分な感度など、既存の方法に比べていくつかの利点があります。ここでは、ddPCRを使用した単一細胞のmtDNAコピー数の測定を説明する詳細なプロトコル(以下、液滴生成PCRと呼びます)と、mtDNA欠失のある細胞のヘテロプラスミーを同時に測定するオプションを紹介します。mtDNA SNPを有する細胞のヘテロプラスミーを測定するためにこの方法を拡張する可能性についても議論されています。
概要
哺乳類のミトコンドリア(mt)DNAは、ミトコンドリアマトリックスに存在する小さな(約16.5 Kb)環状DNAゲノムであり、2つのrRNA、22のtRNA、および13のタンパク質コード遺伝子で構成される37の遺伝子をコードしています1。細胞ごとに各遺伝子のコピーが1つ(一倍体)または2つ(二倍体)含まれる核ゲノムとは異なり、mtDNAは各細胞のミトコンドリアに複数のコピーとして存在し、数十コピー(成熟精母細胞など)から数十万コピー(卵母細胞など)の範囲で存在します2,3。このマルチコピーの性質の結果、一塩基多型(SNP)、欠失、または重複として存在する可能性のあるmtDNAゲノムの変異が、任意の細胞にさまざまなレベルで存在し、細胞の総mtDNA集団の0%から100%を占める可能性があります。同じ細胞内に野生型および変異型mtDNAゲノムが存在することはヘテロプラスミーと呼ばれ、病原性ヘテロプラズマmtDNA変異はミトコンドリア病の主な原因であり、いくつかの一般的な神経学的症候群が根底にあるヘテロプラスミックmtDNA変異に関連しています4。
ヘテロプラズマmtDNA変異が臨床疾患を引き起こす可能性に寄与する2つの重要なパラメータは、ヘテロプラスミーレベルとmtDNAコピー数です。多くのヘテロプラスミック変異は閾値効果を示し、生化学的および臨床的表現型は特定のヘテロプラスミーレベル(通常は約80%5)を超えてのみ明らかになり、その後、ヘテロプラスミーがさらに増加するにつれて悪化します4。ただし、細胞内に存在するmtDNAのコピー数は、特定のヘテロプラスミーレベルで存在する野生型(つまり「正常」)mtDNAゲノムの数に影響を与えるため、考慮することも重要です。ミトコンドリア病患者を対象とした研究では、ヘテロプラスミーとコピー数5,6の間のこの相互作用の重要性が強調されており、Filogranaらは最近、ミトコンドリア病のマウスモデルで異形質変化にもかかわらず症状を緩和するmtDNAコピー数の増加を報告しました7。
近年、mtDNAヘテロプラスミーによって引き起こされる疾患の病因と伝染の理解を深めるために多くのことが行われていますが、この研究のほとんどは細胞ではなく組織のレベルで行われており、バルク組織生検と血液サンプルから得られた平均組織ヘテロプラスミーレベルとコピー数測定値を比較しています。レーザーキャプチャマイクロダイセクションなどのいくつかの確立された技術は、細胞レベルでのそのような測定を可能にします8,9;しかし、近年のハイスループットシングルセル解析法、いわゆる「シングルセルオミクス」10の爆発的な増加により、これらの重要なmtDNAパラメータをシングルセルレベルで正確に測定できる方法が求められています。
液滴生成PCR法は、マイクロ流体技術の最近の進歩を利用して、サンプルDNA中の特異的標的アンプリコンのPCR増幅を介して未知のDNA濃度を定量する既存の方法を改良する11。サンプルDNAが単一の反応で増幅され、PCR産物の相対蓄積速度が読み出しとして機能するqPCRとは異なり、この方法は最初のサンプルを数千の個々の液滴に分割し、サンプルDNA分子を空間的に分離した反応に区画化します12。その後のPCR反応は個々の液滴で進行し、PCR産物は標的DNAを含む液滴にのみ蓄積します。この反応の結果は、標的DNAおよび増幅PCR産物のコピーを含むか、または標的DNAを含まない液滴のプールの形でデジタル出力される。蛍光DNAプローブまたは二本鎖(ds)DNA結合色素を使用して、増幅産物を含む液滴をカウントし、「陽性」液滴と「陰性」液滴の比率を使用して、初期サンプルに存在したDNAコピーの絶対数を計算できます。qPCR反応から得られる相対的な測定値とは対照的に、この絶対測定は、この方法論を単一細胞のmtDNAコピー数とヘテロプラスミーの正確な測定に使用できる重要な要素であり11、最近のいくつかの研究はすでにこの目的のために液滴生成PCR技術を利用しています13,14.この記事では、ヒトとマウスの両方の組織からの単一細胞におけるmtDNAコピー数と欠失ヘテロプラスミーを測定する方法を紹介します。
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プロトコル
すべての実験はARRIVEガイドラインに従い、ケンブリッジ大学動物福祉倫理審査機関(AWERB)によって承認されました。
注:液滴生成前のすべてのサンプル調製ステップは、清潔なプレPCR作業エリア、理想的には可能な限りUV滅菌キャビネットで実行する必要があります。ここで説明するプロトコルは、特定の液滴生成PCR装置( 材料の表を参照)を使用しており、一般的な方法は他のシステムにも適用できるはずですが、プライマー/プローブの濃度、PCRサイクル条件などについては、ここに記載されているものとは異なる場合があります。ヒトHeLa細胞(商業的に入手可能)、ヒトHEK 293T細胞(商業的に入手可能)、初代ヒト皮膚線維芽細胞(ニューカッスルバイオバンクから入手)、ヒトサイブリッド(WT&ΔH2.1欠失15、マイアミ大学のC.モラエスから入手)、マウス胚性線維芽細胞(不死化、C57Bl/6マウスから、J.スチュワートから入手、 ニューカッスル大学)、マウス原始生殖細胞(C57Bl/6マウス胚から得られた)、およびマウスMII卵母細胞(成体雌C57Bl/6マウスから得られた)。すべての培養細胞は、10%ウシ胎児血清を添加した高グルコース(4.5g/L)DMEM中で、5%CO2を含む37°Cで維持した。この研究で使用された初代マウス細胞は、内務省プロジェクトライセンスP6C97520Aの下で1986年の動物(科学的手順)法に従って飼育された動物から単離されました。
1. 目的のDNA配列を標的とするプライマー&プローブセットの設計と合成
注:液滴生成PCRは、アンプリコン特異的プローブの代わりにdsDNA結合色素を使用して実行することもできます。
- プライマーとプローブの配列は、システムメーカーが提供するガイドラインに従って設計してください。ヒト16、17 およびマウス18 細胞の両方における単一細胞mtDNAコピー数/欠失ヘテロプラスミーの測定に適した検証済みのプライマーおよびプローブ配列を 表1に示します。代替ターゲット配列を選択する際には、以下の点を考慮してください。
- 1回のPCRアッセイで2つのプライマー/プローブセットをマルチプレックスしますが、2つのアッセイで1つのFAM標識プローブと1つのHEX標識プローブを使用していることを確認して、ターゲットアンプリコンを液滴リーダーで区別できるようにします。このプロトコルは、二重プローブアッセイを提示します。慎重な実験計画により、多重化を最大4つのターゲットまで増やすことができ、代替プラットフォームはより高次元の多重化を実現できます。
- 別々のmtDNA配列を標的とするプライマー/プローブセットをマルチプレックス化する場合は、2つのプライマーセットによって生成されたアンプリコンが重複しないようにしてください。
- mtDNA欠失を有するサンプル中のヘテロプラスミーを測定する場合、一方のターゲットアンプリコンが予想される欠失領域内にあり、もう一方が予想される欠失領域外にあることを確認してください。
注:代替アッセイに最適なPCRサイクリング条件は、ステップ5.1で引用したものとは異なる場合があります。アッセイの最適化の詳細については、ディスカッションを参照してください。
2. 単一細胞からのDNAの単離
注:この方法は、最大100セルの小さなバルクサンプルにも使用できます。
- 蛍光活性化セルソーティング(FACS)19 やレーザーキャプチャーマイクロダイセクション20などの適切な方法を使用して、できるだけ小さい容量で単一の細胞を適切な容器(96ウェルプレートなど)に収集します。単一細胞単離の前または最中に細胞生存率色素を使用すると、死細胞を単離する可能性を最小限に抑えることができます。必要に応じて単一細胞を溶解バッファーに直接選別し、分析前に-80°C(最大6ヶ月)で保存します。
- 細胞を少量(<10 μL)の適切な溶解バッファーで溶解します(この研究で使用されるバッファーはステップ2.2.1で説明されています)。
注:この研究で細胞から得られたすべてのデータは、単一細胞ライセートまたは20細胞のプールからのものです(サンプルサイズは図の凡例に規定されています)。液滴生成PCRプロトコルの液滴生成ステップ中の油/液滴エマルジョンの効率的な形成は、サンプル中の界面活性剤の存在によって大きく影響を受ける可能性があります。したがって、実験サンプルを続行し、実用的な最小量の溶解バッファーを使用する前に、すべての細胞溶解バッファーと意図した入力濃度での液滴生成との適合性を検証することをお勧めします。以下の溶解プロトコルは、液滴生成効率への影響を最小限に抑えます。- pH 8.3 50 mM トリス塩酸塩、1% TWEEN-20、および 200 μg/mL プロテイナーゼKを含む溶解バッファーを調製します。
- 各サンプルに2.5 μLの溶解バッファーを加え、プレートを粘着プレートシールで密封した後、サンプルを1,000 x g で4°Cで1分間遠心分離します。
- プレートカバー上の液体の結露を防ぐために、加熱された蓋を105°Cに設定した状態で、サーモサイクラーで37°Cで30分間サンプルをインキュベートします。
- 各サンプルに7.5 μLのヌクレアーゼフリー水を加えて最終サンプル容量10 μLとし、プレートを再シールしてから、サンプルを1,000 x g で4°Cで1分間遠心分離します。
- サーモサイクラーで80°Cで15分間インキュベートし(加熱蓋を105°Cに設定)、プロテイナーゼKを不活性化します。
- サンプルを1,000 x g で4°Cで1分間遠心分離し、氷上に保ちます。
- 以下の手順 3 に進みます。
注:細胞ライセートは、ステップ3に進む前に-20°Cで保存できます。ただし、可能な限り新たに溶出したDNAを使用して、DNA分解を引き起こす凍結融解サイクルのリスクを排除してください。
3. サンプルの調製
注:結果の正確性を確保するために、サンプルのテクニカルレプリケートと非テンプレートコントロール(NTC)が各アッセイプレートに含まれていることを確認してください。液滴生成PCRアッセイのダイナミックレンジは、反応ごとにターゲットアンプリコンの最大120,000コピーです。シングルセルまたはスモールバルクセルサンプルライセートの場合、希釈は必要ではなく、ライセート混合物をmtDNAコピー数の測定のために反応に直接入力できます(たとえば、10 μLのライセートサンプルを分割して3 μLで3 μLを各アッセイに直接入力して3回実行できます)。しかしながら、非常に高いコピーmtDNA数を有する細胞(例えば、卵母細胞)からの希釈されていないライセートを使用すること、またはより多くの細胞(例えば、50〜100)を含むものは、このダイナミックレンジを超える可能性がある。このような場合、その特定の細胞タイプ/細胞数に対するアッセイの飽和を回避する適切な希釈因子を特定するには、最初の段階希釈が必要です(詳細については、 代表的な結果 を参照してください)。
- すべての試薬を氷、渦で解凍し、使用前に短時間スピンダウンします。
- (表2)の説明に従って、氷上でマスターミックス(サンプルDNAを除く)を準備します。
注:ターゲットアンプリコンを1つだけ測定する場合は、サンプルごとに2.55 μLのヌクレアーゼフリー水を追加して、最終容量22 μLを達成します。 分析するサンプルとNTCの数に十分なマスターミックスを準備し、さらに液滴生成PCRプレートに必要な「ブランク」ウェルを考慮するのに十分なマスターミックスを準備します(次のステップを参照)。 - 調製したマスターミックスを短時間ボルテックスして混合し、必要な量(22 μLから入力DNA量を引いたもの)を液滴生成PCR96ウェルプレートの各ウェルに分注します。サンプルを96ウェルプレート上のフルカラムに配置します。不完全なカラムの空のウェルをマスターミックスで満たし、NTCとして使用します。
- 各サンプルウェルにインプットDNAを追加し、NTCウェルにヌクレアーゼフリーの水/溶出バッファーを追加して、各ウェルの総容量を最大22 μLにします。
- プレートを粘着プレートシールで密封し、シェーカーに2,000 rpmで1分間置いた後、1,000 x g で4°Cで1分間遠心分離します。
- プレートを氷の上に置き、手順4に進みます。
注意: 準備したプレートは氷上に保管し、液滴の生成を進める前に短時間(1〜2時間など)光から保護することができます。
4. 液滴の発生
注意: このセクションで参照されている液滴発生器デッキの回路図については、 図1A を参照してください。
- 液滴発生器の電源を入れます。
- 液滴発生オイルのボトルが計器デッキの位置Eにロードされていることを確認します。プロンプトが表示されたら、画面の指示に従ってボトルを交換します。
- タッチスクリーンの [サンプルプレートの構成 ]をクリックします。サンプル/ブランクを含むサンプルプレート上のすべての列を選択します。
注:このステップでのプレート名と実験の詳細の入力はオプションであり、実験の設定を続行するために必須ではありません。 - [ OK ]をクリックしてプレートの構成を確認します。計器デッキのオレンジ色のライトが点灯し、消耗品を装填する必要がある位置を示します。
- 液滴発生器カートリッジを計器デッキのB位置にロードして、すべてのライトが緑色に変わるようにします。
- 空の先端廃棄物トラフを計器デッキのCの位置に配置します。
- フィルターチップボックスから蓋を外し、すべてのライトが緑色に変わるように、機器ステージのポジションDにロードします。
- サンプルプレートから粘着プレートシールをはがし、計器デッキの位置Fにロードして、ライトが緑色に変わるようにします。
- 空の液滴収集96ウェルプレートをクールブロック(-20°Cでプレチルド)に入れ、ライトが緑色に変わるように機器デッキの位置Gにロードします。
- 機器のタッチスクリーンで 液滴生成の開始 をクリックします。
- 機器のタッチスクリーンで [実行の開始 ]をクリックします。機器の蓋は自動的に閉じます。初期化後、液滴の生成が完了するまでの残り時間が機器のタッチスクリーンに表示されます。
- 液滴の生成が完了したら、サンプル収集プレートを目視で確認して、液滴エマルジョン層が各ウェルの油相の上に存在することを確認します(図1B)。
注:液滴エマルジョン層が見えない場合は、実験を続行せず、プロトコルの前のステップで発生した可能性のあるエラーを確認してください。 - 使用済みの消耗品を計器デッキから取り除き、チップ廃棄物トラフを空にします。
- プレートシーラーの電源を入れ、温度を180°C、シール時間を5秒に設定し、機械が動作温度に達するようにします。
- サンプル収集プレートをプレートシーラープレートホルダーに入れ、赤い線を上に向けてプレートの上に新しいホイルシールを置きます。ホイルシールの下側に触れないように注意してください。
注意: プレートホルダーは室温(RT)で保管し、サンプル収集プレートへの熱伝達を防ぐためにホイルシールが適用されている場合にのみプレートシーラードロワーに配置する必要があります。 - プレートシーラーが動作温度に達したら、機器のタッチスクリーンの イジェクト を押します。引き出しが自動的に開きます。
- プレートホルダーをプレートシーラードロワーに入れ、 シールを押します。引き出しは自動的に閉じ、シーリングが完了すると再び開きます。
- コールドブロックのシールプレートを元に戻し、プレートシーラーの電源を切り、すぐに手順5に進みます。
注:この段階では、液滴は不安定であるため、液滴の生成が終了してから1時間以内にPCRステップが開始されていることを確認してください。
5. PCR法
- 密封された液滴収集プレートを96ディープウェルブロックを備えたPCRサイクラーに置き、 表3に記載されている熱サイクルプロトコルを実行します。
注意: 加熱された蓋の温度を105°Cに設定し、サンプル量を40μLに設定します。 変性およびアニーリング/伸長のステップには、オイルが正しい温度に平衡化する時間を確保するために、2°C / sの温度上昇率を含める必要があります。 - 手順 6 に進みます。
注意: サーマルサイクリングプロトコルが完了すると、液滴はより安定し、次のステップに進む前にプレートを4°Cで最大4日間保存できます。
6.液滴読み取り
- ドロップレットリーダーと接続されているコンピューターの電源を入れます。
- 液滴リーダーオイルと液滴リーダーの廃棄物ボトルの液面を確認し、必要に応じてそれぞれこれらを充填/空にします。
- PCR後のサンプルを含むプレートをドロップレットリーダープレートホルダーに入れ、カバーをホルダーの上に置き、黒いロッククリップで所定の位置に固定します。サンプルプレートからホイルの蓋を取り外さないでください。
- ドロップレットリーダーの蓋にある 開閉 ボタンを押して開きます。
- サンプルプレートを含むドロップレットリーダープレートホルダーをリーダーチャンバーに入れ、磁気ベースにしっかりと配置します。
- ドロップレットリーダーの蓋にある開閉ボタンを押して閉じます。
- 分析ソフトウェアインターフェースを開き、[プレート の追加] タブを選択して、次のように新しいサンプルプレートを準備します。
- [ プレートの追加] をクリックし、[ プレートの構成] をクリックします。
- [プレート情報]タブでプレート名を入力し、[スーパーミックス]ドロップダウンメニューから[プローブ用スーパーミックス(dUTPなし)]を選択し、[データファイルに名前を付けて保存]にファイル名を入力します。
- [ウェル の選択 ]タブで、分析するウェルをハイライト表示し、[ 選択したウェルを含める]をクリックします。
注意: 手順6.7.4〜6.7.7はオプションです。 - [井戸 情報 ]タブで、注釈を付ける井戸を選択します。
メモ: [井戸情報]タブのインタフェースの例については、図1Dを参照してください。 - 実験タイプドロップダウンメニューから直接定量(DQ)を選択し、サンプルの説明、サンプルタイプ&ターゲット名ボックスに入力し、必要に応じてウェルノートやプレートノートを追加します。
- [ 適用] をクリックします。フィールドの情報は、選択したウェルに適用されます。
- すべてのサンプルウェルに注釈が付けられるまで、手順6.7.4〜6.7.6を繰り返します。
- プレートの構成が完了したら、[ 実行の開始] をクリックします。
- 実行が完了したら、空のサンプルプレートを廃棄し、必要に応じてドロップレットリーダーの廃棄物ボトルを空にします。
- 手順 7 に進みます。
7. 結果の分析
注:液滴リーダーは、サンプル中の各液滴のFAMおよびHEXチャネルの蛍光強度を測定します。成功したアッセイでは、液滴は各プローブの2つのカテゴリのいずれかに分類されます:陰性(ターゲットが液滴に存在しなかったことを意味する)または陽性(標的が液滴に存在したことを意味する)。サンプルを分析する前に、各ウェルに>10,000個の液滴が含まれており、各チャネルに低蛍光(陰性)と高蛍光(陽性)の2つの明確に分離された液滴集団があることを確認してください(図2A)。
- [ データ分析 ] タブを選択し、[ マイ データ ファイル] メニューから分析するファイルを開きます。
- 単色実験の場合は [1D 振幅] タブ、2 色実験の場合は [2D 振幅 ] タブをクリックします。
- 各チャンネルに蛍光閾値を適用して、陽性液滴と陰性液滴を区別します。分析ソフトウェアは、サンプルごとおよびチャンネルごとに自動しきい値を適用しようとしますが、これが失敗したと思われる場合、または不正確であると思われる場合は、次のようにしきい値を手動で適用します。
- 閾値化が必要なウェルを選択します。
- 振幅プロットの正と負の母集団の間の空きスペースに、しきい値 ラインモード ツールを使用して手動でしきい値を適用します。2D ビューで手動しきい値を設定する場合は、4 つの液滴母集団(ダブルネガティブ、シングルポジティブ FAM、シングルポジティブ HEX、ダブルポジティブ)が明確に分離されるように十字線を配置してください。
注:閾値は、ウェルごとに行うことも、一度に複数のウェルに適用することもできます。
- すべてのサンプルにしきい値が適用されたら、[ データ テーブル ] タブをクリックし、[ インポート/ エクスポート] をクリックして [ 表示データを CSV にエクスポート] を選択して、結果を.csv ファイルとしてエクスポートし、さらに分析します。適切なファイル名を入力し、[ 保存] をクリックします。
- 初期サンプルのmtDNAコピー数を次のように計算します。
コピー数 = mtDNA ターゲット濃度 × 22 × ライセート総インプットの1/分率
注:2つのミトコンドリアプローブを使用する場合は、計算を行う前に2つのターゲットの濃度が平均化されます。複数の細胞を含むサンプルの場合、細胞あたりのコピー数は、サンプル内の細胞数で割ることによって計算されます。初期サンプルの絶対コピー数を計算する際には、液滴発生器に必要な2 μLの超過分に残ったmtDNAコピーを考慮する必要があるため、.csvファイルで計算された「20 μLあたりのコピー数」の値ではなく、「濃度」値(マイクロリットルあたりのコピー数)に初期サンプル量22 μLを掛けた値を使用することが重要です。 - ヘテロプラスミックmtDNA欠失を有する細胞については、欠失領域外のmtDNA標的(すなわち、欠失およびWT mtDNA分子の両方に存在する標的)からの結果を用いてコピー数を計算する。欠失ヘテロプラスミーは、以下のように、欠失領域内の標的および欠失領域外の標的の濃度を用いて計算される。
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結果
液滴の生成後、各ウェルの油相の上に透明な液滴の透明な層が浮かんでいるのが見えます(図1B)。液滴形成は、単一細胞で実験を行う際の投入ライセート中の界面活性剤の存在によって悪影響を受ける可能性があります。2.1.2.に記載されている溶解プロトコルを使用すると、最終サンプルに少量のTWEEN-20が残っているにもかかわらず、推奨レベルの10,000を超える液滴収率が日常的に達成されます(図1C)。しかし、バッファーRLT Plusなどの他の溶解バッファーでは、形成される液滴の数が劇的に減少し(図1C)、コピー数測定の精度に悪影響を与える可能性があります。
PCRと液滴の読み取りに続いて、各サンプルウェルに使用される各チャネルで陽性と陰性の液滴の明確に分離された集団が見られ(図2A)、NTCウェルには陰性の液滴のみが含まれています。結果の分析時に発生す...
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ディスカッション
ここで説明するプロトコルは、上記以外にも幅広い細胞タイプおよび種に適用できますが、以前に検証されたプライマー/プローブの組み合わせから離れる際にメソッドの精度と再現性を維持するには、新しいアッセイデザインの慎重な最適化が重要です。単一細胞を扱う場合、得られた結果が個々の細胞の結果を真に反映していることを確認するために、サンプル収集が可能な限り正確に実行されるようにすることが重要です(たとえば、FACSで細胞を選別する際に厳格な単一細胞パラメータを使用するなど)、また、汚染が発生するリスクを減らすために、すべての準備作業がクリーンなPCR前エリアで実行されるようにします。効率的な細胞溶解は、mtDNAコピーを別々の液滴にうまく区分できるようにするためにも重要です。ただし、これは、高濃度の洗剤を使用する場合に液滴の形成を妨げるリスクとバランスをとる必要があります。
アッセイの設計と溶解のステップはプロトコルで最も重要であるため、これらはトラブルシューティングが必要になる可能性が最も高いステップでもあります。陽性および陰性の液滴の十分に分離された集団を最初に生成しないプライマー/プローブ...
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開示事項
開示する利益相反はありません。
謝辞
液滴生成PCRデータの統計解析に関するアドバイスをくださったL Bozhilova博士に感謝します。図 3C および 図4Bのデータを生成するために使用される卵母細胞を提供してくれたH.Zhang博士に感謝します。この研究は、ケンブリッジ大学の医学研究評議会ミトコンドリア生物学ユニット(MC_UU_00015/9)のSPBによって実施され、PFCが保有するウェルカムトラストプリンシパルリサーチフェローシップ(212219 / Z / 18 / Z)によって資金提供されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 50% Tween-20 solution | Novex | 3005 | |
| 自動液滴発生オイル | バイオ・ラッド | 1864110 | オイル/液滴エマルジョンの生成に使用される市販のオイル製剤 (プロトコル ステップ 4.1 で使用) |
| ディープウェル ブロック付き C1000 PCR マシン | バイオ・ラッド | 1851197 | ディープウェル加熱ブロックを装備した PCR サーモサイクラー、細胞溶解 (プロトコル ステップ 2.1.2) および PCR サイクリング (プロトコル ステップ 5) |
| 収集プレート冷却ブロック | バイオ・ラッド | 12002819 | 液滴生成中にサンプルを冷やしておく冷却ブロック(プロトコルステップ4.3で使用) |
| ddPCR 96ウェルプレート | Bio Rad | 12001925 | 96 ウェルプレートピペットチップは、QX200 AutoDG 液滴発生器で使用するよう設計されており、サンプル調製 (プロトコルステップ 3.4) および液滴収集 (プロトコルステップ 4.3) |
| ddPCR 液滴リーダーオイル | Bio Rad | 1863004 | 液滴リーダーで使用される市販の油製剤 (プロトコル ステップ 6.1 で使用) |
| プローブ用 ddPCR Supermix (dUTP なし) | Bio Rad | 1863023 | プローブを使用した ddPCR 実験で使用するための市販の Supermix (プロトコル ステップ 3.3 で使用) |
| DG32 自動液滴発生器カートリッジ | バイオ・ラッド バイオ・ラッド | 1864108 | QX200 AutoDG 液滴発生器でオイル/液滴エマルジョンを生成するために使用されるマイクロ流体カートリッジ (プロトコル ステップ 4.3 で使用) |
| シ胎児血清 | Gibco | 10270-106 | 適格なウシ胎児血清 |
| ホイル プレート カバー | バイオ・ラッド | 1814040 | 液滴生成後に液滴収集プレートを密封するために使用されるホイルプレートカバー (プロトコルステップ4.6で使用) |
| HEK 293T細胞 | 宝 | 632180 | 形質転換ヒト胚性腎臓細胞株HEK 293の商業サブクローン、SV40 Large-T抗原 |
| を発現 HeLa細胞 | ECACC | 93021013 | ヒト子宮頸部上皮癌細胞 |
| 高グルコースDMEM | Gibco | 13345364 | 4.5g / L D-グルコース、L-グルタミンおよびピルビン酸ナトリウム |
| ヒトサイブリッド マイアミ | |||
| マウス胚性線維芽細胞 | ニューカッスル大学 | C57Bl/6マウス | |
| ヌクレアーゼフリー水 | アンビオン | AM9937 | |
| PCRプレートシール | ピアス | SP-0027 | 透明な粘着プレートシール、液滴発生前の使用のみ(ホイルシールはステップ4.6で使用する必要があります) |
| ピペットチップ廃棄物ビン | バイオラッド | 1864125 | QX200 AutoDG液滴発生器(プロトコルステップ4.3で使用)で廃棄されたチップを収集するために使用される使い捨て収集ビン |
| AutoDGシステム用ピペットチップ | バイオ・ラッド | 1864120 | QX200 AutoDG液滴発生器(プロトコルステップ4.3で使用)で使用するために設計されたろ過されたピペットチップ |
| 一次ヒト皮膚線維芽細胞 | ニューカッスルバイオバンク | ||
| プライマー/プローブ | IDT | N/A | 正確なプライマー/プローブ配列はアッセイに依存します。この研究で使用されるプライマーとプローブは、表1に示されています |
| プロテイナーゼK 20 mg / mL溶液 | Ambion | AM2546 | |
| PX1 PCRプレートシーラー | Bio Rad | 1814000 | 液滴生成後にddPCRサンプルプレートにホイルシールを適用します(プロトコルステップ4.6で使用) |
| QXマネージャーソフトウェア | Bio Rad | 12012172 | 液滴リーダーのセットアップおよび分析ソフトウェア(プロトコルステップ6および7で使用) |
| QX200 AutoDG液滴発生器 | Bio Rad | 1864101 | 自動マイクロ流体液滴発生器(プロトコルステップ4で使用) |
| QX200 液滴リーダー | Bio Rad | 1864003 | 液滴リーダー(プロトコルステップ6で使用) |
| Trizmaプリセットクリスタル pH 8.3 | Σ | T8943-100G |
参考文献
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
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