求心性シナプス構造および有毛細胞を免疫標識し、加齢組織における自己蛍光を消光し、蝸牛の長さを解剖および推定し、共焦点イメージングで得られた画像スタック中のシナプスを定量することによって、若年成人および加齢スナネズミ蝸牛を処理するためのプロトコールが提示される。
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この記事について
サマリー
要約
内有毛細胞と求心性聴覚神経線維をつなぐリボンシナプスの喪失は、加齢性難聴の原因の一つと考えられています。リボンシナプスの喪失を検出する最も一般的な方法は、個々の蝸牛のいくつかの鼻トピック位置からの定量的サンプリングを可能にするため、免疫標識である。しかし、関心のある構造は骨の蝸牛の奥深くに埋もれています。スナネズミは加齢性難聴の動物モデルとして使用されています。ここでは、固定、スナネズミ蝸牛全体マウントの免疫標識、共焦点画像化、およびリボンシナプス数および体積の定量化のための日常的なプロトコールが記載されている。さらに、貴重な高齢の個人から良好な材料を得ることに関連する特定の課題が強調される。
スナネズミは安楽死させられ、心臓血管に灌流されるか、鼓膜水疱が頭蓋骨から慎重に解剖されます。蝸牛は頂点と基部で開き、固定液に直接移されます。最初の方法に関係なく、蝸牛は後固定され、続いて脱灰される。次いで、組織は、シナプス前およびシナプス後構造および有毛細胞に対する一次抗体で標識される。次に、蝸牛を、それぞれの一次抗体に対して特異的な二次蛍光タグ付き抗体と共にインキュベートする。その後、老化したスナネズミの蝸牛を自己蛍光消光剤で処理して、高齢動物の組織の典型的に実質的なバックグラウンド蛍光を減少させる。
最後に、蝸牛を6〜11個のセグメントに解剖する。蝸牛全体の長さは、特定の蝸牛の位置が個人間で確実に決定されるように再構築される。連続して取得される共焦点画像スタックは、選択された位置の有毛細胞およびシナプスを視覚化するのに役立つ。共焦点スタックは畳み取り解除され、シナプスはImageJを使用して手動でカウントされるか、またはシナプス構造のより広範な定量化がMatlabでカスタム記述された画像解析手順で実行されます。
概要
加齢性難聴は、65歳以上の世界人口の3分の1以上が罹患する世界で最も普及している疾患の1つです1。根本的な原因はまだ議論中であり、積極的に調査中ですが、内部有毛細胞(IHC)と求心性聴覚神経線維2をつなぐ特殊なシナプスの喪失が含まれる可能性があります。これらのリボンシナプスは、神経伝達物質グルタミン酸で満たされた小胞がそれにつながれたシナプス前構造、ならびにシナプス後α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸(AMPA)グルタミン酸受容体3,4,5を含む。スナネズミでは、〜20個の求心性聴覚神経線維が1つのIHC6、7、8に接触する。モディオラスに面したIHC上の線維は大きなシナプスリボンに対向し、IHCの柱側で接続する線維は小さなシナプスリボンに対向している(すなわち、ネコ9、スナネズミ7、モルモット10、およびマウス<....
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プロトコル
すべてのプロトコルと手順は、ドイツのニーダーザクセン州の関連当局によって承認され、許可番号AZ 33.19-42502-04-15/1828および33.19-42502-04-15/1990で承認されました。このプロトコルは、両性のモンゴルスナネズミ(M. unguiculatus)のためのものです。ヤングアダルトは3〜12ヶ月齢を指し、スナネズミは36ヶ月以上で老化していると考えられています。特に明記されていない場合、緩衝液および溶液を調製し、冷蔵庫に最大数ヶ月間(4〜8°C)保存することができる。使用前に、バッファーと溶液が沈殿していないことを確認してください。
1. 固定と臓器収集
注:蝸牛のみが必要な場合は、浸漬による固定のやや簡単な手順を実行することをお勧めします。しかし、よく保存された脳も必要な場合は、経心膜灌流が唯一の選択肢です。いずれの場合も固定液は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)である。これは作りたてにする必要がありますが、使用時まで冷凍保存することができます。経心膜灌流には〜300mLのアリコートを使用し、浸漬による固定には蝸牛あたり約50〜100mLのアリコートを使用する。
警告: PFA は有害物質です。一般的なラボの安全手順に従って処理します。
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結果
蝸牛は、動物全体の固定液による心血管灌流後に採取するか、または動物を安楽死させて浸漬固定した後に急速に解剖した。後者の方法では、IHCは解剖中に所定の位置にとどまり、一方、灌流が失敗し、したがって組織が十分に固定されていない場合、感覚上皮はしばしば破壊された。著者らは、経心経脈灌流後の蝸牛の固定が不十分である一方で、脳の固定がまだ十分であった症例に遭遇したことに留意されたい。劣った灌流からの組織は、蝸牛の頂点と基部に穴を開け、4%PFAに2日間浸漬することによって蝸牛を後固定することによって、依然として保存することができた。
蝸牛全体の長さ決定は、明確な特性周波数に相当する特定の蝸牛位置におけるIHCおよびそれらのシナプスを評価するために、Müller25に従って実施された(表1)。このために、所望の蝸牛位置を、蝸牛基底からの脳底膜長の百分率として計算した。若年成人スナネズミ由来の13蝸牛の蝸牛長の中央値は11.3mm(四分位範囲:11.02〜11.52mm)であった。老化したスナネズミ由来の24蝸牛.......
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ディスカッション
このプロトコールに概説されている方法を用いると、若年成人および高齢のスナネズミ由来の蝸牛におけるIHCおよびシナプス構造を免疫標識し、シナプス前およびシナプス後要素の共局在化によって推定された機能的シナプスを同定し、それらを個々のIHCに割り当て、それらの数、体積、および位置を定量することができる。このアプローチで用いた抗体はまた、外側有毛細胞(OHC;myoVIIa)およびそれらのシナプス前リボンを標識した。さらに、IHCsとOHCの両方の免疫標識のための実行可能な代替手段は、オトフェリンに対する抗体であり、OHCはIHCよりもはるかに薄く見える。
灌流は、2つの異なるセットアップを使用して行うことができる。1) 市販のドリップラインに給餌する単一のボトルを、動物の約1.5m上のプーリーホイールに吊り下げる重力給餌ドリップラインシステム。流体は、上部で開いているボトルを下げた後に連続して導入される。2)デジタル可変速ペリスタルティックポンプを用いたシステムであって、一方の端に細くて長いチューブを開いて流体を取り込み、もう一方の端に簡単に取り付けることができる針を備えたシステム。ど.......
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開示事項
著者は宣言する利益相反を持っていません。
謝辞
著者らは、Lichun Zhangがイメージング施設の使用のために、この方法とOldenburgのCarl von Ossietzky University of Oldenburgの蛍光顕微鏡サービスユニットの確立を支援したことを認めている。この研究は、ドイツの卓越性戦略-EXC 2177/1の下でドイツ研究財団(DFG、ドイツ研究財団)によって資金提供されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| 抗ミオシンVIIa (IgGポリクローナルウサギ) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| ブレードホルダー &ブレーカー - フラットジョーズ | ファインサイエンスツール | 10052-11 | |
| ボン動脈ハサミ - ボールチップ | ファインサイエンスツール | 14086-09 | |
| カバースリップの厚さ 1.5H、24 x 60 mm | カールロス | LH26.1 | |
| 使い捨て外科用ブレード | ヘンリー・シャイン | 0473 | |
| ロバ アンチウサギ (IgG)-AF647 | ライフテクノロジーズ-モレキュラープローブ | A-31573 | |
| デュモン#5 - ファイン鉗子 | ファインサイエンスツール | 11254-20 | |
| モン #5SF 鉗子 | ファインサイエンスツール | 11252-00 | |
| エタノール、絶対99.8% | フィッシャーサイエンティフィ | ック12468750 | |
| エチレンジアミン四酢酸 | カールロス | 8040.2 | |
| エクセル | マイクロソフトコーポレーション | ||
| フェザーダブルエッジブレード | PLANO | 112-9 | |
| G19 カニューレ | Henry Schein | 9003633 | |
| ヤギ アンチマウス (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | フィジー | ||
| Immersol、液浸油 518F | カールツァイス | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic、150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | 蠕動ポンプ | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | 実体顕微鏡用 |
| ライカ アプリケーション スイート X | ライカ マイクロシステム CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| メイヨーハサミタングステンカーバイドToghCut | ファインサイエンスツール | 14512-17 | |
| -100オービタル-魔神 | 科学産業 | SI-M100 | 寒冷環境での使用 |
| のためにナルコレン(ペントバルビタール) | ベーリンガーインゲルハイムVetmedicaGmbH | ||
| コンエクリプスNi-Ei | ニコン | ||
| NISエレメント | ニコンヨーロッパB.V.さん | ||
| パラホルムアルデヒド | カールロス | 0335.3 | |
| 通気口のないシャー | アバントVWR390-1375 | ||
| リン酸緩衝生理食塩水: | |||
| リン酸二ナトリウム | AppliChemA1046 | ||
| リン酸一カリウム | カールロス | 3904.1 | |
| 塩化カリウム | カール・ロス | 6781.1 | |
| 塩化ナトリウム | シグマ・アルドリッチ | 31434-M | |
| スクリューキャップ容器 | サルスタット | 75.562.300 | |
| アジ化ナトリウム | カール・ロス | K305.1 | |
| 学生広告鉗子 | ファインサイエンスツール | 91106-12 | |
| 学生ハルステッド・モスキート止血 | サイエンスツール | 91308-12 | |
| スーパーフロスト接着顕微鏡スライド | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin 自家蛍光 Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas 春はさみ、3mm | ファイン サイエンス ツール | 15000-00 | |
| Vectashield 退色防止 取り付け Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 ディッシュ アタッチメントVibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (実体顕微鏡) | Wild Heerbrugg | はもう利用できません |
参考文献
- Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
- Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging coch....
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