方法論記事

滑膜関節バイオメカニクス、メカノバイオロジー、物理調節の研究のための摩擦試験バイオリアクター装置

DOI：

10.3791/63880

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2022年6月2日

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1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Mechanical Engineering, Columbia University, 3Department of Orthopedic Surgery, Columbia University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本プロトコルは、接触する2つの生物学的対向面に同時に相互摺動および通常の荷重を加える摩擦試験装置を記載する。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

原発性変形性関節症(OA)では、加齢に伴う正常な「摩耗と涙」は、軟骨がその耐荷重および潤滑機能を維持する能力を阻害し、有害な物理的環境を助長する。関節軟骨と滑膜の摩擦相互作用は、組織レベルの摩耗および細胞メカノトランスダクションを介して関節の恒常性に影響を与える可能性がある。これらの機械的および機械的プロセスを研究するために、関節の動きを複製することができる装置が記載されている。摩擦試験装置は、2つの接触する生物学的対向面への相互平行移動運動および通常の荷重の送達を制御する。この研究は滑膜軟骨構成を採用し、摩擦係数測定はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)または滑液(SF)浴中で実施された試験のために提示される。試験は、高負荷下でのSFの潤滑特性を強調し、接触応力の範囲に対して実施された。この摩擦試験装置は、二節骨関節関節に関連する適用された生理学的負荷に応答して生きている関節組織の物理的調節を研究するための生体模倣バイオリアクターとして使用することができる。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

変形性関節症(OA)は、3200万人以上の米国成人が罹患する衰弱性変性関節疾患であり、医療費および社会経済的費用は165億ドルを超えています1。この疾患は、古典的には、関節軟骨および軟骨下骨の分解によって特徴付けられてきた。しかし、滑膜炎がOAの症状および進行に関連しているため、滑膜への変化は最近高く評価されている2,3,4。原発性(特発性)OAでは、加齢に伴う正常な「摩耗と涙」は、軟骨がその耐荷重および潤滑機能を維持する能力を阻害する。関節軟骨層の長時間の摺接またはインプラント材料に対する軟骨の摺接によって生じる応力は、表面下疲労破壊5、6による層間剥離摩耗を促進することが示されている。関節7,8内に動的機械的環境が存在するため、関節軟骨と滑膜の摩擦相互作用は、組織レベルの摩耗および細胞メカノトランスダクションを介して関節の恒常性に影響を与え得る。これらの機械的および機械的プロセスを研究するために、圧縮荷重および摩擦荷重5,6,9,10,11,12,13を厳密に制御して、関節の動きを再現する装置が設計されている。

本プロトコルは、生体組織外植体の接触面に相互の平行移動運動および圧縮荷重を送達する摩擦試験装置を記載する。コンピュータ制御デバイスにより、各テストの所要時間、加えられた負荷、平行移動ステージの可動域、および平行移動速度をユーザーが制御できます。このデバイスはモジュール式で、組織オンティッシュ(軟骨オン軟骨および滑膜オン軟骨)やティッシュオンガラスなど、さまざまなカウンターフェースのテストが可能です。試験者によって得られた機能的測定値に加えて、組織および潤滑浴成分は、所与の実験レジメンによって付与される生物学的変化を評価するために、試験の前後に評価することができる。

軟骨トライボロジーの研究は何十年も前から行われており、軟骨とガラスおよび軟骨上の軟骨との間の摩擦係数を測定するためにいくつかの技術が開発されてきた14,15。異なるアプローチは、関心のあるジョイントおよび/または潤滑機構によって動機付けられる。実験変数の制御と生理学的パラメータの反復との間にはしばしばトレードオフがある。振り子スタイルのデバイスは、1つのジョイント面が第2のサーフェス14,16,17,18上で自由に平行移動する単純な振り子の支点として無傷のジョイントを利用する。無傷の関節を使用する代わりに、摩擦測定は、軟骨外植体を所望の表面14、19、20、21、22、23、24、25上にスライドさせることによって得ることができる。報告された関節軟骨の摩擦係数は、動作条件に応じて広い範囲(0.002〜0.5)にわたって変化している14,26。回転運動23,27,28を複製する装置が作成されている。Gleghorn et al.26は、Stribeck曲線解析を用いて軟骨潤滑プロファイルを観察するためのマルチウェルカスタム摩擦計を開発し、平らなガラスのカウンターフェースに対して軟骨間に線形振動摺動運動を適用した。

この装置は、摩擦応答を単離し、様々な負荷条件下での生体組織の機械生物学を探索することを目的としている。この装置は、純粋な転がり運動における抵抗が関節軟骨29の測定された摩擦係数に対して無視できるという理解のもとに、転がり運動と摺動運動の両方を近似することができる圧縮摺動による関節関節をシミュレートする単純化された試験セットアップを採用している。もともと関節軟骨9の摩擦応答に対する間質液加圧の影響を研究するために構築されたこの試験機は、軟骨10の表面ゾーンを除去する摩擦効果、滑液11の潤滑効果、軟骨摩耗仮説5、6、30、滑膜オン組織摩擦測定13などのトピックを探求するために使用されてきました。.摩擦試験バイオリアクターは、無菌条件下で摩擦実験を行うことができ、摩擦力が生きている軟骨および滑膜のメカノ生物学的応答にどのように影響するかを探る新しいメカニズムを提供する。この設計は、二節骨関節に関連する適用された生理学的負荷に応答して生きている関節組織の物理的調節を研究するための生物模倣バイオリアクターとして使用することができる。

この研究は、さまざまな接触応力および異なる潤滑浴における滑膜軟骨摩擦試験の構成を提示する。ほとんどの関節の関節表面積は、かなりの程度まで、滑膜組織31である。滑膜対軟骨摺動は一次耐荷重面では起こらないが、2つの組織間の摩擦相互作用は依然として組織レベルの修復および細胞メカノトランスダクションに重要な意味を持つ可能性がある。滑膜の内膜層上に存在する線維芽細胞様滑膜細胞(FLS)は、流体誘発性剪断応力32に応答するメカノ感受性であることが以前に示されている。ストレッチ33、34 および流体誘起剪断応力35 がFLS潤滑剤製造を調節することも実証されている。そのようなものとして、滑膜と軟骨との間の直接摺動接触は、滑膜内の常駐細胞に別の機械的刺激を提供し得る。

滑膜摩擦係数に関する報告はごくわずか31,36件公開されている。Estellら13は、生物学的に関連するカウンターフェイスを利用して、以前の特徴付けを拡大しようとした。摩擦試験装置の生体組織検査能力により、関節関節中の生理学的組織相互作用を模倣し、滑膜細胞機能に対する接触せん断応力の役割と、滑膜と軟骨のクロストークへの寄与を解明することができる。後者は、関節炎および傷害後の滑膜関節炎症の媒介に関与している。軟骨が滑膜および滑液に物理的に近接しているため、軟骨は軟骨形成を含む多能性能力を示す滑膜細胞を含み、滑膜細胞は軟骨の恒常性において役割を果たし、関節表面に生着することによって修復することが仮定される。この文脈において、軟骨−滑膜および滑膜−滑膜の物理的接触および相互剪断は、軟骨損傷の領域への滑膜細胞のアクセシビリティを増加させ得る37、38、39、40。滑膜と軟骨の配置を利用した研究は、関節総組織力学とトライボロジーに関する洞察を提供するだけでなく、関節の健康を維持するための新しい戦略にもつながる可能性があります。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

地元の食肉処理場から得られた若年ウシ膝関節を本研究に使用した。このようなウシ標本サンプルを用いた研究は、コロンビア機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)から免除されています。

1. 摩擦試験装置の設計

メモ:摩擦試験装置の概略図を 図1に示します。この装置は、構造支持のためのプラットフォームとして機能する剛性ベースプレート(図示せず)上に構築される。

  1. ステッピングモーターを水平平行移動ステージに取り付け( 材料表を参照)、接触面に相互平行移動運動を提供する2軸摩擦試験装置を作成します。
  2. 平行移動ステージに多軸ロードセルを取り付けます(材料表を参照)。取り付けられたロードセルは、z方向の法線荷重(Fn)とx方向の接線方向荷重(Ft)を測定するために使用されます。
  3. 平行移動ステージにリニアエンコーダ(材料表を参照)を装備して、ステージの水平変位(ux)を記録します。さらに、ローディングステージにリニアエンコーダ(材料表を参照)を装備して、プラテンの垂直変位(uz)を記録します。
    メモ: 平行移動ステージエンコーダは、接触サーフェスの相対的な接線方向変位を記録し、この情報は、往復スライドの新しいサイクルの開始を検出するために使用されます。
  4. ローディングプラテン(上部接触面)をガラス、軟骨、または滑膜カウンターフェースとして構成します。プラテンをねじ付き支持棒 を介して ローディングステージに接続します。
  5. ロードセルの上部に2部構成の磁気ベースを取り付けます( 材料表を参照)(1)ロードセルに恒久的に取り付けられた固定ベースと(2)固定ベースに磁気的に接続する取り外し可能なベース。2 つのパーツがしっかりと接続されていることを確認します。
    メモ: 取り外し可能なベースには、平行移動カウンターフェース(底部接触面)が保持されます。
  6. 通常の荷重を処方する。ローディングプラテンとサポートロッドの上にあるリニアベアリングに取り付けられたデッドウェイトを使用してください。あるいは、底部接触面41に動的に負荷をかけることができるボイスコイルアクチュエータ(材料表参照)を用いて荷重を指定する。
  7. アルミニウムフレームのアクリル筐体( 材料表を参照)内にデバイスを収納し、環境を汚染から保護します。
    メモ:カスタムLabVIEWプログラムは、各テストの所要時間、ステージ移動経路、加速度(方向転換)、速度をユーザが制御してデバイス( 補足コーディングファイルを参照)を制御します。法線力、接線力、ステージ変位、およびクリープ変位は、データ集録ハードウェアおよびソフトウェアを使用してテスト全体にわたって監視されます( 材料表を参照)。

2. 試料作製と取り付け

  1. 以下の手順に従って滅菌組織採取の準備をします。
    メモ: 無菌収穫が望ましくない場合は、手順 2.2 に進みます。
    1. オートクレーブ内の金属工具を滅菌します。ジョイントホルダーに70%エタノールをスプレーし、生物学的安全キャビネット(BSC)に入れます。キャビネットを閉じて紫外線(UV)サイクルを1回繰り返します。
    2. オートクレーブから工具を取り出します。工具、ベタジン、滅菌メスブレード、および70%エタノールを含むビーカーをBSCに入れます。
    3. BSC内で、工具を開き、70%エタノールビーカーに入れます。メスの刃をメスの取っ手に取り付けます。
    4. 収穫のためにジョイントを準備します。ジョイントの外側に70%エタノールをスプレーし、アルミホイルで30分間包みます。関節カプセルを壊さないように注意してください。
      注:若年ウシの膝関節は、無傷のカプセルを確実にするために、大腿骨および脛骨を関節よりも約15cm上および下方に切断して受け取った。
    5. 30分後、包んだ接合部をBSCの内側に置きます。ホイルを開き、ジョイントをホルダーに固定します。関節表面を横切ってベタジンを静かに拭くことによって、関節をベタジンで覆う。
      注:滑膜固有の指示および軟骨固有の指示については、それぞれステップ2.2およびステップ2.3を参照してください。
  2. 以下の手順に従って幼いウシ滑膜を収穫する。
    1. 前側が離断側を向いてリングスタンド( 材料表を参照)を使用して脛骨大腿骨関節カプセルを固定する。鉗子とメス刃を用いて、脛骨よりも優れた5〜10cm(関節の大きさに依存する)の水平切開を用いて膝蓋骨腱を切断する(図2A)。
    2. 剥離した膝蓋骨腱を鉗子で保持します。Vの形をした前後への2つの切り込みを作ります(図2B、C)。これらのカットは膝蓋骨を解放するはずです。
      注:関節が開き始めたら、前十字靭帯(ACL)、後十字靭帯(PCL)、内側側副靭帯(MCL)、側副靭帯(LCL)、および半月板を断ち切らないように注意してください。
    3. 関節の後ろの膝蓋骨を回転させるか、関節から完全に取り除きます。関節の内側および外側の滑膜に表面的な組織を慎重に取り除き、滑膜を露出させる。
    4. メス刃を用いて、滑膜関心領域の輪郭をなぞる。鉗子を使用して、滑膜の一端をつかみ、滑膜遠位を下層の骨まで伸ばすように静かに持ち上げます。メスの刃を使用して、骨から滑膜を除去します(図2D、E)。
    5. 組織を適切な培養培地または試験浴溶液に入れる。滑膜外植物は、所望の実験のために培養されるか、または取り付けられて試験のために使用され得る。
      注:培養培地/試験浴溶液は、研究グループの好みによって異なる場合があります。本研究で使用したカスタムメイドのものについては、 資料表をご覧ください。
  3. 幼いウシ軟骨(大腿骨プラグと脛骨ストリップ)を収穫します。
    1. ACL、PCL、MCL、LCLを切断して大腿骨を脛骨から分離する。大腿骨顆頭軟骨をスライスしたり、半月板を通って脛骨高原にスライスしたりしないように注意してください。分離した組織をそれぞれのホルダーに入れて解剖します(大腿骨の場合はステップ2.3.2、脛骨の場合はステップ2.3.3)。
    2. リングスタンドを使用して大腿骨を固定します。所望の形状およびサイズの生検パンチを用いて、大腿骨顆状関節軟骨表面に対して正常な器具を骨に到達するまで駆動する(図3A)。
      1. プラグの骨への接続を緩め、パンチを左から右、前方に後方に動かします。パンチを外さずにこれを行います。
        注:骨が軟骨から離れると、パチパチという音が聞こえることがあります。
      2. 下地の骨からパンチ、つまりプラグを取り外します(図3B)。必要に応じて、顆頭の残りの手つかずの位置について、手順 2.3.2、2.3.2.1、および 2.3.2.2 を繰り返します。
        メモ:大腿骨プラグをテストベースに取り付ける準備として、プラグの深い側を平らに剃る必要があるかもしれません。これは、ボックスカッターまたはメスで行うことができます。
      3. 組織を適切な培養培地または試験浴溶液に入れる。大腿骨プラグは、所望の実験のために培養されるか、または取り付けられ、試験のために使用され得る。
    3. 調節可能なホルダーに脛骨を固定します( 材料表を参照)。軟骨表面との接触を避けながら、メニスカスを慎重に取り除きます(図4A)。
      1. 脛骨高原の外縁で、ボックスカッターを使用して軟骨に対して垂直に骨に向かって切断します。軟骨を完全に切断して、まっすぐなエッジ/側面を作ります(図4B)。各脛骨プラトーエッジから約2mm離れたところで切断を開始し、余分な組織を除去する。軟骨の内側の縁をスコアリングする(図4C)。
        注:この時点で、骨は脛骨高原の外側縁の軟骨の下に見える必要があります。
      2. 外側のエッジで、ボックスカッターを使用して、骨と軟骨の界面をきれいに切断します(図4D)。
        注:切断は軟骨表面と平行で、軟骨と骨の分離を開始するのに十分な深さで、内側に約5mmでなければなりません。
      3. プラトー表面から脛骨ストリップを取り外すには、手順 2.3.3.2 で作成したカットの下にマイナスドライバを慎重に挿入します。ドライバを静かに回転させて、軟骨下骨から関節軟骨を緩めます(図4E)。
        注:骨が軟骨から離れると、パチパチという音が聞こえることがあります。
      4. サンプルが緩んだら、軟骨ストリップが骨から外れるまでドライバーをゆっくりと前方に押します。ドライバーを軟骨の方向ではなく骨の方に押します。脛骨プラトー関節軟骨が下層の骨から完全に除去されるまで、このプロセスを複数の場所で繰り返す(図4F)。
      5. ボックスカッターを使用して、脛骨プラトー表面を切断し、所望のサイズおよび厚さの長方形サンプルを生成する。
        注:本研究では、10 mm x 30 mmのストリップを切断しましたが、この寸法は、所望の実験および試験セットアップに基づいて変更することができます。
      6. 組織を適切な培養培地または試験浴溶液に入れる。脛骨ストリップは、所望の実験のために培養されるか、または取り付けられて試験のために使用され得る。
      7. 必要に応じて、第2の脛骨プラトーに対してステップ2.3.3.1-2.3.3.6を繰り返します。
  4. 以下の手順に従って滑膜と軟骨をマウントします。
    1. 必要に応じて、試験する脛骨ストリップサンプルを選択します。
      メモ:ストリップは底面のカウンターフェースとしてテストできます。
      1. 取り外し可能な磁気ベースを取り外し( 材料表を参照)、直径60mmのシャーレを取り外し可能なベースの上面に接着します。
      2. シャーレを所定の位置に接着した状態で、取り外し可能なベースを固定ベースに取り付け、シャーレにスライド方向を示すマークを付けます。
      3. 少量のシアノアクリレート( 材料表を参照)を皿の中央に塗ります。脛骨帯をステージのスライド方向に合わせます(2.4.1.2のシャーレのマークで示されるように)。軟骨ストリップを皿に静かに押し付けます。軟骨表面を傷つけないように注意してください。
        メモ:吸引ツール( 材料表を参照)は、摩擦試験する表面を損傷することなく軟骨に穏やかな圧力を加えることができます。
      4. 取り外し可能な磁気ベース(軟骨ストリップが取り付けられたもの)を摩擦試験機で対をなす磁気固定ベースに復元します。ペトリ皿に目的の試験浴溶液を満たします。試験浴溶液は軟骨を完全に覆わなければならない。
    2. 必要に応じて、テストする大腿骨軟骨プラグを選択します。
      メモ:プラグは、底面または上部のカウンターフェースとしてテストできます。
      1. 大腿骨顆が底面の対面として使用されている場合は、取り外し可能な磁気ベースを取り外し、直径60mmのシャーレを取り外し可能なベースの上面に接着します。
        1. 少量のシアノアクリレートを皿の中央に塗ります。軟骨プラグを皿にそっと押し付けます。
          注:吸引ツールは、摩擦試験する表面を損傷することなく、軟骨に穏やかな圧力を加えることができます。
        2. 取り外し可能な磁気ベース(軟骨プラグが取り付けられたもの)を摩擦試験機の対になった磁気固定ベースに復元します。ペトリ皿に目的の試験浴溶液を満たします。試験浴溶液は軟骨を完全に覆わなければならない。
      2. 大腿骨軟骨を上部のカウンターフェースとして使用する場合は、摩擦試験機からローディングプラテンとサポートロッドを取り外します。必要に応じて、既存のプラテンを取り外し、軟骨の取り付けに適した新しいプラテンを選択します。
        1. 少量のシアノアクリレートをプラテン表面に塗布する。軟骨プラグをプラテンに静かに押し付けます。
          注:吸引ツールは、摩擦試験する表面を損傷することなく、軟骨に穏やかな圧力を加えることができます。
        2. ローディングプラテン(軟骨プラグ付き)とサポートロッドを摩擦試験機に復元します。軟骨プラグが底面のカウンターフェースの上に浮かび、試験浴に沈むように、ローディングプラテンの垂直高さを調整します。必要に応じて、さらにテストバスソリューションを追加します。
    3. 必要に応じて、試験する滑膜サンプルを選択します。
      注:滑膜は、下部または上部のカウンターフェースとしてテストできます。
      1. 滑膜が底面の対面として使用されている場合は、取り外し可能な磁気ベースを取り外し、取り外し可能なベースの上面に直径60mmのシャーレを接着します。
        1. 所望の直径のカスタム機械加工された円形アクリル - シリコーンポストを皿の中央に接着する。
        2. 鉗子を使用して、滑膜を支柱の上に置きます。滑膜を固定するには、Oリング( 材料表を参照)をその円周上に広げます。
        3. 鉗子を使用して、滑膜を静かに引っ張って、Oリングの下で教えられ、平らな組織を伸ばします。余分な組織を外科用はさみでトリミングします。
        4. 取り外し可能な磁気ベース(滑膜を取り付けた状態)を摩擦試験機の対になった磁気固定ベースに復元します。ペトリ皿に目的の試験浴溶液を満たします。試験浴溶液は滑膜を完全に覆わなければならない。
      2. 滑膜を上部のカウンターフェースとして使用する場合は、摩擦試験機からローディングプラテンとサポートロッドを取り外します。必要に応じて、既存のプラテンを取り外し、滑膜マウントに適した新しい円形プラテンを選択します。
        1. 鉗子を使用して、滑膜を円形プラテンの上に置きます。滑膜を固定するには、Oリングをその円周上に広げます。
        2. 鉗子を使用して、滑膜を静かに引っ張って、Oリングの下で教えられ、平らな組織を伸ばします。余分な組織を外科用はさみでトリミングします。
        3. ローディングプラテン(シノビウムが取り付けられたもの)とサポートロッドを摩擦試験機に復元します。滑膜が底部のカウンターフェースの上に浮かび上がり、試験浴に沈むように、ローディングプラテンの垂直高さを調整します。必要に応じて、さらにテストバスソリューションを追加します。

3. 摩擦試験

メモ:これらのテストには、カスタムLabVIEWプログラムと関連ハードウェア( 補助コーディングファイルを参照)が使用されます。カスタムコードはLabVIEW 2010で構築され、この同じレガシーバージョンでメンテナンスされています。その結果、コードは最新バージョンのソフトウェアと前方互換性がない場合があります。次のボタン ストライクとユーザー インターフェイスの参照は、カスタム コードにのみ関連します。異なるソフトウェアバージョンで作業している場合は、コードを変更することで同様のカスタムプログラムを作成できます。

  1. 取り付けた試料(ステップ2.4)を摩擦試験装置に挿入します。
    注:試料は試験浴溶液に沈める必要がありますが、互いに接触してはなりません。
  2. ソフトウェアプログラムを開き、ステージ速度、ステージ加速度、移動経路(距離)、およびテスト期間(図5)のテストパラメータを指定します。
    1. プログラムで、 アナログ・データ・ビルド MFDAQ、 ロード PID の初期化、および 動的呼び出し元のトリガーの 3 つのウィンドウを開きます。
    2. アナログ・データ・ビルドMFDAQウィンドウを実行するには、「実行」(白い矢印)ボタンを押します。
    3. 「 ロード PID の初期化」ウィンドウ を実行するには、「実行 」(白い矢印) ボタンを押します。
    4. [動的呼び出し元のトリガー] ウィンドウの [ステッパー] タブに移動します。ユーザー入力ボックスで、翻訳ステージの加速度、速度、および距離を指定します。
      メモ: 距離の値は、摩耗トラックの半分の長さを設定します。つまり、ステージは指定されたゼロ位置 (ステップ 3.5) から、正と負の X 方向の両方で設定された距離値に移動します。
    5. [ステッパー] タブで、[ステッパー時間インデックス] ファイル パスを選択して、テスト期間を指定します。「時間状態」テーブルの右下にある「フォルダを開く」ボタンをクリックし、ファイルを選択します。
    6. テスト期間は、[ボイスコイル]タブでも指定します。[ダイナミック発信者のトリガー]ウィンドウの[ボイスコイル]タブに移動します。手順 3.2.5 と同様に、[時間状態] テーブルの右下にある [フォルダーを開く] ボタンをクリックしてボイス コイル インデックス ファイル パスを選択し、ファイルを選択します。期間は、[ステッパー] タブの期間と一致する必要があります。
  3. 通常の荷重を処方する。デッドウェイトを使用する場合は、ローディングプラテンの上のリニアベアリングに目的のウェイトを置きます。加えられた荷重にローディングプラテンとサポートロッドの重量を加えたものがロードセルの定格容量を超えていないことを確認します。
  4. [ファイルに書き込み] ボックスの右側にある [フォルダーを開く] ボタンを使用して、データ ストレージのパスと ファイル名を選択します。ファイルを「.txt」拡張子で保存します。
  5. 下部のカウンターフェイスを上部のカウンターフェイスの下に配置します。これをゼロの x 位置として設定します。
    1. [ 動的発信者のトリガー] ウィンドウを実行するには 、[実行 ] (白い矢印) ボタンを押します。 ステッピングタブで、 ホーム ボタンをクリックして、ステージを最後に保存したゼロのx位置に移動します。
    2. カウンターフェースが整列していない場合は、 緑色の左 矢印ボタンと 右矢印 ボタンをクリックしてステージを移動します。目的の位置に達したら、[ ゼロ] ボタンをクリックして、現在のステージの場所を新しいゼロの x 位置として保存します。「 動的呼び出し元のトリガー」ウィンドウを停止するには、「 停止 」ボタンをクリックします。
      注: ステージの場所は、「 動的呼び出し元のトリガー」ウィンドウが実行されている間のみ保存できますが、ステージはまだプログラムによって指定されたとおりに移動していません。ステップ3.5.1で 実行 (白矢印)ボタンを押すと、ステージが動き始める前に15秒の時間枠が開始されます。この15秒の時間枠を使用してステージを移動し、目的のゼロ位置を保存します。
    3. 最初の試行で目的のゼロ x 位置が得られない場合は、ステップ 3.5.1 を繰り返します。
      メモ: ユーザーが下部のカウンターフェイスを上部のカウンターフェイスの下に移動すると、断続的に Zero ボタンを押すとステージ位置が保存される場合があります。ホームボタンをクリックすると、ステージが「 ゼロ」 ボタンで保存された最後の位置に移動することを思い出してください。
  6. 上部と下部のカウンターフェースが中央に配置されたら、ステージの周期的な動きを開始して、サンプルの摩擦試験を開始します。これを行うには、[実行] (白い矢印) ボタンを押して [ 動的呼び出し元のトリガー] ウィンドウ を実行します 。
  7. ステージが動いたら、ゆっくりと上部のカウンターフェイスを下部に接触させます。
    メモ:適用荷重値は、ソフトウェアウィンドウでFzリアルタイムプロットを見ることで確認できます(図5A)。
  8. テストを実行し、摩擦テストデータを収集します。
    メモ: 手順 3.5 で記録されたデータはすべて上書きされます。リアルタイムヒステリシスは、 トリガダイナミックコーリングウィンドウで確認できます(図5C)。
  9. 希望の試験期間が経過したら、 停止 ボタンを押し、上部のカウンターフェースを持ち上げて下部のカウンターフェースと接触しないように移動して、試料をアンロードしてテストを停止します。

4. データ処理

注: カスタム MATLAB プログラムは、データ処理に使用されます ( 補足コーディング・ファイルを参照)。このコードは、カスタムLabVIEWコードで指定された出力ファイルに対して呼び出します。

  1. カスタムコードを使用して、サイクルごとの摩擦係数とクリープ変位(時間依存の組織変形)を計算します。
    1. 関連するすべてのコードが同じフォルダ("frictioncycle_fun.m"、"frictioncycle_Hysteresis_plot.m"、"frictioncycle_MU_plot.m"、および "frictioncycle_run.m")に保存されていることを確認します。
      メモ:これらのMATLABコードは、前述のLabVIEWコードからの特定の出力で使用するために記述されています。ユーザーが独自のコードを作成した場合、またはここで説明するコードに変更を加えた場合は、それらの変更に対応するために MATLAB スクリプトを編集する必要があります。
    2. frictioncycle_run.m ファイルを開きます。スクリプトの [実行] (緑色の矢印) ボタンをクリックします。分析する生データファイルを選択し、目的のMATLAB出力保存場所を選択します。
      メモ: ソフトウェアは、テスト期間によっては、データの処理に数分かかる場合があります。
  2. 必要に応じて、試験浴溶液の試験された外植体およびアリコートについて、標準的な組織評価および培地分析を実行する。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

滑膜軟骨上の構成を、若年ウシ外植体の摩擦試験に使用した。滑膜は、内膜層が下層の軟骨と接触するように、直径10mmのアクリルローディングプラテンに取り付けられた。軟骨対面として脛骨帯を用いた(図6A)。脛骨ストリップは、約1.4mmの深さおよび10mm x 30mmのサイズで切断された。サンプルを、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)浴またはウシ滑液(SF)浴中で37°Cで1時間試験した。SF浴は、PBSとウシSFの50/50混合物から構成されていた。ステージ加速度は100mm/s2、ステージ速度は1mm/s、ステージパス距離は2.5mm6,9,42であった。デッドウェイトを使用してさまざまな法線荷重を適用し、180、230、および300 kPa11,43の接触応...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

軟骨が圧縮力、引張力、および剪断力、ならびに静水圧および浸透圧44,45にさらされるため、関節内に動的機械的環境が存在する。軟骨は関節の主な耐荷重組織であるが、滑膜はまた、軟骨表面および組織が折り畳まれる領域におけるそれ自体との摩擦相互作用を受ける。軟骨と滑膜との間の物理的相互作用は、細胞を転移させ、間葉系幹細胞を関節環境に放出する原因である可能性が高く、(限られた)関節軟骨修復機構に寄与する潜在的な細胞源を提供する37,38,39,40。軟骨と滑膜の両方の摩擦特性は、組織の摩耗による関節の維持と変性に重要な意味を持つ13。関節の恒常性と疾患の進行の原因となる機械的および機械的および機械的プロセスを研究するために、相互の...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らには開示するものは何もありません。

謝辞

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この研究は、整形外科科学研究財団、NIH 5R01 AR068133、NIH TERC 5P41EB027062、およびNIGMS R01 692 GM083925(Funder ID:10.13039/100000057)の支援を受けた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アルミホイルレイノルズグループホールディングスレイノルズラップ滅菌組織収穫
アルミフレームアクリルエンクロージャカスタムメイド摩擦試験機部品
オートクレーブ可能なインスタントシーリング滅菌ポーチフィッシャーブランド01-812-54工具の滅菌
オートクレーブバクストン工具
ビーカー (250 mL)Pyrex Vista70000ティッシュハーベスト
ベタジン (ポビドン ヨウ素調製液)Medline Industries, LPMDS093906滅菌ティッシュハーベスト
生物学的安全キャビネットLabconcoPurifier Logic+ Class II, Type A2 BSCSterile tissue harvest
Biospy punchSteritool Inc.50162ティッシュハーベスト
ボックスカッターアメリカンセーフティカミソリカンパニー94-120-71ティッシュハーベスト
サーキュラーアクリルシリコンポスト(滑膜)カスタムメイドティッシュマウント
培養培地カスタムメイドDMEM(カタログ番号11-965-118;Gibco) に 50 μg/mL L-プロリン (Cat.番号P5607;シグマ)、100 μg/mL ピルビン酸ナトリウム (Cat.番号S8636;シグマ)、1% ITS(Cat.番号354350;コーニング)、および1%抗生物質–抗真菌薬(Cat.No. 15-240-062, Gibco)
シアノアクリレート(ロックタイト420クリア)ヘンケル135455ティッシュマウント
デッドウェイトオーハウスノーマルロード
エタノール200プルーフデコンラボ株式会社270170 %に希釈
ベースThorLabs, Inc.SB1T摩擦試験機用
部品 鉗子(滑膜採取)ファインサイエンスツール11019-12組織採取
用鉗子(滑膜装着)エクセルタ3C-S-PI組織装着
水平リニアエンコーダ(並進ステージ用)RSF Electronics, Inc.MSA 670.63摩擦試験機コンポーネント、システム分解能1 & マイクロ;m
ホットグルーガン&グルーFPC CorporationSurebonder Pro 4000Aティッシュマウント
LabVIEWNational Instruments CorporationLabVIEW  2010摩擦試験プログラム
ロードセルJR3社20E12A-M25B摩擦試験機コンポーネント; 0.0019 lbs 分解能 (x&y、0.0038ポンドの解像度(z)
ローディングプラテンカスタムメイドティッシュマウント
OリングパーカーS1138AS568-009ティッシュマウント
ペトリ皿 (60mm)ファルコン351007ティッシュマウント
PivotLokワークポジショナー(脛骨ホルダー)インダストリーデポ、ピボットロックPL325ティッシュハーベスト
取り外し可能なベースThorLabs, Inc.SB1B摩擦試験機部品
リングスタンドティッシュハーベスト
メス刃株式会社ハベルズFSC22ティッシュハーベスト
メスハンドルFEATHER Safety Razor Co., Ltd.No. 4ティッシュハーベスト
ドライバーヴェラ3334ティッシュハーベスト
ステージJMAR摩擦試験機
ステッピングモーター株) オリエンタルモーターPK266-03B摩擦試験機部品
サクションツールVirtual Industries, Inc.PEN-VAC 真空ペンティッシュマウント
サポートロッドオーダーメイドティッシュマウント
手術用ハサミファインサイエンスツール14061-09ティッシュマウント
滑液(ウシ)Animal Technologies, Inc.摩擦試験浴
試験浴カスタムメイドリン酸緩衝生理食塩水(PBS):0.04%イソチアゾロン塩基殺生物剤(Proclin 950 Cat.番号46878-U;Sigma)および0.1%プロテアーゼ阻害剤 - 0.05 Mエチレンジアミン四酢酸、EDTA(Cat.番号0369;Sigma)
組織培養インキュベーターFisher ScientificIsotempSterile culture
垂直リニアエンコーダ(ローディングステージ用)RenishawT1031-30A摩擦試験機コンポーネント; 20 nm
分解能 ボイスコイルアクチュエータH2W TechnologiesNCC20-15-027-1RC摩擦試験機コンポーネント
の滅菌 固定 ( プロテアーゼ阻害剤を含む

参考文献

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