血管研究における機能イメージングのためのマルチスペクトル光音響断層撮影

サマリー

本プロトコルは、 インビボ ヒト皮膚血管系のマルチスペクトル光音響画像の取得を記載する。これらには、機能分析の対象となる発色団と見なされるヘモグロビンとメラニンの定量が含まれます。

要約

微小循環障害は、さまざまな疾患プロセスで認識されており、血管研究におけるこの成長テーマの根底にあります。近年、ライブイメージングシステムの開発は、臨床的関心と応用を備えたリアルタイムで定量化可能なエンドポイントを提供できる新しい機器を作成することを目的として、基礎研究と臨床研究の両方で(分析)ペースを設定しました。近赤外分光法(NIRS)、陽電子放出断層撮影法(PET)、コンピューター断層撮影法(CT)、磁気共鳴画像法(MRI)などの技術が利用可能ですが、コスト、画像の解像度、およびコントラストの低下が共通の課題として認識されています。光音響断層撮影(OT)は、最先端の光吸収および空間分解能容量(マイクロメートルの光学分解能からミリメートルの音響分解能まで)と組織の深さを組み合わせた、血管機能イメージングの新しい視点を提供します。本研究では、マルチスペクトル光音響断層撮影(MSOT)の機能イメージングへの適用性を検証しました。このシステムは、Nd:YAGレーザーによって励起される調整可能な光パラメトリック発振器(OPO)を使用し、680nmから980nmの波長で3Dプローブによって感知された励起パルスを提供します。人間の前腕から得られた画像は、特定の発色団の応答に基づいて、特定のアルゴリズム(メーカーのソフトウェア内で提供される)によって再構築されました。最大酸素化ヘモグロビン(Max HbO₂)および脱酸素化ヘモグロビン(Max Hb)、総ヘモグロビン(HbT)、および血管密度(μVu)、ユニット間平均距離(ζAd)、および毛細血管血液量(^mm3)に対する平均酸素飽和度(mSO2)をこのシステムを使用して測定できます。このOTシステムで見られる適用可能性は関連しています。継続的なソフトウェア開発により、このイメージングシステムの有用性は確実に向上します。

概要

心血管疾患は世界中で再発する死因のトップであり、あらゆる医療システムにとって大きな負担となっています^1,2。テクノロジーは、心臓と血管の基本的な病態生理学の理解の拡大に大きく貢献しており、より正確な診断ツールと、病気の早期発見とより効果的な管理の可能性を提供しています。イメージング技術は、心臓および主要血管の性能を測定するだけでなく、はるかに小さなスケールで、毛細血管密度、局所灌流および体積、および内皮機能障害などの特性を計算する可能性を提供します。これらの技術は、直接的な臨床応用を伴う血管生物学への最初の定量的洞察を提供しました。毛細血管密度、局所灌流の減少、または閉塞の変化は虚血状態に対応している可能性が高く、イメージングの役割の増大を説明するのに役立ち、心血管の研究と実践に不可欠なツールになります^3,4,5。

近年、機能イメージングは、超音波(米国)近赤外分光法(NIRS)、陽電子放出断層撮影(PET)、コンピューター断層撮影(CT)、および磁気共鳴画像法(MRI)をいくつかのよく知られた例として、技術革新のペースを設定してきました。ただし、コストや患者の安全性(および快適性)から画像のコントラストや解像度まで、複数の懸念がアプリケーションを制限しています^6,7。光音響断層撮影(OT)は、最近、光学ベースの血管研究における新しい方向性として浮上しています。この技術は、超短レーザーパルスに衝突した組織の熱弾性膨張によって発生する超音波の検出を中心に、以前から知られています^6,8。熱発生と組織膨張のこの物理的反応は、超音波トランスデューサによって検出された音響信号を呼び起こします。可視から近赤外までの光のパルスを使用し、音響背景信号がないことは、分解能の深さに利益をもたらします。検出されたコントラストは、存在する最も重要な発色団(ヘモグロビンまたはメラニン)から生じます。他の技術と比較して、OTには、(1)コントラストを必要としない(ラベルフリーイメージング)、(2)超音波検査よりもアーティファクトが少なくコントラストと解像度が優れている、(3)価格が低く、取得が速く、操作が簡単であるという利点があります^6,9,10,11。

マルチスペクトル光音響断層撮影(MSOT)は、最新世代のOT機器の1つです。励起パルスを提供するNd:YAGレーザーによって励起された調整可能な光パラメトリック発振器(OPO)で構築された3D画像は、680nmから980nmまでの波長の高周波超音波励起パルスから最大50Hzの繰り返し速度で検出された時間分解信号によって取得されます¹²。光音響イメージングプラットフォームは、さまざまな発色団を詳細に定量化します(わずか15 mm)。HbO2、Hb、メラニンなどの変数に簡単にアクセスできます。最大酸素化ヘモグロビン(Max HbO₂)や脱酸素化ヘモグロビン(Max Hb)など、関心のある他の変数も利用できます。メーカーのソフトウェアからの再構成アルゴリズムにより、血管密度(μVu)、ユニット間平均距離(ζAd)、毛細血管容積(mm³)などの他の変数を計算できます。

本研究では、この新しいシステムの本質的な運用面を探り、心臓血管の前臨床研究におけるその実用性と潜在的なアプリケーションをよりよく理解します。

プロトコル

実験プロトコルは、以前に大学の健康科学部の倫理委員会(EC。ECTS/P10.21)。手順は、人間の研究のために定義された優れた臨床実践の原則を完全に尊重しました¹³。平均年齢32.8歳±11.9歳の男女6人の健康な参加者(男女あたりn = 3)の便利なサンプルが大学コミュニティから選ばれました。選ばれた参加者は、正常血圧で非喫煙者であり、投薬や栄養補助食品を含まない必要がありました。血圧、心頻度、ボディマス指数も登録されました。すべての参加者は、研究の目的と期間を事前に知らされ、インフォームド書面による同意を提供しました。

注:この研究は、MSOTAcuity( 材料表を参照)を使用して実施され、今後は光音響イメージングプラットフォームとして参照されます。

1. 取得準備

注: 以下の実験的な説明では、画面コマンドは太字で表示されています。

1. 件名情報の読み込み:光音響イメージング機器の電源を入れます。機材のウォーミングアップ中に、参加者情報を紹介します。ソフトウェアのメインウェルカムウィンドウが開き、 スキャンの概要が表示されます。 患者IDをクリックした後、データ(名前、研究の宗派、個人データ、および関連する観察を含む)を導入し、 選択を押して申請を終了します。
2. プリセット選択: レーザーの準備ができました というメッセージが機器の画面に表示されていることを確認してください。ウォームアップ時間の後、機器画面のレーザーステータスバーをレーザー スタンバイからレーザー 準備 完了に変更する必要があります。このプロトコルでは、プリセットは発色団Hb、HbO₂、およびメラニン用に設計されています。正しいプリセットを選択すると、レーザー出力がテストされます。
3. この時点で、部屋のすべての参加者にレーザー安全グーグルを適用するように促すメッセージが画面にあることを確認してください。レーザー(パワー)スイッチのフットペダルを押して、レーザーパワーのセルフチェックを待ちます。数秒後、現在のレーザーステータスと検査レポートを含むウィンドウが表示されます。使用可能な OK ボタンを押して、このウィンドウを放します。
   注:光音響イメージングプラットフォームは、人間の目に特に危険なクラス4レーザーと見なされるNd:YAGレーザーを使用しています。したがって、このレーザーは十分な注意を払って取り扱う必要があります。
   注意: 適切な目の保護具を含むすべての安全手順が実施されていることを確認せずに、取得を行わないでください。

2. 測位と画像取得

1. 参加者を実験室環境(21°C±1°C、相対湿度40%〜60%)に順応させ、不必要な動きを最小限に抑えるために快適な位置を選択します。スキャンする領域が事前にクリーニングされていることを確認します。
   注意: 70%エタノール/水溶液で画像化する領域をきれいにするというメーカーの推奨事項をお勧めします。さらに、最良の画像取得のために、脱毛(該当する場合)が推奨されます。
2. プローブホルダーと手ぶれ補正
   1. 超音波ゲルの薄層を3Dカップに塗ります。手ぶれ補正には、3Dカップを目的のイメージング位置に保持する必要があります。対象エリアのロック可能なアームを配置して安定させます。この研究で使用したアームは社内で設計され、アルミニウムプロファイルコンポーネントで構築されています(図1)。
   2. 3Dカップを対象領域に配置した後、画像取得のために安定化アームロックを部分的にロックします。
      注:超音波ゲルの品質と塗布は重要です。気泡が存在すると、画像の定義が損なわれる可能性があります。
3. 検査メニュータブの閉塞後反応性充血(PORH)操作を使用した動的状態の画像取得。
   1. ベースラインコントロールスキャンを取得します。収縮した血圧カフを所定の位置に置いた状態で、イメージング用の視野を見つけたら、3Dカップポジショニングアームをしっかりとロックします。
   2. 圧力が高くなると読み出しが損なわれる可能性があるため、イメージング部位に最小限の圧力をかけます。Hb、HbO 2、およびメラニンの発色団を同時に測定するメーカーのデフォルトのプリセットHb、HbO₂、およびメラニンを押します。
      注意: 操作中は、適切な安全ゴーグルで目を保護することが必須です。
      注:皮膚のフォトタイプIVからVI(暗い肌)は誤読しやすいため、さらに処理するにはベースラインコントロール画像が必要です。画像取得中(レーザーがアクティブな場合)に安全ゴーグルを使用すると、人間の目は黄色と青の色しか認識できません。画像処理中に色を編集できます。
   3. ベースライン画像取得の解剖学的領域を選択します。探索目的のために、腹側前腕が推奨されます。レーザーフットスイッチペダルを押して続行します。
      注意: [ 表示 ](黄色)というラベルの付いたタッチスクリーンボタンは、押すと画面にライブ画像を表示します。画像の安定性ステータスは、タッチスクリーンの中央に灰色のバーとして表示され、3Dプローブの安定性を示します。
      1. 画像の安定性が最大になったら、タッチスクリーンのスナップショットボタンを押して、領域の スナップショット を撮る(またはキャプチャする)。各スキャンは、プリセット内で定義されたすべての波長について、10秒の取得時間にわたって150mmの音響深度で2〜2フレームを取得します。このベースライン取得スキャンには、合計30〜36フレームが含まれます。
         注:検出された発色団(Hb、HbO₂、およびメラニン)ごとに10フレームが最大深さ15mmで収集されます。
      2. 連続ビデオ取得のためにレーザーフットスイッチペダルを押し続け、タッチスクリーンの View ボタン(黄色)に注意してください。安定化された画像が表示されます。 録画 (青色)を押して、ライブ画像の記録を開始します。
      3. 停止ボタン(黒色)を押して録音を停止します。光音響イメージングプラットフォームは録画を停止し、ビデオを自動的にプレビューモードにレンダリングします。
   4. 動的測定(PORH図):この操作を説明するために、肘の上の患者の腕に圧力カフを調整します。収縮期上圧(~200 mmHg)でカフを膨らませ、手順2.3.1から2.3.3.1に従って、圧力下で画像化された血管系を取得します。
   5. 画像化された血管系に対する圧力解放の影響を評価するためのビデオを取得するには、2.3.3.2のようにビデオを取得しながら圧力バルブを開きます。以前と同様に、画面上のライブ画像に従います。
      注:この操作を実行するには、収縮期血圧を1〜5分間維持する必要があります。この圧力は、患者にさまざまな程度の耐性と不快感を引き起こす可能性があることに注意することが重要です。この側面は、実験中に慎重に管理する必要があります。

3. 画像解析プロトコル

1. 記録したスキャンを選択した/専用のフォルダーにコピーして、製造元の専用分析ソフトウェアを使用して別のコンピューターワークステーションでバックアップおよびさらに分析します。各スキャンは取得時間によって保存され、実行中のコードを含むスタディフォルダにプログラムによって順序付けられます。
   注: バックアップ コピーを強くお勧めします。記録された生データを直接操作することは可能ですが、ハードドライブがクラッシュすると生データが損傷する可能性があるため、強くお勧めしません。
2. ワークステーション・コンピューターで分析プログラムを開きます。プログラム メニューを選択して>スタディを開き 、ファイルをインポートし、バックアップスキャンにアクセスします。スタディを開き、フォルダーの一番下までスクロールして(スキャンが記録されています)、.NOD拡張子。これは、スタディを開くためにソフトウェアによって認識される唯一のファイルタイプです。
   手記：。NODファイルには、各研究に与えられた実行番号で自動的に名前が付けられ、ファイル名に患者情報は含まれていません。
3. 画像再構成の場合は、ソフトウェア メニュー>高度な処理にアクセスして画像分析モジュールを開きます。
   1. プログラムワークフロータブが上部のメニューバーに表示されている(黒)ことを確認します(補足図1): メニュー; スキャンの概要; 再建; フルエンス補正; スペクトルアンミキシング; 視覚化と分析。分析中、アクティブ化されたワークフロータブは青色で表示されます。
      注: アドバンス処理 が開かれていない場合、ソフトウェアは スキャンの概要 と 視覚化と分析のみを表示します。
4. ソフトウェアの[再構築]タブ を使用して 画像を 再構築 します。メインプログラムメニューの左側から再構築するスキャンを選択します。ロードされたスキャンが画面の右側に表示されます。6 つの光音響放射波長 (700、730、760、800、850、900 nm) は、900 nm の HbO₂ 、760 nm の Hb の最大光音響信号、700 nm のメラニンを含むため、デフォルトのままにします。
   1. 右側のアイコンを使用してスキャンの再構築を実行します。プログラムのワークフローに従って、 スキャン プリセットと 視野 (解像度)を選択します。情報はメイン画面の左上隅に表示されます。音速を調整してスキャンフォーカスを調整します(補足図2)。 再構築 パネルには、取得した各スキャンのフレーム数も表示され、必要に応じて繰り返しを選択できます。
      注意: 各スキャンにはデフォルトの音速-90がロードされ、ユーザーが調整する必要があります。音速はオートフォーカス機能(AF)で自動的に調整することもできます。
5. ボタンを押します スキャンの再構築 画面の上部にある スキャンの再構築 に進みます。一時的なダッシュボードに [ジョブの処理] というメッセージが表示されます。このパネルには、 メニュー>処理ステータスからもアクセスできます。再構成が完了したら、画像の後処理解析を フルエンス補正に進む必要があります。
6. ダッシュボードメニューで再構築された画像の フルエンス補正 をアクティブにします。フルエンス補正のために、再構築された画像をロードする必要があります。これらは、各スキャン番号の横にフラグ付きで表示されます。ロードされたファイルは、すぐに画面の右側に 選択された再構築として表示されます。 フルエンス補正 を有効にするには、画面の右側にあるアイコンを操作します(補足図3)。[ フルエンスの保存]補正 を押して進行させます。
7. フルエンス補正を保存した後、取得したプリセット(Hb、HbO2、およびメラニン)のスペクトルアンミキシングを実行します。[スペクトルアンミキシング]タブを選択して、スペクトルアンミキシング用に選択した再構成のリストを開きます。選択したスタディの各スキャンのリストが、前の画像処理ステップの履歴とともに表示されます。
8. 以前に保存したフルエンス補正ファイルをロードします。ロードされたスキャンは、画面の右側に 選択した再構成 としてすぐに表示されます(補足図4)。画面の右側にあるアイコンを押して、スペクトルの混合解除をアクティブにします。
   1. 混合されていない波長を観察します。再構成ステップ(ステップ3.4)に取り込まれた6つの光音響放射波長(700、730、760、800、850、および900 nm)はすべて、スペクトルアンミキシングのために自動的に選択されます。必要に応じて、XYZアイコンを使用して、処理する目的のスペクトル(スペクトル:Hb、HbO2、メラニンなど)を編集します。
   2. 調整されたパラメータを確認したら、[スペクトルアンミキシングの開始]をクリックして、 スペクトルアンミキシング を続行します。処理メニューバーが表示され、操作の進行状況が表示されます。
      注:スペクトルアンミキシング中にさまざまなパラメータ調整が可能で、いくつかのアンミキシング方法を使用できます。このプロトコルでは、 線形回帰 法がHb、HbO₂、およびメラニンの混合を解除するための標準として使用されます。
9. [視覚化と解析] タブにアクセスします。アクティブ化されたスキャンをクリックすると、手順 1.1 で説明したすべてのサブジェクト情報とコメントが表示されます (補足図 5)。
   注意: 複数のスキャンを並行して視覚化できます。
   1. +ボタンを押して、マルチスキャン分析を作成します。このウィンドウで、マルチスキャンビューを導入し、[保存]ボタンを押します。ビュー名を保存すると、分析中のスタディのすべてのスキャンを含む新しいダッシュボードが表示されます。
   2. 保存した分析ビューに追加するスキャンをそれぞれ選択します。左上隅のアイコンにスキャンを追加すると、分析ビューに自動的に表示されます。
10. 解析ビュー内で、適切なカラー ルックアップ テーブルを設定して、解析用の画像を準備します。上部のメニューバーの[ その他の画像制御オプション ]をクリックし、[ 最大強度投影 ]アイコンをアクティブにします。2D +画像表示の横にある画像表示の右下隅にあるアイコンを押して、レイヤーに色を属性付けします。
11. 「 その他 」を選択すると、すべてのチャンネルの色を同時に編集できます。このメニューには、混合されていないすべての発色団が表示され、表示する複数のレイヤーを選択できます。
    メモ: ソフトウェアアイコンの上にマウスを移動すると、プロトコルに表示されているように名前が灰色で表示されます。
12. 画面の左下にあるツールを使用して、各レイヤーの色の強度を調整します。
    注:各チャンネルの最小/最大補間による調整は、通常、良好な結果をもたらします。

第4章 関心領域(ROI)分析

注:データ分析には、関心領域(ROI)の選択が必須です。

1. 分析するROIを特定します。XZ軸とYZ軸で使用可能な直交ビュー内で同じROIをトレースしながら、XY画像で使用可能な形状(メニューバー内)でROIを囲みます(補足図6)。
   注: 現在の ROI 分析にはポリゴン形状が使用されました。
   1. 残りのXZ軸とYZ軸( 図2の例)のROI形状に従い、[ 内挿の追加]および[サブ領域の削除 ]機能を使用して複数のポリゴンレイヤーを配置します。データは、目的のROIを定義/選択した後にプロットできます。
   2. 関心 領域のインポートアイコンを押して定量化し 、選択したROIのグラフィカルな詳細として画面の右側に表示されるマルチスペクトル成分を観察します。
   3. ROIデータのグラフィカルビューの下部にある Excel アイコンを押して、ROIデータをエクスポートします。すべてのリージョンのデータパッケージ全体が、後続の分析のためにバンドルとしてスプレッドシートにエクスポートされます。 図3 は、200 mmHgに膨らませた圧力カフを提出し、血管系を0 mmHgでの血管系安静状態と比較して分析した1人の参加者からのデータを示しています。
2. 手順4.1〜4.1.3に従って、複数のROIオブジェクトを同時に定量化します。
3. TIFFファイルと同じメニューから、すべての埋め込みデータと組み込みのROIアウトラインを含む画像をエクスポートします(図2)。

結果

光音響イメージングによって提供されるデータは、後処理されたエクスポート画像(図2)およびプロットされたデータ(図3)で分析できます。ここでの目的は、光音響機能イメージングの操作を紹介し、より一般的に知られている血管研究におけるその応用を探求することでした。そのために、安静時と主要供給動脈の200 mmHg閉塞後に取得した画像を比較しました(図2)。これらの観察結果は、ROI分析とエクスポート後に定量化できます。XY平面では、平面YZおよびXZと比較してメラニンのより高いシグナルが観察されることができ、これは表皮限界を示す。上腕動脈(腕)の閉塞は、OTプローブ配置(腹側前腕)の前に血管にいくらかのうっ滞を引き起こします。その結果、XY、YZ、XZ軸で青(Hb)と赤(HbO2)の増加として示される全体的な信号の増加を検出しました。カフ内で200 mmHgの圧力を保持しながら、XY平面で停滞をたどることができます。YZ軸とXZ軸は、マゼンタ色の...

ディスカッション

このプロトコルは、3Dカッププローブの安定化に必要な適切な位置決め(参加者、プローブ)から画像取得、ROI選択、画像の再構成と分析まで、この新しい光音響イメージング機器を操作するための実用的な要件と見なされる作業手順を強調しています。

提案された実験的アプローチは、動的条件下で得られた画像と一緒に「瞬間的な」取得を使用して、in vivoヒト血管生理学にアクセスする上でのこの機器の関心と有用性を示しています。図示されているように、最大15mm3の体積で収集された150μmの音響画像解像度は、他の断層撮影技術には匹敵しません。

(i)画像取得のためのプローブ安定化の重要性については、特別な注意が必要です。柔軟で安全なプローブホルダーを使用することで、画像取得が明らかに向上します。(ii)血管構造の正しい識別。表皮-真皮移行におけるメラニンなどの超音波検査の参照は、皮膚の上部神経叢血管を識別するためのマーカーとして使用される可能性があります。(iii)メーカーの再構成ソフトウェアを介して実行...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
カフ	PIC	107001
ドレープ	Pajunk	021151-1501
タノール70%	Sigma Aldrich	EX0281
Gogless	Univet	559G.00.00.201
Kimwipes	Amoos	5601856202331.00
MSOT	iThera	MSOTAcuity
安定化アーム	ITEM		自己設計し、
超音波ゲル	カー研究所	308
ワックスクリーム	Veet	kkdg08hagd