昆虫病原性線虫の培養と遺伝子操作

サマリー

昆虫病原性線虫は細菌と共生して生きており、一緒になって自然免疫系を損なうことによって昆虫に感染することに成功しています。線虫感染の遺伝的基盤に関する研究を促進するために、昆虫病原性線虫を維持し、遺伝的に操作する方法が記載されている。

要約

ヘテロラブディティス属およびSteinernma属の昆虫病原性線虫は、土壌に生息する昆虫の義務性寄生虫である。それらのライフサイクルの主な特徴は、それぞれ細菌PhotorhabdusおよびXenorhabdusとの相互主義的な関連である。線虫寄生虫は、適切な昆虫宿主を見つけて侵入し、昆虫の免疫応答を覆し、効率的に増殖して、感染する新しい昆虫の獲物を積極的に狩る次世代を作り出すことができる。そのライフサイクルの特性のために、昆虫病原性線虫は、破壊的な農業害虫を防除するために殺虫剤と組み合わせて使用される一般的な生物学的防除剤である。同時に、これらの寄生性線虫は、線虫病原性および宿主抗線虫応答を分析するための研究ツールを表す。この研究は、感染中の線虫分泌分子の役割を理解するための遺伝学的技術およびトランスクリプトーム的アプローチの最近の開発によって支援されている。ここでは、昆虫病原性線虫の維持および遺伝子ノックダウン手順の使用に関する詳細なプロトコルが提供される。これらの方法論は、昆虫病原性線虫感染因子の機能的特徴付けをさらに促進する。

概要

昆虫病原性線虫(EPN)に関する研究は、主に統合された害虫管理戦略におけるこれらの寄生虫の有用性と基本的な生物医学研究への関与のために、過去数年間で強化されています^1,2。最近の研究では、感染プロセスのさまざまな段階で活性化される線虫の遺伝的成分を調べるためのモデル生物としてEPNが確立されています。この情報は、宿主の生理機能を変え、昆虫の自然免疫応答を不安定化させるために寄生虫によって分泌される分子の性質と数に関する重要な手がかりを提供します^3,4。同時に、この知識は、昆虫宿主免疫シグナル伝達経路の種類と、病原体の侵入と拡散を制限するために調節する機能に関する新しい詳細によって一般的に補完される^5,6。これらのプロセスを理解することは、EPNとその昆虫宿主との間の動的相互作用の両側を想像するために不可欠です。EPNと昆虫の宿主関係をよりよく理解することは、間違いなく哺乳類寄生線虫との同様の研究を促進し、ヒト免疫系を妨げる感染因子の同定および特徴付けにつながる可能性がある。

EPN線虫ヘテロラブディティス属およ....

プロトコル

1. 共生線虫感染性幼体の産生

1. ペトリ皿(10cm)をろ紙で覆い、約10〜15匹の ガレリアメロネラ 幼虫を追加します(図1A)。
2. ピペットを用いて、懸濁液10μLあたり約25〜50IJを含む2mLの水をワックスワーム上に分注する。ペトリ皿を室温でキャビネットに保管してください。
3. ろ紙の水分に応じて、2日ごとに1〜2mLの水を加える。IJに感染したワックスワームは、通常、48時間以内に死亡する。
4. ワックスワームが^IJs8 に感染してから約10日後にホワイトのウォータートラップを準備します(図1B、C)。死んだ昆虫を濾紙の浸されていない部分に慎重に移す。水道水を使用して底のペトリ皿を満たし、換気用のスペーサーとして15mLチューブのキャップを置きます。
5. 柔らかく壊れやすいワックスワームは、プラスチック製の鉗子を使用してろ紙からゆっくりと持ち上げて慎重に移します。脱塩水や脱イオン水の代わりに水道水を使用してください。後者は線虫凝集を引き起こす。
   1. ウォータートラップ内の水位がペトリ皿の高さの約半分に達していることを確認します。部屋の温度や湿度条件によって水位が経時的に変化す....

結果

軸索化を経た H.バクテリオフォラ 線虫の状態を評価するために、IJsにおける P.ルミネッセンス 細菌コロニーの有無を決定した。これを行うために、以前に表面滅菌され、PBS中で均質化された約500のIJのペレットが収集された。陽性対照処置は、共生 P.ルミネッセンス 細菌を含む線虫培養物からの約500個のIJのペレットから成っていた。軸索化線虫および陽性対照線虫のペレットを1x PBS中でホモジナイズした。ホモジネートを寒天上にピペットで処理し、個々のコロニーの成長を促進するために広げた。寒天プレートを28°Cで24時間インキュベートした。翌日、 P.ルミネッセンス コロニー(CFU)の発生は観察されなかった。予想通り、ストック培養 物からのH.バクテリオフォラは 共生 P.ルミネセセン細胞 を運んだ。しかし、関連する P. luminecens 属細菌を欠いた線虫は軸索性であり、将来の実験のために別々に保存された(図6)。

ディスカッション

昆虫病原性線虫感染および昆虫抗線虫免疫の分子基盤を理解するには、相互に関連する細菌から寄生虫を分離することが必要である¹³、^15、16。昆虫病原性線虫H.バクテリオフォラおよびS.カルポカプセは、それぞれグラム陰性菌P.ルミネッセンスおよびX.線虫と共に生息する¹⁷。両方の細菌種は、昆虫組織を標的とし、感染中の自然免疫系に対抗することによって病原性を付与する因子をコードすることが以前に示されている^18,19。これは、線虫が昆虫宿主と相互作用するように進化した戦略を特定する努力を妨げる。したがって、感染プロセスにも関与する線虫成分の遺伝子ノックダウンによる同定および機能的特徴付けは、軸索虫の発生によって促進され得る。ここ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガロー	VWR	97062-244
アンビオン メガスクリプト T7 キット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	AM1333
アンピシリン	フィッシャーサイエンティフィック	611770250
細胞培養フラスコ T25	フィッシャーサイエンティフィ	156367
細胞培養フラスコ T75	フィッシャーサイエンティフィック	156499
チョイスTaq マスターミックス	デンビルサイエンティフィック	C775Y42
コーンオイル	VWR	470200-112
シロップ	MPバイオメディカル/ VWR	IC10141301
培養チューブ10mL	ッシャーサイエンティフィック	14-959-14
ッペンドルフフェムトチップスマイクロローダーチップ	エッペンドルフ	E5242956003
エタノール	ミリポアシグマ	E7023
ファルコンチューブ 50 mL	フィッシャー・サイエンティフィ	14-432-22
フェムトジェット マイクロインジェクター	エッペンドルフ	5252000021
フィルターペーパー	VWR	28320-100
ガレリア・メロネラ・ワックス ペ	トコ	ガラス
カバースリップ	ッシャー・サイエンティフィック	12-553-464	50 x 24 mm
ハロカーボンオイル 700	シグマ	H8898
種ループ	VWR12000-806
カナマイシン	VWR97062-956
クウィックフィルホウケイ酸ガラス毛細血管	ワールド精密機器	1B100F-3	1.0
mm LB寒天	フィッシャーサイエンティフィック	BP1425-500	LB寒天ミラー粉末500
g LBブロ	スフィッシャーサイエンティフィック	BP1426-500	LB ブロス ミラー パウダー 500 g
ライカ DM IRB 倒立研究用顕微鏡	顕微鏡 セントラル
マッコンキー ミディアム	ミリポア シグマ	M7408-250G
MEGAclear 転写クリーンアップ キット	サーモフィッシャー サイエンティフィック	AM1908
マイクロ遠心チューブ	VWR	76332-064	1.5 ml
NanoDrop 2000分光光度計	サーモフィッシャーサイエンティフィック	ND-2000
ニードルシリンジ	VWR	BD305155	22G
栄養ブロス	ミリポアシグマ	70122-100G
パラフィルム	VWR	52858-076
仕切られたペトリ皿	VWR	490005-212
PBS	VWR	97062-732	バッファー PBS 錠剤バイオテクノロジーグレード 200タブ
PCRプライマー	アゼンタ	・
ペストル	ミリポア・シグマ	BAF199230001	ベルアート 使い捨てペストル
ペトリ皿 6cm	VWR	25384-092	60 x 15 mm
ペトリ皿 10 mm	VWR	10799-192	35 x 10 mm
プロテオース・ペプトン #3	サーモフィッシャーサイエンティフィック	211693
酵母抽出	ミリポアシグマ	Y1625

ス ック コーンフィエック フィ接物