Method Article

マイクロフルイディクスと蛍光顕微鏡を使用して、単一アクチンフィラメントおよびバンドルのアセンブリダイナミクスを研究する

DOI:

10.3791/63891

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May 5th, 2022

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1Université Paris Cité, CNRS, Institut Jacques Monod

In This Article

Summary

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我々は、蛍光顕微鏡法と組み合わせて、個々のアクチンフィラメントをリアルタイムで正確に監視しながら、異なるタンパク質溶液に順次曝露することを可能にする、単純なアクチンフィラメントマイクロ流体アッセイのプロトコルを提示する。

Abstract

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アクチンフィラメントの組み立てと分解を調節する複雑な分子メカニズムを解読するために、よく制御された条件下で個々の反応を監視することは大きな資産です。そのために、過去20年間に全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いた生きたシングルフィラメント実験が登場し、重要な結果をもたらしました。2011年には、これらの実験の可能性をさらに広げ、繰り返し発生する問題のあるアーティファクトを回避するために、これらのアッセイに単純なマイクロフルイディクスを導入しました。この研究は、個々のアクチンフィラメントが不動態化されたカバースリップ表面に一端で固定され、流れに整列し、異なるタンパク質溶液に連続的に曝露され得るという、我々の基本的なプロトコルを詳述する。また、特定のアプリケーション向けのプロトコルを提示し、流れる溶液の粘性抗力のおかげで、制御された機械的力を適用する方法について説明します。我々は、これらの実験の技術的注意点を強調し、この技術に基づいて可能な開発を簡単に提示する。これらのプロトコルと説明は、使いやすいマイクロフルイディクス装置の今日の可用性とともに、非専門家がラボでこのアッセイを実施できるはずです。

Introduction

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アクチンフィラメントおよびアクチンフィラメントネットワークの組み立ておよび分解は、いくつかの生化学反応によって制御され、機械的文脈に依存する。これらの複雑なメカニズムについての洞察を得るためには、個々のフィラメント上の個々の反応を(十分に多数で)観察できることは非常に貴重です。過去数十年にわたり、主に全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡法を用いた動的アクチンフィラメントのリアルタイム観察は、重要な技術として浮上し、バルク溶液生化学的アッセイ1では得られなかった結果の印象的なリストを提供してきました。

これを達成するには、蛍光標識されたアクチンフィラメントを顕微鏡カバースリップの表面近くに維持し、蛍光標識も可能なアクチン結合タンパク質(ABP)の溶液にさらす必要があります。そうすることで、適切に制御された生化学的条件下で個々のフィラメントで起こっている事象を監視し、反応速度を定量化する手段が提供されます。ただし、いくつかの特定の制限を考慮する必要があります。フィラメントを表面近くに人為的に維持することは、しばしば複数のアンカーポイントのおかげで、またはメチルセルロースなどのクラウディング剤を使用することによって、それらの挙動を変えることができる(例えば、それらの重合および解重合の一時停止を引き起こす2)。各フィラメントの輪郭を追跡することは、特に新しいフィラメントまたはフィラメントの断片....

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Protocol

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1. マイクロ流体チャンバー調製

  1. 複数のチャンバーパターンを持つSU-8マスターモールドを選択します。典型的なチャンバは、高さ20μm、幅800μmの3つの入口と1つの出口を備えた十字型です(図1)。このようなマスターモールドは、外部企業から購入することも、学術研究所で製造することもできます(例えば、Gicquel、Y. et al.5)。
  2. 金型の端にテープを貼ります。
    1. 長さ約50 cm、幅19 mmの標準的な透明なオフィステープ( 材料表を参照)をベンチに置き、粘着性のある面を上にします。金型を一端に垂直に置き、テープの正中線に沿って配置します。
    2. 金型をテープのもう一方の端までロールして、金型の周りに 1 cm の境界線を作成します。テープを金型の底に折り重ねます。
  3. ポリジメチルシロキサン(PDMS)溶液を調製する。
    1. 使い捨ての計量皿に、25〜30gのPDMSベース(材料表)を直接注ぎます。使い捨てプラスチックパスツールピペットで10%重量/重量PDMS硬化剤(材料表)を追加します。
    2. プラスチックスティックで手作業で徹底的に混ぜる....

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Results

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上記のすべての実験において、蛍光標識されたアクチンフィラメントは、表面からのバックグラウンド蛍光が低いことを示す良好なコントラストで、はっきりと見えるはずです(図4、一般的な問題のトラブルシューティングについては、 補足ファイル1 を参照してください)。アクチンフィラメントはまた、表面にくっついてはならない:支配的な流速が低いとき、アクチンフィラメントの横方向の揺らぎは、それらが生きているのを観察するときに知覚可能でなければならず、それらがそれらの端の1つだけによって固定されていることを明確に決定することを可能にする。同様に、TIRFイメージングを使用する場合、それらの垂直変動は、その長さおよび時間に沿った強度の変化によって見えるべきである。適用される流量に応じて、TIRFによって取得されたアクチンフィラメントの画質を最適化するために、TIRF浸透深さを調整する必要があるかもしれません。

フィラメントを重合条件にさらす場合(セクション8を参照)、フィラメントの伸びは規則的であるべきである(.......

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Discussion

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アクチンフィラメントが長さに沿って複数の点によって表面に固定されるか、またはメチルセルロースなどのクラウディング剤によって表面の近くに維持される標準的なシングルフィラメント法と比較して、マイクロフルイディクスは多くの利点を提供する。表面との相互作用は最小限であるため、これらの相互作用が伸長および解重合の両方の間に誘発し得る人工的な一時停止は回避される。フィラメントは流れによって互いに平行に整列され、それらの監視と長さの測定が容易になります。フィラメントの周りの溶液は常に更新され、一定のタンパク質濃度にさらされます。フィラメントが露出している異なるタンパク質溶液を迅速に(<1秒、 図3D、E)切り替えることができるため、速度論的研究に役立つことが多い時間制御された逐次実験を実行できます。最後に、フィラメント上の流動溶液によって加えられる粘性抗力を利用して、フィラメントに制御された機械的応力を加えることができる(「代表的な結果」セクション)。適度な流体の流れ(Mid Flow 圧力設定)は、フィラメントを表面(〜2.......

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Disclosures

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著者は利益相反がないと宣言しています。

Acknowledgements

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B.ラドゥーとR.-M.に感謝しています。彼らのUVクリーナー装置の使用のためのMègeラボ、およびJ. Heuvinghと0。デュ・ルーレは、シリコンウェーハ上の金型の準備とマイクロ流体学のヒントの提供について受けた初期トレーニングを受けました。我々は、欧州研究評議会グラントStG-679116(A.J.へ)及びAgence Nationale de la Recherche Grants Muscactin and Conformin(G.R.-L.)からの資金提供を認める。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
β-カゼインメルクC6905mg/mL で使用
生検パンチ (プランジャー付き)テッド ペラ15115-2ID 0.75 mm、OD 1.07 mm
ビオチン-BSAメルクA85491 mg/mL
で使用 BSAメルクA802250 mg/mL で使用
カバースリップ ミニラック
テフロンホルダー		InvitrogenC14784for 8カバースリップ
カバースリップ 22x40mm
厚さ #1.5		Menzel Gläser631-1370
DABCOメルクD27802fバッファー中の
DTTEuromedexEU0006-Dコンポーネント f-バッファー
Ester NHS Alexa Fluor 488InvitrogenA20000Lys328 のアクチン標識用フルオロフォア。
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo Scientific21338To biotinylate actin on Lys328
Hellmanex IIIHellma9-307-011-4-507ガラス洗浄洗剤
ImageJNIHN/Aオープンソースソフトウェア
LaboportKNF811kn.18真空ポンプ (到達真空: 240 mbar)
マジック インビジブル テープスコッチ7100024666標準透明オフィステープ
MicrewtubeSimportT341-6T2 mLマイクロ流体リザーバーチューブマイクロ
流体デバイス パート1:フローユニットSFluigentFLU-S-D-PCKB流量計
マイクロ流体デバイス パート2:Fluiwell-4C-2 mLFluigent14002001PCKリザーバーホルダー
マイクロ流体デバイス パート3:MFCS-EZフルイジェントEZ-11000001
EZ-00345001		圧力コントローラー
Model 42 - UVO-CleanerJelight Inc.42-220紫外線クリーナー
N6-(6-アミノヘキシル)-ATP-ATTO-488イエナバイオサイエンスNU-805-488の標識に使用される ATP-ATTO アクチン
ニュートラアビジンThermo Scientific31000
PLL-PEGSuSoSPLL(20)-g[3.5]- PEG(2)PBSで1 mg / mLで使用します。
ポリジメチルシロキサン(PDMS)シルガード184シリコンエラストマーダウコーニング1673921PDMSベースと硬化剤ポリ
エーテルエーテルケトン(PEEK)チューブメルクZ226661」ブルー": I.D. = 0.25 mm
安全ブローガンコイルホース 空気圧700-Sフィルター付きエア
シリコンチューブVWR228-0701PPEEKをカプラーに接続
ステンレス製カテーテルカプラーPrime BioscienceSC22/15PDMSの入口と出口に挿入してPEEKチューブに接続
熱可塑性フィルムSigma AldrichPM996標準「パラフィルム」
超高純度エタノールVWR64-17-5
超音波洗浄バスVWRUSC200TH1 L ビーカーを収容
真空デシケーターSP Bel-ArtF42022-0000PDMS または溶液を脱気します
8 アクチンニュートラアビジンの標識に使用 が含まれています

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119(2022).
  2. Kuhn, J. R., Pollard, T. D.

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