マイクロフルイディクスと蛍光顕微鏡を使用して、単一アクチンフィラメントおよびバンドルのアセンブリダイナミクスを研究する

Summary

我々は、蛍光顕微鏡法と組み合わせて、個々のアクチンフィラメントをリアルタイムで正確に監視しながら、異なるタンパク質溶液に順次曝露することを可能にする、単純なアクチンフィラメントマイクロ流体アッセイのプロトコルを提示する。

Abstract

アクチンフィラメントの組み立てと分解を調節する複雑な分子メカニズムを解読するために、よく制御された条件下で個々の反応を監視することは大きな資産です。そのために、過去20年間に全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いた生きたシングルフィラメント実験が登場し、重要な結果をもたらしました。2011年には、これらの実験の可能性をさらに広げ、繰り返し発生する問題のあるアーティファクトを回避するために、これらのアッセイに単純なマイクロフルイディクスを導入しました。この研究は、個々のアクチンフィラメントが不動態化されたカバースリップ表面に一端で固定され、流れに整列し、異なるタンパク質溶液に連続的に曝露され得るという、我々の基本的なプロトコルを詳述する。また、特定のアプリケーション向けのプロトコルを提示し、流れる溶液の粘性抗力のおかげで、制御された機械的力を適用する方法について説明します。我々は、これらの実験の技術的注意点を強調し、この技術に基づいて可能な開発を簡単に提示する。これらのプロトコルと説明は、使いやすいマイクロフルイディクス装置の今日の可用性とともに、非専門家がラボでこのアッセイを実施できるはずです。

Introduction

アクチンフィラメントおよびアクチンフィラメントネットワークの組み立ておよび分解は、いくつかの生化学反応によって制御され、機械的文脈に依存する。これらの複雑なメカニズムについての洞察を得るためには、個々のフィラメント上の個々の反応を(十分に多数で)観察できることは非常に貴重です。過去数十年にわたり、主に全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡法を用いた動的アクチンフィラメントのリアルタイム観察は、重要な技術として浮上し、バルク溶液生化学的アッセイ¹では得られなかった結果の印象的なリストを提供してきました。

これを達成するには、蛍光標識されたアクチンフィラメントを顕微鏡カバースリップの表面近くに維持し、蛍光標識も可能なアクチン結合タンパク質(ABP)の溶液にさらす必要があります。そうすることで、適切に制御された生化学的条件下で個々のフィラメントで起こっている事象を監視し、反応速度を定量化する手段が提供されます。ただし、いくつかの特定の制限を考慮する必要があります。フィラメントを表面近くに人為的に維持することは、しばしば複数のアンカーポイントのおかげで、またはメチルセルロースなどのクラウディング剤を使用することによって、それらの挙動を変えることができる(例えば、それらの重合および解重合の一時停止を引き起こす²)。各フィラメントの輪郭を追跡することは、特に新しいフィラメントまたはフィラメントの断片が時間の経過とともに視野に蓄積する場合、困難な場合があります。反応は有限の体積で起こり、アクチンモノマーおよびABPの濃度は時間の経過とともに変化する可能性があり、正確な速度定数を導出することが困難になる可能性があります。最後に、ABPの溶液を更新または変更することは、30秒未満で達成することは困難であり、しばしばサンプル中の不均一なタンパク質含有量につながる。

10年以上前、個々のデオキシリボ核酸(DNA)鎖³を研究するためにすでに行われたことに触発されて、個々のアクチンフィラメント⁴を観察および操作するためのマイクロフルイディクスに基づく新しい技術を導入しました。これにより、古典的なシングルフィラメント技術の前述の制限を回避することができます。これらのマイクロフルイディクスアッセイでは、アクチンフィラメントは、カバースリップに吸着されたスペクトリンアクチン種子から成長させる。したがって、フィラメントは、マイクロ流体チャンバの底部にのみ一端によって固定され、固着することなく表面上で変動する。フィラメントは入ってくる溶液の流れと整合するため、輪郭の長さの監視が容易になり、TIRFを使用できるカバースリップの上の浅い領域に維持されます。異なる溶液は混合することなく同時にチャンバに流され、フィラメントは逐次的かつ迅速にそれらに曝され得る。

ここでは、ラボでシングルアクチンフィラメントマイクロフルイディクスアッセイを設定するための一連の基本的なプロトコルを提案します。カバースリップとマイクロフルイディクスチャンバーは事前に(半日で)準備することができ、いくつかの生化学的条件をテストできる実験自体は1日未満で行われます。

Protocol

1. マイクロ流体チャンバー調製

1. 複数のチャンバーパターンを持つSU-8マスターモールドを選択します。典型的なチャンバは、高さ20μm、幅800μmの3つの入口と1つの出口を備えた十字型です(図1)。このようなマスターモールドは、外部企業から購入することも、学術研究所で製造することもできます(例えば、Gicquel、Y. et ^al.5)。
2. 金型の端にテープを貼ります。
   1. 長さ約50 cm、幅19 mmの標準的な透明なオフィステープ( 材料表を参照)をベンチに置き、粘着性のある面を上にします。金型を一端に垂直に置き、テープの正中線に沿って配置します。
   2. 金型をテープのもう一方の端までロールして、金型の周りに 1 cm の境界線を作成します。テープを金型の底に折り重ねます。
3. ポリジメチルシロキサン(PDMS)溶液を調製する。
   1. 使い捨ての計量皿に、25〜30gのPDMSベース(材料表)を直接注ぎます。使い捨てプラスチックパスツールピペットで10%重量/重量PDMS硬化剤(材料表)を追加します。
   2. プラスチックスティックで手作業で徹底的に混ぜる。硬化剤がPDMSベースによく組み込まれていることを確認してください、たとえ攪拌が多くの気泡を作り出したとしても。
4. PDMS溶液を真空デシケータ(材料表)中で室温(RT)で少なくとも5分間脱気します。気泡は膨張し、表面に上昇し、真空が破られると破裂します。
5. PDMS溶液をSU-8金型に注ぎます。プラスチックスティックを使用して、できるだけ多くの混合物をこすり取って移します。
6. PDMSを2回目(真空デシケーターで5分間)脱気します。ほとんどの泡を取り除くようにしてください(上面にあるいくつかの小さな泡は問題ありません)。
7. 金型を70°Cのオーブンに少なくとも5時間置き、PDMSが網目状に凝固します。
8. 固体PDMSチャンバを金型から取り外します。
   警告: SU-8 金型用のシリコンウェーハは非常に壊れやすいため、PDMS をウェーハから分離する際には細心の注意が必要です。硬くて平らな表面で作業し、ウェーハを表面上で平らに保ちます。
   1. カミソリの刃で、金型の端から約1cm離れたPDMSに円形の切り込みを入れます。すべてのパターンは、カットの内側に少なくとも0.5cmでなければなりません。中央のPDMSブロックを緩やかな牽引で静かに剥がします。
      警告: SU-8 金型をはがすときは、破損しないように、SU-8 金型をベンチトップに平らに保ってください。
   2. PDMSをアルミ箔に面した成形面であるきれいなアルミ箔の上に置き、その表面をほこりから保護し、パターンをより目立たせます。
9. パターンから少なくとも0.5cm離れたカミソリの刃でチャンバーを選択して切断します。結果として得られるPDMSブロックは、高さ約0.5cm、幅1.5cm、長さ3cmである。3つの入口と1つの出口を生検パンチで突き刺し、内径0.75mm(材料表)。
10. PDMSチャンバを超高純度エタノール(材料表)で洗浄し、安全ブローガン(材料表)を使用して空気乾燥します。パターンを上に向けたPDMSを清潔なペトリ皿に入れ、蓋をして皿を閉じます。

2. ガラスカバースリップクリーニング

注:ここでは、一連の超音波処理ステップに基づく標準的なカバースリップクリーニング手順が詳述されています。他のガラスカバースリップ洗浄手順は、同様の満足のいく結果を達成することができる他の多くの刊行物^{に記載されている6}、^7、8、9。

1. 10 ~ 20 枚のカバースリップ (長さ 40 mm) をポリテトラフルオロエチレン (PTFE) ホルダーに置きます (材料表)。カバースリップを0.5 Lの2%ガラス洗浄液(材料表)に1 Lガラスビーカー(35°C、30分)で超音波処理します。
2. ガラス洗浄液を処分し、カバースリップを少なくとも3つの連続した0.5L浴中でdH2Oで広範囲にすすいでください。
3. 1 Lのガラスビーカーに0.5 Lの2 M KOHを準備します。カバースリップをKOH(RT、30分)で超音波処理します。KOHを処分し、カバースリップを少なくとも3つの0.5L浴でdH2Oですすいでください。
   警告: 適切なラボ用安全保護装置(手袋、メガネ、およびラボコート)を使用してください。
4. カバースリップを0.5Lの超高純度エタノール(RT、30分)に移して超音波処理する。カバースリップは、エタノール中に最大2週間保管することができます。ビーカーを熱可塑性フィルム(材料表)で閉じて、蒸発を防ぎます。使用前に、カバースリップを空気の流れで乾かしてください。

3. PDMSチャンバーアセンブリ

1. ホットプレートを100°Cに予熱する。 洗浄されたPDMSチャンバーとガラスカバースリップを最大3つまで清潔なペトリ皿に入れます。開いたシャーレを深紫外線(UV)クリーナー(λ=185nm、 材料表参照)に入れ、UV光に3〜5分間さらします。
   メモ:PDMSチャンバとカバースリップは、空気または酸素プラズマに30秒間さらすことができます。
2. PDMSチャンバーをカバースリップの上にそっと置きます。接触している 2 つの表面が UV に直接さらされていることを確認します。PDMSは自動的にガラスにくっつき、チャンバがはっきりと見えるようになります。
3. PDMSカバースリップ界面に閉じ込められた空気を取り除くには、表面を指で非常に穏やかに押します。より強固な接合を行うには、角と側面をより強く押します。チャンバーの天井がガラス表面に接触していないことを確認してください。
4. ガラス底部をホットプレートに向け、100°Cで5分間チャンバーを置きます。このステップの後、ガラス-PDMS結合は永久的になり、チャンバは一度しか使用できません。チャンバーをすぐに使用するか、清潔なペトリ皿に最大1週間保管してください。

4. [オプション] 直接パッシベーションと関数化

注:用途に応じて、チャンバは、マイクロ流体制御装置( 材料表を参照)に一度接続するか、マイクロ流体装置に接続する前にピペットを使用してチャンバに直接溶液を手動で注入することによって、不動態化および機能化することができます。後者は、より少ない試薬を消費し、マイクロ流体デバイスのポリエーテルエーテルケトン(PEEK)チューブを通して溶液を流すことによって潜在的な汚染を回避するという利点を提供する。以下のすべてのステップにおいて、溶液は、ピペットチップを出口に直接突き刺すことによって注入される。チャンバ内に気泡が出ないようにするには、PDMSチャンバの出口にチップを差し込むときに、ピペットチップから小さな液滴が突き出ていることを確認してください。同様に、ボリューム全体を注入する前にピペットチップを取り外します。

1. 20 μL の PLL-PEG (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に 1 mg/mL) を注入します。RTで最低1時間(または一晩)インキュベートします。蒸発を防ぐために、PDMSチャンバを湿気の多いボックス(例えば、下部コンパートメントに水を入れた空のチップボックス、および先端保持プラットフォーム上のPDMSチャンバ)に入れます。
2. 20 μLの100 pMスペクトリンアクチン種子を注入する(Fバッファー中、 表1 および 表2を参照のこと)。1分以内にお待ちください。種子の濃度とタイミングを調整して、種子の表面密度を、大きな統計情報には十分高く、フィラメントが重ならないように十分に低く調整します。
   注:または、スペクトリンアクチン種子が入手できない場合は、ストレプトアビジンコーティングされたカバースリップ^9,10に固定化されるビオチン官能化ショートフィラメントセグメントを使用してください。
3. [オプション]20 μLの5%ウシ血清アルブミン(BSA)をFバッファーに注入する。RTで10分間放置します。
4. [オプション]Fバッファーに1 mg/mLのβカゼイン20 μLを注入する。RTで10分間放置します。
   メモ: 手順 4.3 および/または 4.4 に従って、チャンバーをさらに不動態化します。パッシベーションの選択は、使用されるタンパク質に依存し、すべてのABPで等しくうまく機能するわけではない。アクチンを単独で使用する場合、PLL−PEGまたはBSAで十分である。

5. マイクロ流体デバイスの接続

メモ:マイクロ流体チャンバ内の流れを制御するには、最大4つのチャネルを備えた圧力ベースのマイクロ流体システムを使用します(図1A、 材料表を参照)。マイクロ流体チューブ内で気泡が形成され、流れの安定性を乱すのを避けるために、すべての溶液を脱気します。5 mL の dH₂0 および 10 mL の F バッファーストックを真空ポンプ (究極の真空<250 mbar) に接続された真空デシケータに入れ、RT で少なくとも 1 時間脱気します。

1. 入口 + 出口チューブを dH₂O (500 μL、300 mbar) ですすいでください。
2. すべての 2 mL リザーバーチューブ( 材料表を参照)に 300 μL の F バッファーを満たします。圧力を300 mbarに設定し、5〜8滴を無駄にします。チャンネルごとに繰り返し、圧力を0に設定します。
3. コンセントを接続し、チャンバーを広範囲にすすいでください。
   1. 貯留管4(流出口)の圧力を50mbarに設定する。チューブの端から液滴が出たら、チューブをPDMSチャンバの出口に接続します。液体はチャンバ内に充填され、すべての入口から出てくる。
   2. [オプション]チャンバーが直接不動態化されている場合(セクション4)、圧力を100 mbarに設定して、チャンバーを50〜100 μLのFバッファーですすぎます(3〜5分)。洗浄組織で入口の余分な液体を取り除きます。
   3. 圧力を 20 mbar に設定します。
4. インレットを接続します。
   1. リザーバ管1の圧力を50mbarに設定する。気泡が入らないようにするには、チューブとPDMS入口から液滴が出ていることを確認してください。
   2. チューブをインレット 1 に接続します(接続時に 2 つの液滴が合流します)。圧力を 30 mbar に設定します。
   3. 手順 5.4.1 ~ 5.4.2 を繰り返して、インレット 2 と 3 を接続します。
5. すべての入口の圧力を 20 mbar に設定し、出口の圧力を 0 mbar に設定します。入口の流量がほぼ同じであることを確認します(トラブルシューティングのセクションを参照)。

図1:マイクロ流体チャンバを通して溶液を注入する(A)単一アクチンフィラメント実験のための標準的なマイクロ流体セットアップ。リザーバ1〜3に入れられたタンパク質溶液は、気相の圧力を調整することによってチャンバ内に押し込まれる。生成された流量は、流量計によって測定されます。マイクロ流体チャンバ内では、加えられた相対圧力(ここでは、すべての入口に等しい圧力)に応じて、溶液が混合して空間を占有しない。典型的な寸法:リザーバチューブには最大2mLの溶液が含まれています。PEEKチューブ(内径0.25 mm)は、リザーバを流量計(チューブの10 cm後)に接続し、次にPDMSチャンバ(さらに70 cm後)に接続します。シリコンチューブとステンレススチールチューブカプラは、PEEKチューブをPDMSインレットに接続するために使用されます。メインのマイクロ流体チャネルは高さ20〜60μm、幅約1mm、長さ1cmです。(B,C)マイクロ流体チャンバ内のフロープロファイル。(B) 流体はチャンバの高さ全体に放物線プロファイルを生成します: v(z) = 6z(h-z)R/h³w(ここで、h と w はチャンバの高さと幅、R は総流量)。下:表面固定スペクトリンアクチン種子から重合された単一のアクチンフィラメント。(C)チャンバの幅がその高さよりもかなり大きい場合、流れは、ゼロになるPDMS表面を除いて、チャンバ全体でほぼ均一である。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

6. 標準流量でのセットアップの設定

メモ:コンピュータ制御の圧力システムにより、PDMSチャンバに接続されているすべての入口/出口の圧力を簡単かつ正確に調整できるため、入出力流量を制御できます。プリセット構成は、マウスを1回クリックするだけで保存およびオン/オフを切り替えることができます。以下は推奨される構成です(特に明記されていない限り、出口圧力は0 mbarに設定されています)。これらのプリセット構成の予想流量については、 表 3 を参照してください。ここに示す圧力は、チャンバの形状とシステム構成に応じて調整する必要があります。

1. 変更: このプリセットは、1 つ以上のリザーバを変更するときに使用します。これは、気泡の導入を防ぐために、目的のチューブに穏やかな逆流を作り出します。
   1. すべての入口圧力を12 mbar、出口圧力を5 mbarに設定します(図2B)。
2. ハイフロー「すべて」:このプリセットを使用して、3つのソリューションを並列に迅速に注入します。彼らは4分以内に部屋に到着します。
   1. すべての入口圧力を 150 mbar に設定します。
3. ハイフロー 'x': このプリセットを使用して、ソリューションを迅速に注入します。それは3分以内にチャンバーに到達します(図3A-C)。
   1. 流入口 'x' 圧力を 150 mbar (~15 μL/分) に設定します。他の入口の圧力は約100 mbarに調整され、これらの入口の流量は約500 nL/minになります。
4. ミッドフロー「すべて」: このプリセットを使用してシステムを一時停止します。
   1. すべてのインレットを20 mbarに設定します(図2A)。
5. ミッドフロー 'x': このプリセットを使用して、ソリューション 'x' がメインチャンネル幅のほとんどを埋め、他の入口ソリューションをチャンネル側に制限できるようにします(図 2C,D を参照)。したがって、チャンバ内のアクチンフィラメントは、溶液「x」によってのみ課せられる生化学的条件にさらされる。
   1. インレット 'x' 圧力を 12 mbar に設定します。他の入口の圧力を設定し、それぞれの流量が〜150nL/分になるように〜9mbarに調整します。

図2:各リザーバに加えられる圧力は、マイクロ流体チャンバ内の溶液の仕切り/空間分布を制御する。(A)リザーバに等しい圧力が加わると、各溶液はチャンバの3分の1を占める。(B)貯留管(ここでは貯留槽3)を交換すると、実効圧力がゼロに低下し、逆流が生じる。(C,D)リザーバの1つに対する相対圧力を増加させると、ガラス表面を単一の溶液に曝露することができる。チャンバの中央の視野は、構成ミッドフロー1(C)とミッドフロー2(D)を交互に行うことによって、溶液1および2に順次露光することができる。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

7. ソリューション 'x' の変更

メモ:図3A-Cに示すように、溶液がリザーバ管からチャンバの主流路に流れるのに数分かかることに留意することが重要です。この最小の「デッド」時間は、チューブに含まれる液体量とチューブ内の流量プロファイルによって課せられます(図3A-C)。

1. 新しいリザーバチューブに200〜300μLの溶液を調製する。設定 を変更する ために圧力を設定します(セクション6を参照)。
2. 入口 'x' のリザーバチューブのネジを外します。チューブ内の溶液は、チャンバからフリーチューブ先端までゆっくりと逆流します。測定された流量は負になります(図2B)。
3. チューブ先端に小さな液滴が形成されたら、新しいチューブを新鮮な溶液でねじ込みます。チューブが圧力システムに正しく締め付けられると、入口の流量は正に戻ります。
4. 圧力設定を 高流量「x」に設定します。
5. マイクロ流体構成とチャンバー形状に応じて、溶液がチューブに完全に充填され、チャンバーに到達するまで3〜5分間待ちます。
6. [オプション]このプロセスに従って、経時的な蛍光の増加を測定します(図3C)。

図3:リザーバからPDMSチャンバへの溶液の遅延到着および生化学的条件の急速な変化。 (A-C)リザーバからPDMSチャンバへの溶液の到着遅延。(A)チャンバの形状、チューブの長さ、および入口で加えられた圧力に応じて、ある溶液を別の溶液に置き換えても瞬時ではありません。リザーバ管を蛍光溶液を含むものに変えた後(0分)、溶液をチューブ(0.4分)およびPDMSチャンバー(1〜2分)に徐々に充填する。150 mbar の印加圧力、80 cm の PEEK チューブ、および幅 1600 μm、高さ 20 μm の PDMS チャンバについて、指示的なタイミングが示されます。 (B)PEEKチューブ内の放物線流プロファイルは、チューブの放射状プロファイルに沿ってチャンバ内の蛍光の効果的な勾配を生成します(図1Bも参照)。 (c)溶液の遅延到着は、チャンバ内のバックグラウンド落射蛍光シグナルを時間の関数として測定することによって定量化することができる。実験条件:0.5μM 10% Alexa-568標識Gアクチンを、流量計および80cmPEEKチューブを通して150mbarで注入する。 (D,E)生化学的条件の急速な変化。 (D) 2 つの中間フロー条件における入ってくるソリューションのパターン。 (e)アクチン濃度の読み出しとしてのバックグラウンド蛍光の増加。時間t=0は、蛍光の発症が増加するにつれて設定される。溶液1:0.5μM 10%Alexa-488標識G-アクチン、溶液2:F-バッファー。(C,E)PDMSチャンバー:高さ20μm、幅1600μm。落射蛍光強度を、表面から約2μm上方に、全視野にわたってシグナルを平均化することによって定量化し、フルオロフォアの非存在下では0、最大強度では1に正規化した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

8.基本的なシングルフィラメント実験:アデノシン二リン酸(ADP)-アクチン有刺鉄末端解重合

注: このセクションは、機能化されていないチャンバーを想定しています(セクション 5 のみ)。チャンバーが直接機能化されている場合(セクション4)、ステップ8.4から開始します。

1. アクチンフィラメント種子による表面官能化:
   1. 溶液3をF緩衝液中の50pMスペクトリンアクチン種子^11の200μL に変更する(セクション7参照)。
      注:あるいは、スペクトリンアクチン種子が入手できない場合は、ストレプトアビジンコーティングされたカバースリップに固定されるビオチン官能化ショートフィラメントセグメントを使用することができます(詳細については^9,10を参照)。
   2. ハイフロー3で2分間注入します。
      注:最終的な種子密度に応じて濃度と時間を調整します。
2. 表面パッシベーション:
   1. チューブ3をFバッファー中の5%BSAを300μLで交換する。
   2. ハイフロー3で5分間注入し、続いてミッドフロー3で5分間注入します。この第2ステップでは、チャンバ表面全体がBSA不動態化されるように、チャネル1および2の圧力を7〜8mbarに下げて、対向流〜-100nL/minを得る。
      注:BSA溶液はより粘性が高いため、それに応じて圧力を調整する必要があります。
3. チューブ3をFバッファーに変更し、チャネルをすすぎます(5分、 ハイフロー3)。
4. 以下の200-300 μL溶液を調製し、すべてのタンパク質をFバッファーで希釈する:
   注入口1、重合溶液:1 μM 10%Alexa-488標識G-アクチン、1 μM プロフィリン(表1)。
   導入口2、熟成溶液:0.15 μM 10%Alexa-488標識G-アクチン。
   導入口3は、解重合液:F緩衝液のみ。
   注:プロフィリンは、自発的な核生成を防止し、G-アクチンの一定の濃度を維持するためにここで使用されます。
5. チューブ 1 を 3 に変更します (セクション 7)。 「高流量すべて」 プリセットを使用して 3 ~ 4 分間注入します。これで、3つのソリューションがPEEKチューブに充填され、チャンバに到達しました(図3A)。ガラス表面は、デッドタイムなしで任意の入口溶液にさらすことができます(<1秒、 図3D、E)。
6. 顕微鏡のスイッチを入れます。設定を設定します:10%-20%のパワーで150 mW 488 nm励起レーザー、100-200 msのカメラ露出時間、200-300 nm TIRF貫通深さ、60倍の対物レンズ。これらの設定は原稿全体を通して使用されます。
7. フィラメント重合(図4A):
   1. 圧力設定を Mid Flow 1 に設定して、約 10 分間待ちます。
   2. [オプション]レコード重合(1フレーム/ 20秒、TIRF)。フィラメントは、約10サブユニット/秒(サブ/秒)^1,12で重合するはずです。
8. フィラメントエージング:圧力設定を Mid Flow 2

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Results

上記のすべての実験において、蛍光標識されたアクチンフィラメントは、表面からのバックグラウンド蛍光が低いことを示す良好なコントラストで、はっきりと見えるはずです(図4、一般的な問題のトラブルシューティングについては、 補足ファイル1 を参照してください)。アクチンフィラメントはまた、表面にくっついてはならない:支配的な流速が低いとき、アクチンフィラメントの横方向の揺らぎは、それらが生きているのを観察するときに知覚可能でなければならず、それらがそれらの端の1つだけによって固定されていることを明確に決定することを可能にする。同様に、TIRFイメージングを使用する場合、それらの垂直変動は、その長さおよび時間に沿った強度の変化によって見えるべきである。適用される流量に応じて、TIRFによって取得されたアクチンフィラメントの画質を最適化するために、TIRF浸透深さを調整する必要があるかもしれません。

フィラメントを重合条件にさらす場合(セクション8を参照)、フィラメントの伸びは規則的であるべきである(...

Discussion

アクチンフィラメントが長さに沿って複数の点によって表面に固定されるか、またはメチルセルロースなどのクラウディング剤によって表面の近くに維持される標準的なシングルフィラメント法と比較して、マイクロフルイディクスは多くの利点を提供する。表面との相互作用は最小限であるため、これらの相互作用が伸長および解重合の両方の間に誘発し得る人工的な一時停止は回避される。フィラメントは流れによって互いに平行に整列され、それらの監視と長さの測定が容易になります。フィラメントの周りの溶液は常に更新され、一定のタンパク質濃度にさらされます。フィラメントが露出している異なるタンパク質溶液を迅速に(<1秒、 図3D、E)切り替えることができるため、速度論的研究に役立つことが多い時間制御された逐次実験を実行できます。最後に、フィラメント上の流動溶液によって加えられる粘性抗力を利用して、フィラメントに制御された機械的応力を加えることができる(「代表的な結果」セクション)。適度な流体の流れ(Mid Flow 圧力設定)は、フィラメントを表面(〜2...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-カゼイン	メルク	C6905	mg/mL で使用
生検パンチ (プランジャー付き)	テッド ペラ	15115-2	ID 0.75 mm、OD 1.07 mm
ビオチン-BSA	メルク	A8549	1 mg/mL
で使用 BSA	メルク	A8022	50 mg/mL で使用
カバースリップ ミニラック テフロンホルダー	Invitrogen	C14784	for 8カバースリップ
カバースリップ 22x40mm 厚さ #1.5	Menzel Gläser	631-1370
DABCO	メルク	D27802	fバッファー中の
DTT	Euromedex	EU0006-D	コンポーネント f-バッファー
Ester NHS Alexa Fluor 488	Invitrogen	A20000	Lys328 のアクチン標識用フルオロフォア。
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin	Thermo Scientific	21338	To biotinylate actin on Lys328
Hellmanex III	Hellma	9-307-011-4-507	ガラス洗浄洗剤
ImageJ	NIH	N/A	オープンソースソフトウェア
Laboport	KNF	811kn.18	真空ポンプ (到達真空: 240 mbar)
マジック インビジブル テープ	スコッチ	7100024666	標準透明オフィステープ
MicrewtubeSimport		T341-6T	2 mLマイクロ流体リザーバーチューブマイクロ
流体デバイス パート1:フローユニットS	Fluigent	FLU-S-D-PCKB	流量計
マイクロ流体デバイス パート2:Fluiwell-4C-2 mL	Fluigent	14002001PCK	リザーバーホルダー
マイクロ流体デバイス パート3:MFCS-EZ	フルイジェント	EZ-11000001 EZ-00345001	圧力コントローラー
Model 42 - UVO-Cleaner	Jelight Inc.	42-220	紫外線クリーナー
N6-(6-アミノヘキシル)-ATP-ATTO-488	イエナバイオサイエンス	NU-805-488	の標識に使用される ATP-ATTO アクチン
ニュートラアビジン	Thermo Scientific	31000
PLL-PEG	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)	PBSで1 mg / mLで使用します。
ポリジメチルシロキサン(PDMS)シルガード184シリコンエラストマー	ダウコーニング	1673921	PDMSベースと硬化剤ポリ
エーテルエーテルケトン(PEEK)チューブ	メルク		Z226661」ブルー": I.D. = 0.25 mm
安全ブローガン	コイルホース 空気圧	700-S	フィルター付きエア
シリコンチューブ	VWR	228-0701P	PEEKをカプラーに接続
ステンレス製カテーテルカプラー	Prime Bioscience	SC22/15	PDMSの入口と出口に挿入してPEEKチューブに接続
熱可塑性フィルム	Sigma Aldrich	PM996	標準「パラフィルム」
超高純度エタノール	VWR	64-17-5
超音波洗浄バス	VWR	USC200TH	1 L ビーカーを収容
真空デシケーター	SP Bel-Art	F42022-0000	PDMS または溶液を脱気します