磁気ナノ粒子を用いたイムノアッセイのための千鳥制限を有するマイクロ流体アクリルデバイスのコンピュータ数値制御マイクロミリング

Summary

マイクロフルイディクスは、診断テストを開発するための強力なツールです。ただし、高価な機器と材料、および面倒な製造と取り扱い技術がしばしば必要とされます。ここでは、低コストで使いやすい設定での磁気マイクロおよびナノ粒子ベースのイムノアッセイ用のアクリルマイクロ流体デバイスの製造プロトコルについて詳しく説明します。

Abstract

マイクロ流体システムは、イムノアッセイ技術を大幅に改善しました。しかし、多くの微細加工技術は、特殊な、高価、または複雑な装置を必要とするため、製造コストがかかり、大量生産と互換性がなく、ポイントオブケアテスト(POCT)を低リソース環境で採用するための最も重要な前提条件の1つです。この研究では、コンピューター数値制御(CNC)マイクロミリング技術を使用したナノ粒子結合酵素イムノアッセイ試験用のアクリル(ポリメチルメタクリレート、PMMA)デバイスの製造プロセスについて説明します。マイクロ流体デバイスの機能は、100nm磁性ナノ粒子に結合したモデル抗原としてリゾチームを使用して市販の抗体を検出するイムノアッセイを行うことによって示されます。このデバイスは、高さわずか5μmの物理的な千鳥制限を統合し、外部磁石を配置することによって磁気トラップを構成する磁性微粒子を捕捉するために使用されます。このようにして、コンジュゲートナノ粒子の免疫支持体にかかる磁力は、それらを捕捉し、流れの抗力に抵抗するのに十分である。このマイクロ流体デバイスは、イムノアッセイ性能の精度を損なうことなく、低コストの大量生産に特に適しています。

Introduction

近年、マイクロフルイディクスはイムノアッセイ技術において重要な役割を果たしています¹。小型化技術には、サンプルと試薬の消費量の削減、インキュベーション時間の短縮、効率的な溶液交換、高度な統合と自動化など、従来のイムノアッセイと比較して多くの優れた利点があります²。

さらに、イムノアッセイにおけるマイクロ流体システムは、免疫支持体としての磁性ナノ粒子と会合して、インキュベーション時間を大幅に短縮し、表面対体積比の増加により高い検出感度を達成します³。粒子のブラウン運動は、抗原抗体複合体^4,5の形成中の反応速度を改善する。さらに、ナノ粒子の磁気特性は、さまざまなマイクロ流体デバイス構成に統合する汎用性を提供し、小型化されたオンチップバイオセンシングシステムにおけるシグナル伝達および分子捕捉の理想的な候補となります⁵。しかし、磁力は表面対体積比が高いため、ナノメートルスケールの抗力よりも大幅に弱くなります⁶。したがって、洗浄や検出などの重要なイムノアッセイステップのためにナノ粒子を捕捉することは困難な場合があり、従来の磁石では不十分です⁴。

ナノ粒子を操作する効率的な方法は、マイクロ流体構造体³に充填された鉄微粒子によって形成されたマイクロ流体磁気トラップの使用である。したがって、外部の磁石が近づくと、磁化された多孔質媒体内で磁力と磁束力の間に複雑な相互作用が生じます。ナノ粒子に作用する磁力は、ナノ粒子を捕捉し、^流れの抗力に抵抗するのに十分強い^3,4,7。このアプローチでは、微粒子を保持するマイクロメトリック構造を生成するために、数マイクロメートルオーダーの分解能を達成する微細加工技術が必要です。

現在の微細加工技術により、数ミクロンから数百ナノメートルの構造の高解像度製造が可能になります⁸。ただし、これらの技術の多くは、特殊な、高価な、または複雑な機器を必要とします。主な困難の1つは、金型製造のためのクリーンルームの要件であり、これは依然としてコストと時間のかかる^8,9です。最近、マイクロ流体エンジニアは、コストの削減、ターンアラウンドタイムの短縮、材料とツールの安価化、機能性の向上など、さまざまな利点を備えたさまざまな代替製造方法を開発することで、この欠点を克服しています⁸。このように、新しい微細加工技術の開発により、10μm8という低い分解能を達成する低コストの非クリーンルーム法がもたらされ^ました。パターニングは、高価な成形パターンを生成することなく基板上に直接使用できるため、時間のかかるプロセスを回避できます。直接製造方法には、CNCフライス盤、レーザーアブレーション、および直接リソグラフィー^{が含まれます8}。これらの方法はすべて^、硬度9に関係なく、幅広い材料で高アスペクト比チャネルを製造するのに適しており、マイクロ流体デバイス⁸で新しく有利な形状、物理的挙動、および品質を可能にします。

CNCマイクロミリングは、基板からバルク材料を除去する切削工具を使用してマイクロスケール構造を作成し、マイクロ流体デバイス^10,11の効果的な製造方法です。マイクロミリング技術は、マイクロ流体アプリケーションでマイクロチャネルと機能を作業面に直接作成するのに役立ち、ワークピースを短時間で(30分未満)製造でき、設計からプロトタイプまでのターンアラウンドタイムを大幅に短縮できるという主な利点を提供します¹²。さらに、さまざまな材料、サイズ、および形状の切断アクセサリが広く利用できるため、CNCフライス盤は、多くの種類の低コストの使い捨て材料でさまざまな機能の製造を可能にする適切なツールになります¹³。

マイクロミリングで一般的に使用されるすべての材料の中で、熱可塑性プラスチックは、その多くの好ましい特性と生物学的用途との互換性のために、依然として主要な選択肢です^10,14。熱可塑性プラスチックは、低コストの使い捨て分析システムを開発するための大きな利点があるため、マイクロ流体システムにとって魅力的な基板です⁹。また、大量生産プロセスへの適応性が高く、製品化や量産に適しています。これらの理由から、PMMAなどの熱可塑性プラスチックは、マイクロフルイディクスの初期から信頼性が高く堅牢な材料と見なされてきました¹⁰。熱可塑性プラスチックの閉チャネルを製造するためのさまざまなプロトコル、例えば、溶剤接合¹⁵、熱接合16、および紫外線(UV)/オゾン表面処理接合¹⁷が記載されている。

多くの場合、従来のマイクロミリングマシンで達成される位置決め分解能は、10μm未満の構造を必要とする一部のマイクロ流体アプリケーションでは十分ではありません。ハイエンドのマイクロミリングには十分な解像度があります。残念ながら、価格が高いため、その使用は少数のユーザーに限定されています¹²。以前、私たちの研究グループは、従来のフライス盤の解像度を克服して、10μm未満の構造を加工できる低コストの工具の製造と操作を報告しました¹²。フィクスチャは、3つの圧電アクチュエータを含む、シンプルな電子機器で3D印刷によって製造されたプラットフォームです。表面にはヒンジ状のジョイントが含まれており、圧電素子が同時に作用するときに持ち上げることができます。Z軸変位は、500nmの分解能と±1.5μmの精度で制御できます¹²。

この論文では、マイクロミリング技術によるアクリルデバイス(PMMA)の製造プロセスのステップを紹介します。チップ設計は、幅200μm、高さ200μmのメインチャネルと、試薬の流れをパージするための同じ寸法のサイドチャネルで構成されています。中央領域では、このグループ¹²によって製造された3Dプリントされた圧電プラットフォームで製造された高さわずか5μmの物理的制限によってチャネルが中断され、外部磁石を配置することによってナノ粒子の磁気トラップを構成する磁性微粒子を捕捉する。100 nm磁性ナノ粒子に結合したモデル抗原としてリゾチームを用いて市販の抗体を検出するイムノアッセイを行うことによるマイクロ流体デバイスの動作を示す。このデバイスは、それをユニークにするさまざまな機能を兼ね備えています⁴:免疫サポートとして磁性ナノ粒子を使用すると、合計テスト時間が数時間から数分に短縮されます。検出に蛍光発生酵素を使用すると、標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)に匹敵する検出限界が可能になります。また、熱可塑性プラスチックを製造材料として使用することで、従来のマイクロ流体ナノ粒子の磁気トラップ³にはなかった大量生産に対応でき、POCTの開発に最適な候補となります。

Protocol

1.マイクロミリング

1. 平面研削
   1. マイクロフライス盤と圧電コントローラーの電源を入れます。それぞれの制御ソフトウェア¹²を起動する。
   2. 必要なエンドミルビット(直径200 μmおよび800 μm)を選択します。フライス盤の適切なコンパートメントに配置します(図1)。
   3. 厚さ1.3 mmのPMMAの9 mm x 25 mmの長方形を800 μmのエンドミルビットでカットします。これらの長方形の1つを両面粘着テープで圧電プラットフォームに慎重に取り付けます(図2)。
      注意: アクリルの長方形は常に同じ位置に配置して、角の1つが加工用のx軸とy軸の原点座標と一致するようにしてください。
   4. Zセンサーを接続して、PMMA長方形の表面に配置します。検出ピンを選択し、センサー表面上に移動します。センサーに接触せずに手動でピンを下げます。 Z0検出 モードをアクティブにします(図3)。
   5. 200 μm エンドミルビットを選択し、x、y 原点に移動します。Zセンサーを取り外します。アクリル面に接触せずにビットを慎重に下げます。
   6. 200 μmエンドミルビットを14,500 rpmで回転させます。z軸上の原点座標(z = 0)までゆっくりと下げます。原点の30μm下のz軸をリセットします。この座標を新しい Z 原点として設定します。
      メモ: ビットが回転していない場合は、絶対に下げないでください。そうしないと、破損する危険があります。
   7. マイクロミリングマシンソフトウェアのカットボタンをクリックして、カットパネルをアクティブにします。[追加]ボタンをクリックし、アクリル表面の研削用に以前に作成したコードを含む.txtファイル(補足コーディングファイル1)を選択します。[出力]ボタンをクリックしてプロセスを開始します。
   8. エンドミルビットを、制限が加工される座標に移動します。この座標に達したら、エンドミルビットが地面から浮き上がるのを防ぐには、「 一時停止」(Pause ) ボタンをクリックします。それ以外の場合は、エンドミルビットをこの座標に手動で再配置します(図4A)。
2. 5 μm制限のフライス加工
   1. エンドミルビットの回転速度を 11,000 rpm に設定します。圧電プラットフォームのインターフェースでプラットフォームを6.5μm上げます(補足図S1)。エンドミルビットをY軸に沿って500μm移動します。圧電プラットフォームを制御インターフェースを使用してz軸の初期値に戻します。
3. マイクロチャネルのフライス加工
   1. 設計ソフトウェアから以前に作成した設計ファイル(補足設計ファイル1)を開きます。[ 印刷 ]ボタンをクリックします。 [プロパティ ]メニューにアクセスし、加工するデザインを含むレイヤーに対応するカラーウィンドウをクリックします。 [ツール ]パネルで、 補足図 S2 で指定されているように製造パラメータを設定します。
   2. 不要なレイヤーを非アクティブ化するには、[ツール] プルダウン メニューの [なし] オプションを選択します。
4. 穴のフライス加工
   1. 800 μmエンドミルビットに切り替えます。対応するカラーウィンドウをクリックして、直径1.2mmの穴のデザインレイヤーをアクティブにします。
   2. 手順 1.3.2 を繰り返しますが、この場合は、穴の 補足図 S3A の説明に従って、対応する製造パラメータを設定します。
      注意: 機械加工された穴の深さは、アクリルの厚さの半分です。
   3. 長方形の反対側の角に2つの追加の穴を加工して、新しいプラットフォームでアクリルを逆さまに位置合わせします(図4B)。圧電プラットフォームからアクリル長方形をはがします。アクリルを裏返し、機械加工されたピラーを備えたアダプターの上に両面粘着テープでテープで留めます(図4C、D)。
   4. 設計ソフト(補足設計ファイル2)から反対側の面の穴の設計を含むファイルを開きます。 補足図S3Bの説明に従って、対応する製造パラメータを設定します。試薬の入口と出口の穴の残りの半分を直径1.5 mm、深さ0.7 mmで粉砕します(補足図S3C)。

図1:エンドミルビットの配置 。 (A)200 μmおよび800 μmのエンドミルビットを配置し、ネジを介してスチールサポートに固定します。(B)各エンドミルビットは、自動選択のためにマイクロミリングマシンの特定のコンパートメントに配置されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:圧電プラットフォーム。 プラットフォームは3D印刷によって製造され、3つの圧電アクチュエータによって制御されるz軸の微細な変位を可能にするヒンジによって結合された2つの六角形のベースで構成されています。PMMA長方形が取り付けられ、座標の位置合わせコーナーの設定を可能にするアクリルアダプターも観察されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:Z軸キャリブレーション。 z軸キャリブレーションの手順が詳しく説明されています。(A)zセンサーには、マイクロミリングマシンに差し込むケーブルが含まれています。(B)センサーは、機械加工する表面に直接配置されます。(C)検出ピンは、エンドミルビットの隣の特別なコンパートメントに配置された金属バーで構成されています。(D)両方のアクセサリが接触すると、マイクロミリングマシンはz軸上の原点座標を自動的に計算します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:整流されたアクリル表面 。 (A)直径200μmのエンドミルビットは、アクリル長方形の表面全体を掃引し、高さ約30μmの層を除去します。(B)画像は、以前に整流されたアクリルの表面にフライス加工されたさまざまな構造を示しています。試薬の入口と出口のチャネルと穴が観察されます。5μmの制限は肉眼では見ることができません。(C)アライメント穴のあるマイクロミル表面と、反対側のコーナーにアライメントピラーを備えたアダプター。(D)アクリルは、位置合わせ穴が収まるピラー付きのアダプター上で逆さまに位置合わせされます。スケールバー= 500μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2.チャネルシーリング

1. アクリル洗浄
   1. ピラーアダプタープラットフォームからアクリル長方形を取り外します。別の機械加工されていないアクリル長方形を取ります。両方のアクリルシートをイソプロピルアルコール(IPA)で洗い、蒸留水ですすいでください。手袋を着用し、IPAとの接触を避けてください。
   2. アクリルを超音波浴に10分間浸します(図5A、B)。
2. ガス状クロロホルム曝露
   1. 両方のアクリルシートを完全に乾かします。両面テープでガラスのペトリ皿の蓋の内側にそれらをテープで留めます。機械加工されたチャネルの側面を露出させてください(図5C)。手袋を着用し、アクリル面に直接触れないようにしてください。
   2. ガラスのペトリ皿のベースを大きなガラスのペトリ皿の中に置きます(図5D)。1mLのクロロホルムをペトリ皿のベースに注ぎます。内側にアクリルシートを取り付けた状態ですばやく蓋をします。
   3. すぐに蒸留水を大きなペトリ皿の底にペトリ皿の蓋の高さまで加えます。アクリルをクロロホルムガスに1分間さらします(図5E)。
      注意: クロロホルムへの暴露時間を長くするとアクリル表面が損傷し、5μmの制限が溶けて高さが変化するか、完全に消えることを考慮してください。
   4. ペトリ皿を傾けて、作成されたウォーターシールを破ります。ペトリ皿のカバーを外して、クロロホルムからアクリルをすぐに取り除きます。水をこぼさないように注意してください。
      注意: クロロホルムは非常に有毒であるため、ヒュームフードでこのプロセスを行い、手袋を使用してください。
3. プレスと加熱による接合
   1. 両面テープから両方のアクリル板をはがします。
   2. 両方のアクリルをガス状のクロロホルムにさらされた側面に向かい合わせ、サンドイッチを形成します。アクリルを18 kgf / cm² 、90°Cの温度でプレスに入れます(図5F、G)。
      注意: シールを改善するために、アクリルを縦方向に揃え、2分後に位置合わせを変更することをお勧めします。この時間が経過してもシールが不十分な場合は、1分以内の間隔でプレスに戻します。ステレオスコープを使用して、チャンネルのステータスと制限を確認します。プレス時間を超えた場合、制限がなくなるリスクがあることを考慮してください。
4. ホースアタッチメント
   1. ホースの長さを2〜3 cmカットします。完全にまっすぐにカットします。各ホースを瞬間乾燥液体接着剤でデバイスの穴に取り付けます(図6A)。接着剤がチップ内に入らないようにしてください。

図5:デバイスのシーリングプロセス。 (a)各アクリルシートを蒸留水と共に再封可能な袋に入れ、超音波浴に浸す。 (B)左の画像は製造直後のチャンネルを示し、右の画像はIPAと超音波浴で洗浄した後の同じデバイスを示しています。 マイクロチャネルからすべての不純物とアクリル残留物を除去します。200μmの中央チャネルを中断する制限のエッジが観察され、フライス加工が成功したことが確認されます。スケールバー = 500 μm。 (C)両方のアクリルを乾燥させ、蓋のガラスプラットフォームに接着します。(D)シャーレのベースは、より大きな直径の別のディッシュの内側に配置されます。(E)ペトリ皿を閉じるとき、ウォーターシールはガス状のクロロホルムが逃げるのを防ぎます。(F)重量5kgのレバーの要素の説明。(G)アクリルが置かれている領域を赤で示す開いたレバーの画像。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3.デバイスの準備

1. 注射器を使用してチャネルを蒸留水で満たします。漏れや流れに対する抵抗がないことを確認してください。デバイスを超音波浴に10分間浸して、チャネル内に残っているアクリル、接着剤、または不要な材料を取り除きます。
2. デバイスチャネル内の水を空にします。シリンジを使用して、1xトリス緩衝生理食塩水(TBS)で希釈し、0.2 μmポリエーテルスルホン(PES)シリンジフィルターで事前にろ過した5%(w / v)ウシ血清アルブミン(BSA)で調製したブロッキング溶液を導入します。
3. 5%BSA中の直径7.5μmの鉄微粒子の懸濁液を調製する。
   注:微粒子は、タンパク質吸収に対する耐性を付与するシリカ-ポリエチレングリコール(PEG)層で以前に官能化されています⁴。
4. チップと微粒子懸濁液をブロッキング溶液とともに室温で少なくとも1時間インキュベートします。可能であれば、4°Cで一晩ブロッキングします。

4. 微粒子トラップ形成

1. サイドチャネル出口ホースを通してシリンジ針で微粒子をチップに挿入します。チップを垂直に置き、重力の影響下で微粒子がサイドチャネルを通って流れるようにします。チップを90°の2段階で180°回転させ、微粒子を5μmの制限でターゲットにしてコンパクトにします。
2. サイドチャネルに向かって45°回転する重力によって余分な微粒子を除去します。
3. 微粒子トラップを元に戻さないように、デバイスを直立させてください。微粒子トラップ形成プロセスの概要については 、図6B を参照してください。

5.イムノアッセイ

1. ナノ粒子調製
   1. リゾチーム(抗原モデル)と結合させた100 nmナノ粒子の懸濁液を2 μL取ります。100 μLのブロッキング溶液を入れた1.5 mLの微量遠心チューブに追加します。4°Cで一晩インキュベートします。
   2. 150 μLの洗浄バッファー(TBS×1、0.05%トゥイーン20)を加えます。
   3. 1.5 mLのマイクロ遠心チューブを磁気分離器に入れます。ナノ粒子の分離を可能にするために15分間保持する(補足図S4)。
      注意: 磁気分離器の最小容量は200μLです。 小さい容量の使用は避けてください。
   4. マイクロピペットでチューブから液体を取り除きます。ナノ粒子ペレットが形成されたチューブの壁との接触を避けてください。
   5. 250 μLの新しい洗浄バッファーを追加します。チューブを15分間攪拌します。
   6. 手順 5.1.3.-5.1.5 を繰り返します。さらに2倍、5分間だけ振とう。
   7. 所望の濃度の一次抗リゾチーム抗体を添加する( 材料表を参照)。抗体希釈液(TBS1個、BSA1%、トゥイーン200個)で最終容量100 μLに調整します。
   8. 37°Cで15分間インキュベートします。 室温でさらに15分間振とうを続けます。
   9. 洗浄手順5.1.2.-5.1.6を繰り返します。
   10. 抗体希釈液100 μLを加えます。西洋ワサビペルオキシダーゼ共役二次抗体(HRP-AbII)( 材料の表を参照)を1:500の希釈率で加えます。
   11. 洗浄手順5.1.2.-5.1.6を繰り返します。
   12. ナノ粒子を最終容量50 μLの抗体希釈液に保持します。

6.実験的な実装

1. 2本の100μLガラスシリンジに水を入れ、長さ6.5cmのホースを各シリンジに接続し、ホースの端に金属ピンを挿入し、両方のシリンジをコンピューター制御のシリンジポンプに置きます。
2. アクリル装置のすべてのホースを熱で密封します。
3. インレットホースを切断し、数ミリメートルだけ保ちます。ディスペンシングニードルに洗浄バッファーを満たし、カットホースに挿入します。デバイスへの空気のアクセスを防ぐために、針をデバイスに接続する前に溶液を滴下させます。
4. 出口ホースを横方向のチャネルから切り取ります。シリンジポンプに接続します。次に、メインチャネルアウトレットホースについても同じ手順を実行します。
   メモ: 手順 6.3.-6.4 を実行することが重要です。この順番で微粒子トラップを開梱しないようにする。可能であれば、虫眼鏡を使用して、これらの手順中にトラップの状態を確認します。
5. 顕微鏡ステージにスライドガラスを置きます。両面テープで磁石をスライドに取り付け、両側に小さなテープを貼ってチップの端をガラスに固定します。
6. シリンジポンプコントローラーの[流量]タブと[単位]タブから流量を50 μL/hに設定します。引き出しモードを選択し、開始ボタンをクリックして洗浄バッファーのフローをアクティブにします。
7. トラップを含むチップの領域が磁石に接触するように、磁石を持ってスライドに向かってデバイスを水平に近づけます。
8. 動きを防ぐために、デバイスの端を両面テープでガラスに貼り付けます。顕微鏡検査のために光路を塞ぐことは避けてください(図6C)。

図6:最終的なデバイス構成 。 (A)対応する入力と出力にホースが取り付けられたアクリルデバイス。スケールは、デバイスの寸法をセンチメートルで示します。(B)微粒子トラップの形成のためのプロトコル。微粒子は、装置が垂直位置に配置されると、重力によってチャネルを通って流れる。微粒子は5μmの制限で濃縮されます。余分な微粒子は、サイドチャネルを通してチップを回転させることによって容易に除去される。チップは、イムノアッセイの前にトラップを保存するために垂直に保たれます。(c)倒立型蛍光顕微鏡のステージ上に、磁石を含むスライドガラス上に実装されたマイクロ流体デバイス。試薬が添加される分注針、ならびにシリンジポンプに接続する出口ホースが観察される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

7. 免疫検出

1. 洗浄バッファーを50 μL/hで10分間流し続け、余分なBSAを除去します。
2. マイクロピペットで分注針から残りの洗浄バッファーを取り除きます。ナノ粒子懸濁液を50μL添加します。
3. ナノ粒子の懸濁液を100 μL/hの流速で7分間流します。その後、流量を50μL/hに変更し、さらに15分間流します。
4. ディスペンシングニードルを交換します。洗浄バッファーを50 μL/hで10分間流します。洗浄ステップ中にメーカーの仕様に従って蛍光発生基質を準備します。
5. マイクロピペットで分注針から残りの洗浄バッファーを取り除きます。蛍光発生基質を100 μL添加 します(材料表を参照)。蛍光発生基質を50 μL/hで6分間流します。
6. シリンジポンプを制御するインターフェースの対応する流量タブとタイマー設定タブで、流量(1 μL/h、3 μL/h、5 μL/h、および10 μL/h)と時間(6分)の測定パラメータを設定します。実行する測定ごとに必ず引き出しモードを選択してください。
7. 洗浄ステップでは、追加の流量タブを50 μL/hに設定し、タイマーを3分に設定します。
8. 基板が50 μL/hで停止する15秒前に顕微鏡の蛍光をオンにします。基板が1,000ミリ秒の露光時間で停止する10秒前に顕微鏡カメラのソフトウェアで画像キャプチャを開始します。1フレーム/秒(FPS)で6分間イメージングを実行します。
9. 50 μL/hでの基板洗浄流量が停止した直後に、目的の流量パラメータ の[開始 ]ボタンをクリックします。選択した測定フローが停止した直後に洗浄フロー(50 μL/h) の開始 ボタンをクリックします。
10. 画像キャプチャを停止し、顕微鏡の蛍光をオフにして、基板の光退色を防ぎます。
11. 手順 7.8.-7.10 を繰り返します。使用した各測定流量について。

Results

従来のマイクロミリング技術の分解能を向上させる再現性の高い製造プロトコルを確立することができました。このプロトコルを使用して、高さ200 μmのチャネルで互い違いの制限として機能する高さ5 μmの小さなチャネルの作成が達成されます。千鳥状制限のシンプルな設計により、直径7.5μmの鉄微粒子を捕捉し、マイクロチャネルで圧縮すると、外部磁石がデバイスに近づいたときに磁気トラップを作成できます。この装置により、目的の分析物を免疫学的担体として結合させたナノ粒子を用いてイムノアッセイを行うことができます。この研究では、酵素標識抗体ベースの検出による非競合的間接イムノアッセイが実施されました。モデル抗原(Ag)は、直径100 nmのナノ粒子(NP)に結合したリゾチームタンパク質でした。一次抗体としてウサギ抗リゾチームIgG(AbI)を用い、ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体(HRP-AbII)を用いて検出を行った。

検出は、トラップを通過した際にHRP-AbIIと蛍光発生基質との相互作用後に得られた蛍光シグナル強度の変化を、トラップされたナノ粒子と相関させることによって行った。測定...

Discussion

ナノ粒子を免疫担体として用いた免疫測定用のアクリルマイクロ流体デバイスをマイクロミリング技術を用いて作製した。基板上で直接製造する方法は、マスターモールドの使用およびこれが意味する時間とコストを回避するという利点を有する。ただし、ラピッドプロトタイピングと大量生産に限定されます。

ここでは、既報の補機用圧電台用フライス盤¹²を用いた。このプラットフォームは、従来のマイクロミリングマシンの10μm解像度よりも優れた垂直解像度で可変深度チャネルを作成するために3D印刷によって製造されました。200 μmのマイクロ流体チャネルに千鳥状の制限を形成する高さ5 μmまでのチャネルのフライス加工を実現しました。

マイクロ流体デバイスの製造に必要なエンドミルビットは、直径200μmと800μmの2つだけで、手動でビットを変更する必要はありません。使用されるフライス盤モデルは、ビットの交換を自動的に実行し、時間の最適化に役立ちます。また、「Z0センシング」モードでは、フライス盤に含まれるセンサー...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.008 エンドミル	京セラ SGS	2204	2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12
0.032 エンドミル	京セラ SGS	2228	2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12
カルボニル鉄微粒子	シグマ・アルドリッチ	44890	7 μm
クロロホルム	フェルモント	6201	健康被害:中程度 可燃性:なし 反応性:なし 接触性:中程度
CMOSカメラモーメント	テレダインフォトメトリクス		センサー技術:CMOS 量子効率:73% ピクセルサイズ:4.5&マイクロ;m x 4.5 & マイクロ;m 対応インターフェース USB 3.2 Gen 2
Dr Engrave Software	Roland DGA Corporation		表面の彫刻パスを設計・作成するための彫刻ソフトウェア
抽出フード	不明	不明
フレキシブルプラスチックチューブ	タイゴン	AAD04103	ID = 0.020, OD = 0.060
蛍光マイクロソープ	ZEISS	Axio Vert.A1
ディスペンスニードル	Loctite	98612
自家製圧電コントローラーアプリケーション	LabView		詳細については、参考文献12を参照してください。
Loctite 495 インスタント接着剤	Henkel	49503	マイクロピペットチップまたは分注針で塗布する
MagJETセパレーションラック	サーモサイエンティフィック		12 x 1.5 mL
メカニックプレス	自家製
フライス盤	ローランド	MDX-50
圧電プラットフォーム			参照 12
ポリメチルメタクリレート - シート - PMMA、アクリル	Goodfellow	ME303018/1	厚さ: 1.3 mm、透明度: 透明/透明
PVCamTest ソフトウェア	Teledyne Photometrics	バージョン 3.10.107	画像取り込みソフトウェア
実体顕微鏡	ニコン	SMZ 7457
スーパーマグ カルボキシルビーズ	オーシャンナノテク	KSC0100	100nm
シリンジポンプ	kd サイエンティフィック	KDS200	2本のシリンジを保持できます
Utrasonicバス	ブランソン	2800
VPanelソフトウェア	Windows OS	Version 1.0.3.0	マイクロミリングマシン制御ソフト