ここでは、固定化抗原に対する放射性標識抗体の結合親和性(KD)を決定する方法について説明する。KD は、その抗原に対する様々な濃度での放射性標識抗体の全体的、特異的、および非特異的結合を測定することによって飽和結合実験から決定することができる平衡解離定数である。
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この記事について
サマリー
要約
結合親和性(KD)の決定は、放射性標識抗体(rAb)の特性評価の重要な側面である。典型的には、結合親和性は平衡解離定数KDによって表され、抗体結合部位の半分が平衡で占有される抗体の濃度として計算することができる。この方法は、任意の放射標識抗体または他のタンパク質およびペプチドスカフォールドに一般化することができる。細胞ベースの方法とは対照的に、固定化抗原の選択は、抗体の長期保存後の結合親和性を検証し、二重特異性抗体構築物におけるフラグメント抗原結合領域(Fab)アームの結合親和性を区別し、異なる細胞株間で抗原発現にばらつきがあるかどうかを決定するために特に有用である。この方法は、破砕可能な96ウェルプレート上の指定されたウェルに一定量の抗原を固定化することを含む。次いで、非特異的結合を、ウシ血清アルブミン(BSA)を用いて全てのウェルにおいてブロッキングした。続いて、rAbを全てのウェルに濃度勾配で添加した。rAbが飽和に達することを可能にするために、すなわち、すべての抗原がrAbによって連続的に結合される抗体の濃度の範囲が選択された。抗原を固定化していない指定ウェルにおいて、rAbの非特異的結合が決定され得る。抗原を固定化したウェル内の総結合から非特異的結合を差し引くことにより、抗原に対するrAbの特異的結合を決定することができる。rAbの KDを、得られた飽和結合曲線から算出した。一例として、結合親和性は、上皮成長因子受容体(EGFR)および細胞質間葉系上皮転移(cMET)タンパク質に対する二重特異性抗体である放射性標識アミバンタマブを用いて決定した。
概要
放射性標識抗体(rAb)は、医学において様々な用途を有する。その大半は腫瘍学においてイメージングおよび治療薬として利用されているが、リウマチ関連炎症、心臓病学、および神経学のためのイメージング用途がある1。イメージングrAbsは、病変を検出するために高感度を有し、治療のための患者の選択を支援する可能性を秘めている2,3,4,5。それらはまた、それぞれの抗原に対する特異性のために治療に使用される。セラノスティックスとして知られる戦略では、同じrAbが画像化と治療の両方に使用されます6。
理想的には、放射性標識のために選択された抗体は、非放射性標識法を用いて高い結合親和性および特異性を有することが既に証明されているものである。抗体の放射性標識は、安定な共有結合を形成する放射性核種(例えば放射性ヨウ素)による抗体の直接化学修飾によって、またはその後放射性金属に配位するキレート剤とのコンジュゲーションを介して間接的に達成することができる7,8
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プロトコル
メモ: プロトコルのグラフィカルな表現については、 図 2 を参照してください。
図2:プロトコルの概略図行ラベルと列ラベルは、壊れやすい96ウェルプレートを設定するためのガイドとして示されています。予想される結合は、抗原およびBSAについてのよくある例に示されている。湾曲した矢印は、BSAのみで井戸から洗い流されることが期待されるrAbを示します。この図は BioRender.com で作成されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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結果
この方法は、異なる濃度のrAbを固定化抗原に添加した飽和結合アッセイに基づいて、rAbに対する結合親和性(KD)を計算する。結合曲線は、最初は急勾配で、抗原が飽和するにつれてプラトーになる対数成長に従うべきである。決定されたKD が正確であることを保証するために、rAbの濃度は飽和に達するのに十分高くなければならない。このアッセイのために、放射性標識抗体をDFOにコンジュゲートし、前述のように 89Zrで放射性標識した19。 図3は 、代表的な飽和結合プロットを示す。放射性標識アミバンタマブは、上皮成長因子受容体(EGFR)および細胞質間葉上皮転移(cMET)タンパク質に対する二重特異性抗体であり、EGFR(図3A)およびcMETタンパク質(図3B)に結合した19。EGFR(図
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ディスカッション
rAbsの開発の一環として、rAbが高い結合親和性でその標的に特異的に結合することを確実にすることが重要です。結合親和性を決定することは、rAbの免疫反応性が、固定化抗原を用いた放射性リガンド飽和アッセイを介して放射性コンジュゲーションによって影響を受けるかどうかを知らせることができる。BSAへのrAb結合の決定は、非特異的結合を定量するために使用して、固定化抗原への特異的結合をより正確に測定することができる。この方法は、異なる濃度のrAbの結合を試験して飽和結合曲線を生成し、KDを計算し、結合 親和性を決定する。
このアッセイを行うには、調査中のrAbの抗原を持っていなければならない。抗原は、抗体が結合するエピトープを有する必要がある。新規抗体が未知の結合エピトープを有する状況では、結合親和性を決定する非放射性標識法がより適切であり得る。実験を開始する前に、文献検索をお勧めします。ELISAベースのアッセイで以前に使用されていた目的の抗原は、このアッセイに有効である可能性が高い。
放射性核種の半減期とガ.......
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開示事項
著者には利益相反はありません。
謝辞
著者らは、[89Zr]Zr-シュウ酸塩の生産に対して3D Imaging と、抗体を提供してくれたヤンセン・ファーマシューティカルズのシェリー・ムーアズ博士に感謝の意を表している。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ウシ血清アルブミン (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| ガンマカウンター | Hidex | Hidex 自動ガンマカウンター | |
| GraphPad プリズムソフトウェア | GraphPad | バージョン 9.2; この研究で統計分析に使用 | |
| Immuno Breakable MaxiSorp 96-well plates | Thermo Scientific | 473768 | |
| Microplate Sealing Tape | コーニング | 4612 | |
| Microsoft Excel | マイクロソフト | ||
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| 重炭酸ナトリウム | JT Baker | 3506-01 | |
| 炭酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 |
参考文献
- Krecisz, P., Czarnecka, K., Krolicki, L., Mikiciuk-Olasik, E., Szymanski, P. Radiolabeled Peptides and Antibodies in Medicine. Bioconjugate Chemistry. 32 (1), 25-42 (2021).
- Dun, Y., Huang, G., Liu, J., Wei, W. ImmunoPET imaging of hematological malignancie....
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再版と許可
