精密切断肺スライスを利用して気道・肺内動脈平滑筋の収縮調節を研究

平滑筋細胞(SMC)は、肺の主要な構造細胞型であり、主に気道および肺血管の培地壁に常在する。SMCは管腔口径を変化させるために収縮し、空気と血流を調節する ^1,2.したがって、SMCの収縮性調節は、空気換気および肺循環の恒常性を維持するために不可欠である。対照的に、異常なSMC収縮性は、閉塞性気道または喘息および肺動脈性高血圧症のような肺血管疾患を引き起こす。しかしながら、肺SMCの機能評価は、肺組織、特に肺の遠位部にあるそれらの小さな気道および微小血管への限られたアクセスによって挑戦されてきた^2,3。現在のソリューションは、気道狭窄を反映するためにFlexiventによって気流抵抗を測定し、肺血管収縮を評価するために右心カテーテル法によって肺動脈血圧をチェックするなどの間接アッセイに頼っています^4,5。しかし、これらの間接アッセイには、構造的要因によって交絡される、肺スケール^{全体における}気道または血管応答の空間的多様性を捉えることができない、細胞レベルでの収縮調節の機構的研究に適さないなど、複数の欠点がある。したがって、単離された初代細胞、気管/気管支筋ストリップ^8、9、または大きな血管セグメント¹⁰を使用する代替アプローチが、インビトロでのSMC研究に適用されている。それにもかかわらず、これらの方法にも制限があります。例えば、培養条件^11、12における初代SMCの迅速な表現型適応は、細胞培養からインビボ設定への所見を推定することを問題にする。加えて、単離された近位気道または血管セグメントにおけるSMCsの収縮表現型は、遠位肺におけるSMCsを表していなくてもよい^6,7。さらに、組織レベルでの筋力測定は、収縮調節への機構的洞察に不可欠な分子的および細胞的事象から解離したままである。

生きた肺組織切片である精密切断肺スライス(PCLS)は、生体内に近い微小環境(すなわち、保存された多細胞構造と相互作用)で肺SMCを特徴付けるための理想的なエクスビボツールを提供します¹³。Placke博士とFisher博士が1980年代にアガロースで膨張したラットとハムスターの肺からの肺スライスの調製を初めて導入して以来^、14,15、この技術はPCLSに生物医学研究のためのより高い品質と汎用性を提供するために継続的に進歩してきました。1つの重要な改善は、気管を介したアガロースによる肺膨張に加えて、ゼラチン注入による肺動脈保存の増強である。その結果、気道および肺動脈の両方が、エクスビボアッセイ¹⁶のためのPCLSにおいて無傷に保たれる。さらに、PCLSは、培養において長期間にわたって生存可能である。例えば、マウスPCLSは、培養において最低12日間、細胞生存率および代謝に有意な変化を示さず、ならびに、気道収縮性を最大7日間保持した¹⁷。さらに、PCLSは収縮およびリラクゼーションアッセイのために異なるサイズの気道または血管を保持します。さらに、SMCsの細胞内Ca2+シグナル伝達は、細胞収縮性の決定因子であり、共焦点または²光子顕微鏡¹³によって画像化された^Ca2+レポーター色素を用いてアッセイすることができる。

肺研究におけるマウスモデルの広範な適用を考慮すると、 エクスビボ 肺研究のために無傷の気道および肺内動脈を有するマウスPCLSを調製するための詳細なプロトコルがここに記載されている。調製したPCLSを用いて、我々はその後、狭窄性または弛緩性刺激に対する気道および肺動脈応答を評価する方法を実証した。さらに、PCLSに^Ca2+ レポーター色素をロードし、次いで収縮性または弛緩性応答に関連するSMCの^Ca2+ シグナル伝達をイメージングする方法も記載されている。

すべての動物ケアは、マサチューセッツ総合病院の施設動物ケアおよび使用委員会のガイドラインに従っていました。野生型C57/B6雄マウス(8週齢)を本研究に使用した。

1. 実験準備

1. 作業ソリューションを準備します。
   1. 1x ハンクス平衡塩溶液(HBSS、Ca2+および^Mg2+ 、およびpHを^20mM HEPESと平衡、 材料表を参照)を調製する。HBSS ソリューションを使用して、PCLS を準備および処理します。PCLSを準備するときは、氷上でHBSS溶液を冷たく保ちます。
2. ダルベッコ改変イーグル培地およびF-12(DMEM-F12)に抗生物質 - 抗真菌剤(1:100容量比、 材料表を参照)を添加して、PCLSの培養培地を調製する。
3. 1.5%アガロースおよび6%ゼラチン溶液を調製する。
   1. 低融点(LMP)アガロースまたはゼラチン粉末( 材料表を参照)とHBSS溶液を15 mL滅菌遠沈管(溶液容量が10 mLの場合は50 mLチューブ)で最終濃度まで別々に混合します(または、溶液容量>10 mLの場合は50 mLチューブ)。
      注:アガロース溶液の全体積= 5mL/マウス×マウス数;ゼラチン溶液=2mL/マウス×マウス数。
   2. 粉末が完全に溶解するまで、溶液チューブを沸騰水中で加熱する。アガロースとゼラチンの両方の溶液を42°Cの水浴中に保管してください。
      注:解剖テーブルの加熱ランプは、動作環境を暖かく保ち、マウス肺に注入される前にアガロース溶液が固化するのを防ぐのに役立ちます。
4. 一対の解剖はさみ、2対の湾曲した微小解剖鉗子、および一対の止血鉗子を含むすべての解剖ツールを、滅菌のために少なくとも20分間、70%エタノール溶液に沈める。
5. ビブラトームを準備して( 材料表を参照)、肺組織を薄いスライスに分割します。
6. CCDカメラを備えた倒立位相差顕微鏡を気道または血管収縮応答を評価し、カスタムメイドのレーザー走査共焦点顕微鏡( 材料表を参照)を使用して肺SMCの^Ca2+ シグナル伝達を評価します¹⁸。

2.アガロースおよびゼラチン溶液によるマウス肺の膨張

1. マウスを安楽死させる。
   1. マウスを5%イソフルランを含むプラスチックチャンバー(約750cm3)に入れます。マウスが少なくとも1分間呼吸を停止するまで、マウスをチャンバー内に保持します。
      注:ケタミン(240 mg/Kg)およびキシラジン(32 mg/Kg)¹⁹ またはペントバルビタール(0.3 mL)²⁰の腹腔内注射などの他の一次安楽死方法は、吸入イソフルランの代替として適用することができます。
   2. マウス本体を離剖ボードの上に置き、仰臥位に置きます。尾、前足、および頭を25Gシリンジ針で固定して体を所定の位置に固定し、70%エタノールスプレーで体を消毒します。
   3. マウスの腹部を外科用ハサミ(切開、長さ約2cm×幅2cm)で切り開きます。その後、腹部大動脈を切り取って血液量を枯渇させます。
2. 以下の手順に従って肺葉を膨らませます。
   1. 胸骨と横隔膜の上の両側下胸郭に沿って胸腔を注意深く開き、胸腔が開いたときに肺葉が崩壊するのを観察します。
   2. 両側腹側胸郭の一部を取り外して心臓を露出させます。鋭いはさみの先端を肺組織から遠ざけることによって肺の損傷を避けてください。
   3. 鉗子を使用してマウス首の胸腺と軟部組織を分離し、気管を露出させます。
   4. 気管の上端に小さな穴(直径1.2mm)を切断し、20G Y字型のIVカテーテルの先端を通過させます( 材料表を参照)。
   5. Y字型カテーテルの一方のアダプターポートを0.5 mLの空気でプレフィルされた3 mLシリンジに接続し、もう1つのポートを2 mLの温かい1.5%アガロース溶液(42°C)でプレフィルした3 mLシリンジに接続します。
   6. アガロース溶液を注入してカテーテルを満たし、カテーテルを予め切断された開口部から気管内に5〜8mmの長さで押し込む。
   7. アガロース溶液を約1mL/5秒でゆっくりと注入する。肺は近位から遠位軸に沿って拡張します。各肺葉の縁が膨らんだら注射を停止します。
      注:肺を過度に膨らませないでください, これはそれを破裂させる可能性があるため、.若年成人マウスの肺全体を膨張させるアガロース溶液の体積は、約1.3±0.1mLである。
   8. 他のシリンジから0.2〜0.3mLの空気を注入して、カテーテル内の残留アガロースおよび導電性気道を遠位肺胞空間に押し込む。
   9. クリップは、一対の湾曲した止血鉗子で気管を閉じます( 材料表を参照)。
3. 肺血管系を充填する。
   1. 1mLのシリンジに暖かい6%ゼラチンを充填する。針頭皮静脈カテーテルに接続し、カテーテルにゼラチン溶液を充填し、下壁に近い右心室を針で穿刺する。
   2. 針を右心室に長さ2〜3mm押し込み、針先を主肺動脈に向けます。
   3. 0.2mLのゼラチン溶液を右心室および肺動脈血管にゆっくりと注入する。
      注:肺葉は、適切なゼラチン膨張でわずかに薄く見えます。
   4. 注射後5分間針を所定の位置に保ち、氷冷HBSS溶液を心臓と肺に注いで肺葉を冷やし、解剖ボードで体を4°Cの冷蔵庫または氷の上に合計10分間置きます。
   5. はさみで周囲の結合組織からマウスの肺と心臓を取り除きます。次に、各肺葉を分離し、氷上のHBSS溶液に保管します。

3. 肺葉を細いスライスに切断する

1. 肺ローブをスーパーグルーで試料カラムの上部にトリミングして取り付け、葉の向きを合わせ(図1A、B)、切断方向がヒラから肺表面までのほとんどの気道に対して垂直になるようにします。
2. 新鮮な細いカミソリの刃でビブラトームを使用して、肺葉を150μmのスライスに切断します。冷たいHBSS溶液を予め充填した100mm滅菌ペトリ皿にスライスを集める。
   メモ:スライスを開始する前に、適切なブレード移動速度と振動周波数を設定してください。圧縮トムの一般的な設定は、速度レベル4と発振レベル4です。
3. DMEM/F-12培養液(20スライス/15mL培地/ディッシュ)を充填したシャーレにスライスを移し、実験前に37°Cのインキュベーター内で一晩維持する。
   注:マウスPCLSは、気道収縮応答を失うことなく約7日間培養中に維持することができる¹⁷。肺動脈の寿命は十分に評価されていない。我々の観察では、それらはDMEM/F12培地中で少なくとも3日間、無傷の構造および血管反応を保持する。長期保存のために、マウスPCLSを10%DMSOを含むDMEM/F12培地で満たされたクライオバイアル(バイアルあたり1mL培地中に5スライス)に入れ、-80°Cのイソプロピルアルコール充填容器で一晩凍結し、液体窒素中で数週間から²¹ヶ月間凍結保存することができる。

4. 肺内気道・動脈の収縮応答の解析

1. PCLSをHBSS充填24ウェル培養プレートに各ウェルに1つずつ入れます。ウェルの中央にあるPCLSの位置を確認し、ピペットでHBSS溶液を取り出します。
2. 顕微鏡下でスライス内のターゲット気道と血管を見つけ、ターゲット領域を露出させるために予めカットされた中央穴(直径2〜3mm)を備えたナイロンメッシュを使用してスライスを覆います。
3. メッシュの上に中空の金属ワッシャーを置き、スライスを所定の位置に保持します(図2A)。
4. 600 μLのHBSS溶液を加えてPCLSを沈めます。スライスを10分間休ませてから、気道または血管のベースライン画像を記録します。
5. 空のHBSS溶液をピペットで慎重に吸引し、1μMのメタコリン(MCh)または10nMのエンドセリンなどのアゴニストを含む600μLのHBSSを添加することによって、気道または血管収縮を誘導する( 材料表を参照)。
   注:ツールセット標準としてのKCl刺激は、メタコリンまたはエンドセリン曝露の前には必要ではない。マウス気道における100mMのKCl刺激は、小さくて不規則な気道収縮(10%〜15%)を誘導するだけである²⁰。同様に、同じアゴニスト、例えばメタコリンまたはセロトニンが、最初で反復的な曝露で同様の気道収縮を引き起こすことを確認したので、プライミングメタコリン刺激は義務ではない^20,22。
6. 内腔領域の変化が平衡状態に達するまで顕微鏡下で反応を観察し、気道または血管画像を記録して分析します。
7. ピペットでMChまたはエンドセリン溶液を除去し、同じアゴニスト濃度および弛緩剤を有する新しい600μL HBSS溶液を加える。気道または血管の弛緩を観察し、記録する。
8. 以下のステップに従って気道または血管反応を定量化する。
   1. NIHが後援するフリーソフトウェアFIJIに画像をロードします。
   2. ツールバーの 「ポリゴン選択」 を選択して、各フレームの気道または血管内腔の輪郭を描きます。
   3. [分析] を選択 >、面積>測定値を設定します。
   4. [分析>測定] を選択して、対象領域を定量化します。結果は、統計分析のために別のウィンドウに表示されます。

5. 気道または血管SMCの^Ca2+ シグナル伝達の解析

1. ^Ca2+色素ローディングバッファーを用意する。
   1. ^Ca2+染料、オレゴングリーン488 BAPTA-1-AM(材料表を参照)、50μg(バイアル1本)、10μLのDMSOで溶解する。
   2. 0.2gのプルロニックF-12粉末( 材料表を参照)を1mLのDMSOに溶解し、20%プルロニック溶液を生成する。
   3. 10 μL の 20% プルロニック溶液と 10 μL の^Ca2+ 色素-DMSO 溶液を混合します。
   4. ²⁰⁰ μM のスルホブロモフタレインを含む 2 mL の HBSS 溶液に 20 μL の混合物を加えて、Ca2+ 色素担持バッファーを作ります (材料表を参照)。
2. 2mLのCa2⁺ ローディングバッファーに15匹のマウスPCLSを入れ、30°Cで1時間インキュベートする。次いで、スライスを100μMのスルホブロモフタレインを含む2mLのHBSS溶液に、室温で蛍光色素脱エステル化のためにさらに30分間移動させる。
3. SMCの^Ca2+ シグナリングを検出します。
   1. ^Ca2+染料を装填したスライスを大きなカバーガラスの上に置きます。
   2. 3mLシリンジに高真空シリコーングリースを充填します。グリースを 18 G の鈍い針で絞って、スライスの上下のカバーガラスに 2 本の平行線を描きます。
   3. 2本のグリースラインの間にナイロンメッシュを使用してスライスを覆います。メッシュの上に第2のカバーガラスを置き、側面にグリースで密封されたチャンバを発生させる(図3A)。
      注:ナイロンメッシュは、スライスをボトムカバースリップに取り付けたままにし、40xオイルなどの高サイズの反転対物レンズの作動距離内にとどまるために不可欠です。
   4. HBSSまたはアゴニスト溶液を、手動または灌流システム を介して ピペッティングすることによって、一端からチャンバーに入れる。連続流体灌流の場合には、ティッシュペーパーまたは真空で他方の端から吸引することによって、チャンバから流体を除去する。
   5. PCLSチャンバーを顕微鏡ステージに置きます。SMC^23のCa2+ シグナリングを、15または³⁰ 画像/秒のレーザースキャンレートを備えたカスタムメイドの共振走査型共焦点顕微鏡で検出します。
      注:また、現在広く入手可能な高速市販のレーザー走査型共焦点顕微鏡を、PCLSにおける肺SMCの^Ca2+ シグナル伝達アッセイに適用することができます。
4. SMCにおける^Ca2+ 蛍光を定量化する。
   1. 記録された画像シーケンスをFIJIにロードし、 8ビットグレースケール>画像>タイプを選択します。
   2. ツールバーの [ 四角形の選択] を選択し、平滑筋セルに 5 ピクセル x 5 ピクセルの関心領域 (ROI) を定義します。
   3. [分析] >選択して、^Ca2+ 蛍光強度を表す平均グレー値>測定値を設定します。
   4. SMCの収縮に伴ってROIの位置が変化する場合は、[ 分析> Ca²⁺ 蛍光強度をフレームごとに測定]を選択します。
   5. SMCのROIが画像のスタック内で同様の位置にとどまる場合は、[ 画像>スタック> Ca²⁺ 蛍光強度の測定スタック]を選択します。
      メモ:カスタム記述のマクロを差し込むと、SMC内のROIがイメージスタック内で収縮しながら移動し、ROIの^Ca2+ 強度(グレー値)をフレームごとに自動的に測定するときに、SMC内のROIを追跡できます。

無傷の肺内気道および動脈を保存するマウスPCLS調製物
厚さ150μmのPCLSを倒立位相差顕微鏡で観察した。マウス肺では、伝導性気道は肺内動脈を伴い、丘陵から末梢肺まで走る。マウスPCLSにおける代表的な肺気道 - 動脈束を 図2Bに示す。気道は、内腔の内面を覆う活発な繊毛拍動を有する直方体上皮細胞によって容易に同定することができる。対照的に、近くの肺動脈は、平坦な内皮によって特徴付けられる。末梢肺野に到達すると、導電性気道は呼吸管および嚢に分岐し、小さな腺房内細動脈を囲む(図2C)。

マウスPCLSを利用して肺気道と動脈収縮を評価する
メタコリン(MCh、1μM)誘導気道収縮は、 図2Bに実証される。気道収縮応答は、MChばく露後の管腔面積減少の割合によって定量化される(図2D)。対照的に、肺動脈はMCh刺激に対して応答を示さない(図2B)。気道は、1日または5日間の培養後、PCLSにおいてMChに対する同様の用量依存性収縮応答を維持する(図2D)。PCLSがエンドセリン(10nM)に曝露されると、気道および肺動脈の両方が収縮し(図2C、E)、続いてNOC-5(100μM)が弛緩を誘導した(図2E)。

マウスPCLSを利用して気道および動脈SMCのCa2+シグナル伝達を評価する
Ca2+色素装填PCLSを共焦点蛍光顕微鏡下で観察する。気道(図3B)および血管(図3C)におけるCa2+蛍光SMCは、安静状態では低く、細胞内Ca2+シグナル伝達の焦点スパークは注目に値しない。アゴニストに曝露すると、Ca2+蛍光強度はSMC内で上昇し(図3B、C)、通常は1つのスポットから細胞全体に伝播する。Ca2+蛍光波は、振動信号と同じセルに繰り返し現れます(図3D,E)。一般に、Ca2+振動の頻度は、アゴニスト濃度がプラトーレベル24に達するまで上昇するにつれて増加する。気道SMC弛緩は、Ca2+振動25の減少または停止と関連している。

図1:ビブラトームスライスのためのマウス肺葉の向き。 マウス肺葉は、セクションごとに個々のものに分離される。(A)左(1)、右頭蓋(2)、および尾葉(3)は、平らな切断面をサンプルカラムに貼り付ける前に、白い点線に沿ってヒラムの近くでトリミングされます。左葉の配置を(4)に示す。(B)右中央ローブは、サンプルカラムに直接接着することができます。右のアクセサリーローブは、そのサイズが小さいため、一般的に使用されていませんでした。異なる葉の適切な向きは、ほとんどの気道および肺血管がPCLSに横断部を提示することを確実にする。スケール バー = 1 cm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:マウスPCLSにおける気道および肺動脈の収縮性および弛緩性応答 (A)収縮アッセイのための培養プレートウェルにおけるPCLSの配置を示す概略図。(B)HBSSの肺動脈(黒い矢印)が近くにある気道(黒い矢印)を、安静時および1μMメタコリン(MCh)への曝露後に示す代表的な画像。(c)安静時および10nMエンドセリン(Endo)への曝露時のHBSSにおける腺房内細動脈を示す代表的な画像。(D)1日(灰色の線)および5日目(黒い点線)培養後のPCLSにおけるMChに対する用量依存性気道収縮応答。各点は、2匹のマウスからの9つの気道の平均±SEMを表す。(e)10nMエンドセリン誘発気道および肺動脈収縮、続いて一酸化窒素ドナーである100μM NOC-5が誘導された弛緩を示す代表的な画像。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:PCLSにおける気道および肺動脈SMCのCa2+ シグナル伝達。 (A)SMCのCa2+ イメージングのためにPCLSを焦点面に保持するための上部および下部カバーガラス、グリースシール、およびナイロンメッシュを備えたチャンバのセットアップを示す概略図。 (B)1μM MChへの曝露時および曝露後の気道SMCのCa2+ シグナル伝達を示す代表的な蛍光画像。 上皮細胞。(C)安静時および10nMエンドセリン(Endo)への曝露後の肺動脈SMCのCa2+ 蛍光画像。太字の白い矢印は肺動脈の縦軸を示し、端矢印の付いた点線は動脈壁周りの血管SMCのらせん分布を示す。スケールバー = 20 μm。Ca2+ 蛍光強度(Ft)の振動上昇は、安静状態(F0)における蛍光強度に対する比で、気道SMCにおいて1μM MCh(D)に、および肺動脈SMCにおいて10nMエンドセリン刺激に応答して(E)に応答する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

著者らには開示するものは何もありません。