Method Article

メゾスコピックから顕微鏡スケールまでのニューロンイメージングのための組織クリアリング法

DOI:

10.3791/63941

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May 10th, 2022

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1Department of Neuroanatomy, Juntendo University Graduate School of Medicine, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, Juntendo University Graduate School of Medicine, 3Advanced Research Institute for Health Sciences, Juntendo University, 4Department of Neuroscience, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 5Japan Society for the Promotion of Science, 6Department of Oral Anatomy and Neurobiology, Graduate School of Dentistry, Osaka University, 7Department of Multi-Scale Brain Structure Imaging, Juntendo University Graduate School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

プロトコールは、組織クリアリング法ScaleSFを用いた脳スライスにおけるニューロンイメージングの詳細な方法を提供する。このプロトコルには、脳組織調製、組織清澄化、クリアスライスの取り扱い、およびメゾスコピックレベルから顕微鏡レベルまでのニューロン構造の共焦点レーザー走査顕微鏡イメージングが含まれます。

Abstract

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ここでは、脳組織のメゾスコピックレベルからミクロレベルまでのニューロン構造を視覚化するための詳細なプロトコルが提供されています。神経回路から細胞内ニューロン構造に至るまでのニューロン構造は、ScaleSFで光学的にクリアされたマウス脳スライスにおいて視覚化される。この透明化方法は、ScaleSの修正版であり、強力な透明化能力ならびに蛍光シグナルの高レベルの保存および構造的完全性を達成する組織スライスのための親水性組織透明化方法である。カスタマイズ可能な3次元(3D)プリントイメージングチャンバは、クリアされた脳組織を確実に取り付けるように設計されています。増強された緑色蛍光タンパク質遺伝子を有するアデノ随伴ウイルスベクターを注入したマウス脳を4%パラホルムアルデヒドで固定し、振動組織スライサーで1mm厚のスライスに切断した。脳スライスは、3つの溶液、すなわちScaleS0溶液、リン酸緩衝液生理食塩水(-)、およびScaleS4溶液中で合計10.5〜14.5時間逐次インキュベーションを含むクリアリングプロトコルに従ってクリアされた。クリアした脳スライスをイメージングチャンバーにマウントし、ScaleS4D25(0)溶液に溶解した1.5%アガロースゲルに埋め込んだ。スライスの3D画像取得を、長い作動距離の多液浸対物レンズを搭載した共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて行った。メゾスコピックニューロンイメージングから始まり、樹状突起スパインや軸索ブートンなどの微細な細胞内ニューロン構造を光学的にクリアした脳スライスに可視化することに成功しました。このプロトコルは、回路から細胞内成分スケールまでのニューロン構造の理解を容易にするであろう。

Introduction

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組織透明化法は、光学顕微鏡による生物学的および臨床的サンプルの深さに依存しないイメージングを改善し、無傷の組織上の構造情報の抽出を可能にした1,2。光学的クリアリング技術は、潜在的にスピードアップし、組織学的分析のコストを削減する可能性があります。現在、3つの主要なクリアリングアプローチが利用可能である:親水性、疎水性、およびヒドロゲルベースの方法1,2。親水性アプローチは、蛍光シグナルおよび組織の完全性を維持する上で凌駕し、他の2つのアプローチと比較して毒性が低い3、4。

親水性透明化法であるScaleSは、構造的および分子的完全性の保持と強力な透明化能力(透明化保存スペクトル)により、独特の地位を占めています5。以前の研究では、Sca l eS6の透明化手順を変更することによって、組織スライス(〜1mm厚)に対する迅速で等尺性透明化プロトコルScaleSFを開発しました。このク....

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Protocol

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すべての実験は順天堂大学施設動物管理利用委員会(承認第2021245号2021246)により承認され、日本学術会議「動物実験の適正な実施のための基本指針」(2006年)に従って実施された。ここでは、増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)遺伝子を搭載したAAVベクターを注射した雄C57BL/6Jマウスと、パルブアルブミン(PV)/ミリストイル化-EGFP-低密度リポタンパク質受容体C末端細菌人工染色体(BAC)トランスジェニックマウス(PV-FGLマウス)9 を用いた。PV-FGLマウスは、C57BL/6Jバックグラウンドで維持した。この研究に関して性別に基づく差は見つからなかった。

1. 組織調製

  1. 灌流固定
    メモ: ヒュームフードで手順 1.1.1 ~ 1.1.3 を実行して、パラホルムアルデヒド(PFA)への曝露を制限します。
    1. 成体雄マウス(8〜16週齢)をペントバルビタールナトリウム(200mg / kg)の過剰摂取の腹腔内注射によって麻酔する。つま先ピンチ離脱およびまばたき反射の欠如によって麻酔の妥当性を確認する。
    2. 胸腔を開き、外科用はさみで右心房付属器を切断する。20 mL シリンジに取り付けられた 23 G 針を使用して、マウスに 20 mL の氷冷リン酸緩衝液生理食塩水 (PBS) を灌流し、続いて、別の 20 mL シリン....

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Results

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1−mm厚さのマウス脳スライスの光学的透明化は、このプロトコールを用いて達成された。 図1B は、クリアリング処理前後のマウス脳スライスの透過像を表す。組織透明化法は、厚さ1mmのマウス脳スライスを透明にした。脳スライスの最終サイズのわずかな拡大は、透明化溶液中で12時間インキュベーションした後に見出された(線膨張:102.5%±1.3%)。組織の蛍光および構造的完全性の保存を、PV−FGLマウスにおける原形質膜における標的EGFP発現を用いて評価した(図1C)。これらのマウスにおいて、ソマトデンドライト膜標的EGFPはPV陽性ニューロン9において発現される。ソマトデンドライト領域における原形質膜を標的としたEGFP発現は、処理後も維持された(図1C)。さらに、以前のEM研究は、ScaleSFでクリアされた脳組織において、よく保存された構造的完全性を示している(補足図1)

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Discussion

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プロトコル内の重要なステップ
プロトコルには、意味のある結果を得るために細心の注意を払って実行する必要があるいくつかの重要なステップがあります。サンプルの均一な固定は、大規模組織内の3Dイメージングに不可欠です。対物レンズ、サンプル、および液浸液は、RI と一致する必要があります。それらの間のRIミスマッチは、クリアされた脳スライス内のEGFP発現細胞の画像化を高度に乱すことにつながる(図3)。対物レンズを液浸液に補正するカラー調整により、深さ誘起球面収差が最小限に抑えられ、3Dイメージングにおける信号、コントラスト、空間分解能が最大化されます。調製した溶液のRIsは、屈折計を用いて測定することができる。

手法のトラブルシューティング
溶液の長期保存は、透明化能力、および蛍光シグナルおよび構造的完全性の保存能力に影響を及ぼす可能性がある。新しく調製した溶液を使用する必要があります。これらの溶液は、4°Cで1ヶ月まで保存することができる。 アイソメーションは、正確な信号再.......

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Disclosures

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著者らは開示するものは何もありません。

Acknowledgements

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著者らは、AAVベクター作製に石田洋子(順天堂大学)と技術支援を寄せた星野喜晃氏(順天堂大学)に感謝の意を表した。本研究は、日本学術振興会科学研究費補助金(JP20K07231 to K.Y.;JP21H03529 から T.F. まで;JP20K07743 から M.K.;JP21H02592 から H.H.)革新的領域「共鳴バイオ」に関する科学的研究(JP18H04743からH.H.へ)。本研究は、国立研究開発法人日本医療研究開発機構(AMED)(JP21dm0207112 to T.F.およびH.H.)、科学技術振興機構(JST)のMoonshot R&D(JPMJMS2024 to H.H.)、JSTのFusion Oriented Research for Disruptive Science and Technology(FOREST)(JPMJFR204D to H.H.)、順天堂大学医学部老年期疾病研究所の助成金(X2016 to K.Y.;X2001 to H.H.)、および私立学校ブランディングプロジェクト。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16倍マルチイマージョン対物レンズライカマイクロシステムズHC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR
寒天Nacalai Tesque01028-85
アガロースTaKaRa BioL03
ジメチルスルホキシドNacalai Tesque13407-45
D-ソルビトールNacalai Tesque06286-55
γ-シクロデキストリン和光純薬工業037-10643
グリセロールSigma-AldrichG9012
ホイヘンス エッセンシャルサイエンティフィック ボリューム イメージングver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b
ImarisBitplanever. 9.0.0
Leica Application Suite XLeica MicrosystemsLAS X, ver. 3.5.5.19976
メチル-&β;-シクロデキストリン東京化学工業M1356
パラホルムアルデヒドメルク ミリポア1.04005.1000
リン酸緩衝生理食塩水 (10x; pH 7.4)Nacalai Tesque27575-3110x PBS(–)
アジ化ナトリウムナカライ テスク31233-55
ペントバルビタール 共立製薬N/A
TCS SP8ライカ マイクロシステムズN/A
トリトン X-100ナカライ テスク35501-15
尿素ナカライ テスク35940-65
振動組織スライサードサカ EMPRO7N

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
  2. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R.

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