Method Article

治療誘発性老化癌細胞における複数の蛍光老化マーカーの同時イメージングおよびフローサイトメトリーベースの検出

DOI:

10.3791/63973

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July 12th, 2022

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1Johannes Kepler University Linz, 2Charité - University Medicine Berlin, 3Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association

In This Article

Summary

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ここでは、単一細胞における複数の老化関連マーカーの可視化および定量化のためのフローサイトメトリーベースの方法を提示する。

Abstract

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化学療法薬は、癌細胞に回復不能なDNA損傷を誘発し、アポトーシスまたは早期老化をもたらす可能性がある。アポトーシス細胞死とは異なり、老化は癌細胞の増殖を抑制する根本的に異なる機構である。何十年にもわたる科学的研究により、がん細胞や間質細胞を調節する腫瘍や微小環境における老化がん細胞の複雑な病理学的影響が明らかになってきました。新しい証拠は、老化が癌治療中の強力な予後因子であることを示唆しているため、癌サンプル中の老化細胞の迅速かつ正確な検出が不可欠である。本稿では、がん細胞における治療誘発性老化(TIS)を可視化・検出する方法を提示する。びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)細胞株をマフォスファミド(MAF)またはダウノルビシン(DN)で処理し、老化マーカー、老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-gal)、DNA合成マーカー5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)、およびDNA損傷マーカーγ-H2AX(γH2AX)について調べた。フローサイトメーターイメージングは、高解像度の単一細胞画像を短時間で生成し、がん細胞の3つのマーカーを同時に視覚化および定量化するのに役立ちます。

Introduction

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様々な刺激が細胞老化を誘発し、細胞が安定した細胞周期停止の状態に入る原因となり得る。これらの刺激には、内因性シグナル伝達変化または外因性ストレスが含まれる。内因性シグナルには、進行性テロメア短縮、テロメア構造の変化、エピジェネティック修飾、プロテオスタシス障害、ミトコンドリア機能障害、および癌遺伝子の活性化が含まれる。外因性ストレスには、炎症性および/または組織損傷シグナル、放射線または化学的処置、および栄養欠乏が含まれる1,2,3,4。異なるタイプの老化の中で、最も一般的に見られ、よく研究されているのは、複製性老化、癌遺伝子誘発性老化(OIS)、放射線誘発性老化、および治療誘発性老化(TIS)である。OISは、異常な癌遺伝子活性化によって生じる複製ストレスによって引き起こされる遺伝毒性損傷に対する急性細胞応答であり、腫瘍前病変から本格的な腫瘍への病理学的進行をある程度防ぐことができる。TISは、腫瘍細胞が化学療法薬または電離放射線によってストレスを受けているときに起こります5,6。

老化は、その非常にダイ....

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Protocol

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1. 細胞老化を誘導するマフォスファミドまたはダウノルビシン処理によるDLBCL細胞株

注:このプロトコルは、付着がん細胞に対しても機能します。細胞サイズに応じて、種子1〜2×105 個の細胞を6ウェルプレートの1ウェルに浸し、処理前にプレートを5%CO2、37°Cインキュベーター中で一晩インキュベートする。プロトコルの手順は浮遊細胞の場合と同じですが、2 つの例外があります。まず、ステップ3.4の後に細胞をプレートからトリプシン処理する必要があります。第2に、洗浄工程は、トリプシン処理の前に遠心分離なしで行われる。

  1. DLBCL細胞および種子1×106細胞/mLを1 ウェルあたり4mLの培地でカウントし、6ウェル培養プレートに入れます。10%ウシ胎児血清(FBS)および100U/mLペニシリン/ストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地でDLBCL細胞を培養する。
  2. MAF(5 μg/mL)またはDN(20 ng/mL)を細胞培養物に加え、プレートを静かに揺らして混合します。
    メモ: MAF と DN は安定していません。DMSOに溶解した後、原液を小分けし、-20°Cで保存すべきである。 凍結/解凍サイクルは避けるべきです。
  3. プレートを5%CO2、37°Cのインキュベーター内で3日間....

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Results

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画像解析ソフトウェアを用いて、単色対照サンプルの記録データをロードして補正マトリックスを生成した。 補足図S1に示すように、EdUからC12 FDGへの無視できない(係数値≥0.1)光スピルオーバーはクロストーク係数値0.248で検出されましたが、他のチャネル間のクロストークは有意ではありませんでした。4つの異なるDLBCL細胞株を5μg/mL MAFまたは20ng/mL DNで処理して細胞老化を誘導し、従来のSA-β-gal染色またはイメージングフローサイトメトリー法のいずれかを用いて分析した。

KARPAS422、WSU-DLCL2、およびOCI-LY1細胞の70%以上がSA-β-gal陽性で示された老化状態に入り、SU-DHL6はMAFおよびDNによる老化誘導に対して完全に耐性であった(補足図S2A)。注目すべきことに、MAFおよびDNはまた、劇的ではないが、すべてのDLBCL細胞において細胞死を誘導した(補足図S2B)。イメージングフローサイトメトリー.......

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Discussion

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この方法は、明視野イメージングおよびフローサイトメトリーベースの定量化を用いて、化学療法治療時の4つの異なるDLBCL細胞株の老化侵入能力を調べた。単一細胞レベルでは、治療されたKARPAS422およびWSU-DLCL2細胞において主要なC12 FDG+EdU-Ki67+老化集団を検出することに成功し、OCI-LY1細胞においてより少ない程度であったが、SU-DHL6細胞株は治療に対して耐性であった。細胞株間の老化導入能力の違いは、それらの明確なゲノム欠損によって説明され得る16,17。しかしながら、不適切な細胞培養密度または薬物濃度も老化誘導性に影響を及ぼす可能性がある。細胞密度および薬物濃度の段階希釈は、より包括的な検査のために慎重に選択されるべきである。特に、この方法は、追加の遺伝毒性刺激なしにDLBCL細胞中の天然に存在する老化集団を正確に検出するのに十分な感度を有していた(図3

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Disclosures

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著者らは、開示すべき利益相反はありません。

Acknowledgements

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この研究は、ヨハネス・ケプラー大学リンツ校(BERM16108001)からヨン・ユーへの助成金によって支援されました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) AntibodyBiolegend613407
Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)Biolegend350509
C12FDG (5-ドデカノイルアミノフルオレセインジベータ;-D-ガラクトピラノシド)Fisher Scientific11590276
Chloroquin -DiphosphatSigma aldrichC6628
クレンザー (コールター クレンツ)ベックマン・コールター8546929
Click-iT EdU パシフィック ブルー フロー サイトメトリー アッセイ キットサーモ サイエンティフィックC10418
ダウノルビシンMedchemexpressHY-13062A
デバブラー (70% イソプロパノール)ミリポア1.3704
画像解析ソフトウェア (Amnis アイデア 6.3)LuminexCN-SW69-12
装置およびイメージングソフトウェア (Amnis ImageStreamX Mk II イメージングフローサイトメーターシステムおよびINSPIREソフトウェア)Luminex100220
KARPASDSMZACC 31
mafosfamide cyclohexylamineNiomechD-17272
OCI-LY1DSMZACC 722
ParaformaldehydeFisher Scientific11473704
PETG (2-フェニルエチル-&β;-D-チオガラクトシド) ImageStream
サポニングマアルドリッチ47036
スミリポアBSS-1006-B
Speedビーズキット
DSMZのACC 575
Luminex 400041滅菌器用シグマアルドリッチP4902シシー(0.4-0.7%次亜塩素酸塩)VWR JT9416-1 SU-DHL6 DSMZ ACC 572 WSU-DLCL2

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  2. Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119),....

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Imaging Flow CytometrySenescence MarkersTherapy Induced SenescenceFluorescent Marker DetectionDLBCL Cell LinesGamma H2AX DetectionEdU IncorporationC12 FDG StainingSingle Cell ImagingNuclear Foci Quantification

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