血漿および固体組織からのトレーサブルおよび機能化された細胞外小胞の単離と分析

細胞外小胞(EV)は、さまざまな生理学的および^{病理学的イベント}2において重要な役割を果たす細胞放出脂質二重層封入細胞外構造¹を定義するために提案されています。健康な細胞から放出されるEVは、細胞内エンドサイトーシス輸送経路³を介して形成されるエクソソーム(または小型EV)と、細胞⁴の原形質膜の外出芽によって発生するマイクロベシクル(または大型EV)の2つの主要なカテゴリーに大きく分類できます。多くの研究は、in vitro⁵で培養細胞から収集されたEVの機能に焦点を当てていますが、循環または組織に由来するEVはより複雑で不均一であり、生体内の生物の真の状態を反映するという利点があります⁶。さらに、ほぼすべての種類の組織が生体内でEVを産生することができ、これらのEVは組織内でメッセンジャーとして機能したり、さまざまな体液、特に末梢血によって移動したりして、全身コミュニケーションを促進することができます⁷。循環および組織内のEVも疾患の診断および治療の対象である⁸.

近年、エクソソームの研究が盛んに行われているのに対し、マイクロベシクルは重要な生物学的機能も備えており、超遠心なしで容易に抽出できるため、基礎研究や臨床研究が進められています⁹。特に、循環および組織から分離されたEVに関する重要な問題は、それらが異なる細胞型に由来することです¹⁰。マイクロベシクルは原形質膜から剥がれており、豊富な細胞表面分子が特徴であるため⁹、親細胞膜マーカーを使用してこれらのEVの細胞起源を特定することが可能です。具体的には、フローサイトメトリー(FC)技術を適用してメンブレンマーカーを検出することができます。さらに、研究者はEVを隔離し、機能的な貨物に基づいてさらに分析を行うことができます。

本プロトコルは、in vivoサンプルからEVを抽出して特性評価するための徹底的な手順を提供します。EVは示差遠心分離によって単離され、EVの特性評価には、ナノ粒子追跡分析(NTA)および透過型電子顕微鏡(TEM)による形態同定、FCによる起源分析、およびウェスタンブロットによるタンパク質貨物分析が含まれます。マウスの血漿および上顎骨が代表として使用される。研究者は、他のソースからのEVについてこのプロトコルを参照し、対応する変更を加えることができます。

動物実験は、第4軍事医科大学の施設動物管理および使用委員会のガイドラインおよびARRIVEガイドラインに従って実施されました。本研究では、8週齢のC57Bl/6マウス(雌または雄のいずれも選好しない)を使用した。血漿および組織EVの分離に関連するステップを 図1に示します。血漿は、体液からのEV分離手順を説明するための代表として採用されています。上顎骨を代表として、固形組織からのEV隔離手順を説明します。

1.血漿および上顎骨サンプルの調製

1. 以下の手順に従って血漿サンプルを準備します。
   1. 標準的な実験室天秤を使用してマウスの体重を決定します。
   2. 20 μL、2 mg / mLのヘパリンを1.5 mLの遠沈管に加え、ミキサー装置( 材料の表を参照)を使用してヘパリンをチューブの壁に付着させます。
      注:抗凝固チューブを使用して血液を直接採取することもできます。
   3. 50 mg / kgのペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射によってマウスを麻酔します( 材料の表を参照)。.親指と人差し指でマウスの首をつかみ、尾と左後ろ足を小指で固定し、腹を露出させた後、1mLの注射注射器でペントバルビタールナトリウムを注射します。
   4. 足蹠を挟んだときの角膜反射や四肢反応がないことから、マウスが適切に麻酔をかけられていることを確認します。
   5. 湾曲したハサミで顔の毛と目のまつげを剃ります。
   6. マウスの首の皮膚をつかみ、眼球が突き出るように目の周りの皮膚を首の後ろに押し付けます。眼科用ピンセットを使用して眼球をすばやくクランプし、手順1.1.2で準備した1.5mLの遠沈管で血液の流出を収集します。頸椎を脱臼させてマウスを犠牲にします。
      注意: 毛やまつげは溶血を引き起こす可能性があるため、注意してください。
   7. 血液凝固を防ぐために、チューブを数回静かに逆さまにします。
      注意: できるだけ早くチューブを逆さまにしてください。
   8. 血液サンプルを4°Cで1,200 x g で15分間遠心分離します。
   9. 上清を新しく清潔な1.5 mL遠心チューブに慎重に移し、血漿サンプルをすぐに使用するか、4°Cで数時間保存します。
   10. 上清を等量の1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈し、よく混合します。
       注意: プラズマを収集するための上記のプロトコルは致命的です。血液は、マウスを犠牲にすることなく鎖骨下静脈穿刺¹¹ を通して採取することもできる。
2. 以下の手順で上顎骨サンプルを準備します。
   1. 眼科用ピンセットとはさみで上顎骨を隔離し、PBSで洗ってピンセットで軟組織を取り除きます。
   2. 上顎骨を1.5mL遠沈管に入れ、ハサミで骨を小片(直径1mm未満)に切断します。組織を覆うために一定量のリベラーゼ(5 μg/mL、 材料表を参照)を加え(通常、8週齢のマウスの骨サンプルの場合は1 mL)、37°Cで30分間インキュベートします。
   3. サンプルを800 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
   4. 上清をピペットで新しい清潔な1.5 mL遠心チューブに慎重に移します。

2. EVの抽出

1. サンプル(ステップ1.1.10およびステップ1.2.4で調製)を2,500 x g(4°C)で15分間遠心分離して、大きな細胞破片と残りの血小板を除去します。
2. 上清を新しく清潔な1.5 mL遠心チューブに慎重に移し、16,800 x g (4°C)で30分間遠心分離します。
   注:遠心分離速度は、EVを抽出するために10,000 x g 以上に設定できます¹².遠心分離機の速度が速いほど、より多くの量のEVを得ることができます。使用した遠心分離機の制限速度は16,800 x g であるため( 材料の表を参照)、このプロトコルではこの速度を選択しました。
3. 上清を廃棄し、1 mLのPBSで各チューブにペレットを再懸濁します。16,800 x g (4°C)で30分間遠心分離します。
4. 上清を廃棄し、50 μLのPBSで各チューブにペレットを再懸濁します。これらのサンプルを4°Cで24時間未満保存するか、できればすぐに次の分析に使用してください(ステップ3〜5)。
   注意:-80°Cでの保管は、EVの濃度が低下し、EVの粒子サイズが大きくなり¹³、EVの次の分析に影響を与えるため、許容できません。

3. EVの形態同定

1. NTA 分析を実行します。
   1. EVの量に応じて(ペレットのサイズで大まかに判断すると、50 μLの血漿の粒子が最小です)、5〜50 μLの再懸濁を移し(ステップ2.4)、10 mLの緩衝液で希釈し(PBSを0.22 μmフィルターでろ過)、1 mLのマイクロピペッターチップで十分に混合します。この最終懸濁液は粒子測定に使用します。
   2. 滅菌済みの1 mLシリンジを使用して、検出インターフェースに表示される粒子の数が5未満になるまで、少なくとも5 mLの蒸留水を適度かつ一定の速度で注入します。
      注:チャネル全体に1 mLの蒸留水を注入した後、粒子の数は検出インターフェースに直接表示されます。それでも5を超える場合は、基準が満たされるまで1mLの蒸留水を注入し続けます。
   3. 1 μLの校正溶液を1 mLの蒸留水に再構成して一次溶液を生成し、次に100 μLの一次溶液を25 mLの蒸留水に取り、標準ストック溶液(1:250,000)を調製します。この作業試薬を4°Cで1週間保存します。
   4. NTA機器を標準原液で校正します(ステップ3.1.3)。1〜5 mLの作業校正液を1 mLの滅菌シリンジで注入し、検出インターフェースに表示される粒子の数が50〜400(できれば約300)になるまでマシンチャネルをフラッシュします。キャリブレーションプログラムを実行します。
   5. 各サンプル測定の前に、手順3.1.2を繰り返してマシンチャネルをフラッシュします。
   6. 滅菌済みの1 mLシリンジを使用して少なくとも2 mLの緩衝液を注入し、検出インターフェースに表示される粒子の数が10未満になるまで、マシンチャネルを一定速度でフラッシュします。
   7. ステップ3.1.1で調製したEVサンプル1 mLを適度で一定の速度で注入します(推奨速度は0.5〜1 mL / sです)。
      注:最適な粒子濃度は、検出インターフェースに表示される粒子の数を50〜400の範囲、できれば約300にすることです。粒子の数が多すぎる場合は、手順3.1.2を繰り返してマシンチャネルをすぐにフラッシュし、チャネル壁での粒子の保持を回避し、手順3.1.1でEVサンプルの濃度を調整してから、手順3.1.5から繰り返します。
   8. 粒子分析を実施し、製造元の指示に従って分析レポートを生成します(材料表を参照)。
   9. サンプルが貴重な場合は、1 mLシリンジでEVサンプルをポンプバックし、1.5 mL遠沈管に回収します。手順 2.2 を繰り返して EV を抽出します。
   10. すべてのサンプルを検出した後、少なくとも2 mLの緩衝液をマシンチャネルに注入し、次に検出インターフェイスに表示される粒子の数が5つ未満になるまで少なくとも5 mLの蒸留水を注入します。
   11. 滅菌済みの5 mLシリンジを使用して、少なくとも10 mLの空気を一定速度(推奨速度は1 mL / s)で注入し、チャネル内の水を除去します。
2. TEM 分析を実行します。
   注:新しいEVの再サスペンションで次の手順を実行します。ホルバーカーボンコーティング電子顕微鏡グリッドには2つの側面があり、作業面は中央グリッドで発光しています。以下の手順でEVを抽出するための血漿の最小量は50μLです。
   1. EVサンプル(ステップ2.4)を等量の4%パラホルムアルデヒド(PFA)と混合します。4 μLのEVを1つのグリッドに堆積させ、室温(RT)で15分間インキュベートします。
   2. ポリエチレンフィルムのシートに4滴のPBS(1滴は50μLに相当)を入れます( 材料の表を参照)。きれいな微細なピンセットでグリッドを移し、PBSでグリッドの作業側をある滴から別の滴に洗います。
   3. ろ紙を使用して、グリッドに残っている余分なPBSを取り除きます。
   4. グリッドの作業面を1%リンタングステン酸( 材料表を参照)に2分間インキュベートしてから、手順3.2.2を繰り返します。
      注意: リンタングステン酸は有毒であるため、この手順はヒュームフード内で操作する必要があり、冗長なリンタングステン酸は直接廃棄するのではなく、特別にリサイクルする必要があります。
   5. ろ紙で覆われた10 cmの皿にグリッドを上向きに置きます。グリッドはRTで数年間保管できます。
   6. 製造元の指示に従って、電子顕微鏡でグリッドを観察します(材料表を参照)。
      注:単一の粒子を確実に観察するには、EVの濃度を調整する必要があり、懸濁液は明らかな濁りのない透明である必要があります。滴下する前に、サンプルをよく混ぜる必要があります。代表的なTEMおよびNTA分析を 図2に示します。

第4章 EVの起源分析

注:EVの細胞起源を特定するには、典型的な細胞膜マーカーの抗体を適用する必要があります。以下の手順でEVを抽出するための最小血漿量は300μLです。 EVの脂質二重層構造に基づいて、膜色素を使用してEVをマーキングできます。血漿サンプルの場合、リンパ球¹⁴ のCD18が表現のために選択されます。上顎骨試料については、破骨細胞¹⁵ に対する破骨細胞関連受容体(OSCAR)が一例として選択される。FCの前に、フローサイトメーターがEVの測定に適合していることを確認してください¹⁶、サイズ下限は異なるフローサイトメーター間で大きく異なります。

1. サンプルを500 μLのPBSで再懸濁し(ステップ2.4)、ブランクコントロール(チューブA)として50 μLを新しく清潔な1.5 mL遠心チューブに移し、さらに50 μLをFITC用の単純な染色チューブ(チューブB)として新しい清潔な1.5 mL遠心チューブに移します。膜染色のために0.5 μLの膜色素を一次チューブに加えます。RTで5分間インキュベートします。
2. 一次チューブを16,800 x g (4°C)で30分間遠心分離します。上清を廃棄し、ペレットを200 μLのPBSで再懸濁します。
3. 各50 μLサンプルを4本の1.5 mL遠心チューブに分割し、PE用の単純な染色チューブ(チューブC)、表面マーカー染色(チューブD)、および二次抗体のみのコントロール(チューブE)に対応します。
4. 骨EVサンプル中のOSCARの一次抗体と血漿EVサンプル中のCD18抗体( 材料の表を参照)をチューブB(ステップ4.1)とチューブD(ステップ4.3)に別々に(1:100に希釈)加えます。4°Cで1時間インキュベートします。
5. チューブを16,800 x g (4°C)で30分間遠心分離します。上清を廃棄し、ペレットを500 μLのPBSで再懸濁した後、16,800 x g (4°C)で30分間遠心分離して、余分な一次抗体を除去します。
6. 上清を廃棄し、ペレットを50 μLのPBSで再懸濁し、続いてFITC結合二次抗体( 材料の表を参照)をそれぞれ(1:200で希釈)加えます(チューブE)。同じ二次抗体をチューブB(ステップ4.1)とチューブD(ステップ4.3)に追加します。すべてのチューブを暗所で4°Cで1時間インキュベートします。
   注:直接蛍光標識抗体を使用して、適切なアイソタイプコントロールでFC検出を処理することもできます。
7. 0.2、0.5、および1μmサイズのビーズ( 材料の表を参照)の懸濁液をそれぞれ1 mLのPBSに1滴希釈し、最初に各サイズのビーズを実行して、EV用に選択されたゲートを確認します。フローサイトメーターの閾値を設定し、適切な前方散乱(FSC)および側方散乱(SSC)を使用してビーズおよびEV集団を検索する。
   1. 最終条件を100,000個の膜染色粒子を計算するように設定します。製造元の指示に従って、フローサイトメーター を介して サンプルを分析します( 材料表を参照)。代表的な結果を 図3に示す。
      注:蛍光チャネルを備えたNTA機器も起源分析に使用でき、サンプル調製はFCと同じです。

5. EVのタンパク質含量分析

注:EV内のタンパク質含有量の分析は、ウェスタンブロット を介して 行われます。例えば、血漿および骨EVは、代謝状態について6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(PGD)およびピルビン酸キナーゼM2(PKM2)を分析するために選択されました。ゴルギン84(ゴルジ体小器官)をネガティブコントロールとして使用し、フロチリン(膜タンパク質)、カベオリン(カベオラの内在性タンパク質)、およびβアクチン(細胞骨格)¹⁷ を細胞サンプルと比較してEVのポジティブコントロールとして使用しました。ミトフィリンとα-アクチニン-4は大きなEVマーカーとして選択され、CD9とCD81はEV亜集団を示すために小さなEVマーカーとして選択されました¹⁸。Apoa1を血漿リポ粒子^{マーカー19}として選択した。それぞれの試薬の詳細については、 材料表を参照してください。

1. ペレットを50 μLのRIPA溶解バッファーに再懸濁し(ステップ2.4)、氷上で30分間インキュベートします。
2. 製造元の指示に従って、BCAタンパク質アッセイにより、96ウェルマイクロプレート内のすべてのサンプルのタンパク質濃度を定量します( 材料表を参照)。
   1. 2 mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)を0.9%の生理食塩水(NS)(0.9%(w/v)の塩化ナトリウムを含む)で0.5 mg/mLに希釈します。 表1に示すように、0.5 mg/mLのBSAと0.9%のNSを、特定の容量の3つの複製ウェルに追加します。
   2. 2 μLのサンプルをドロップし(ステップ5.1)、18 μLのNSを3つの複製ウェルに別々に追加します。
   3. BCA試薬Aと試薬B(50:1試薬A:B)を混合して、作業溶液を調製します。 200 μLの作業溶液を各ウェルに加え、30秒間穏やかに振とうします。
   4. 96ウェルマイクロプレートを37°Cで20〜25分間インキュベートします。
   5. 分光光度計で596nmのODを測定します(材料表を参照)。
   6. データをエクスポートします。
   7. 検量線を描き、サンプルのタンパク質濃度を計算します。
3. 結果によると、0.9%のNSと5x SDS-PAGEローディングバッファー(250 mM Tris·塩酸、pH 6.8、10% SDS、30% (v/v) グリセロール、10 mM DTT、0.05% (w/v) ブロモフェノールブルー、 材料表を参照)。チューブをフィルムでしっかりと密封し、100°Cで5分間加熱します。
4. サンプルとタンパク質ラダーを4%〜20%のHepes-Trisゲルの勾配濃度にロードします( 材料の表を参照)。
   注:目的のタンパク質の分子量に応じてゲルパーセンテージを選択してください。
5. タンパク質がラインを形成するまで80 Vのランニングバッファーでゲルを実行し、次にローディング色素がゲルの底部になるまで120 Vに1時間切り替えます。
   注:実行時間は、使用する機器、またはゲルの種類と濃度によって異なる場合があります。
6. ゲルをポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜( 材料表を参照)に移し、メチルアルコール中で20秒間プレインキュベートします。湿式移送システムを使用して、200mAで1時間移送します。
   注意: 移送システム内に気泡がないことを確認し、PVDFメンブレンを濡らしてください。
   注:転写時間は、標的タンパク質の分子量によって異なる場合があります。1 KDには通常1分かかります。
7. 50 mLのトリス緩衝生理食塩水-トゥイーン(TBST)(2 mLのPBS溶液に2 mLのトゥイーンを加えた)に2.5 gのBSA( 材料の表を参照)を50 mLの遠沈管に加えることにより、5%BSAブロッキングバッファーを調製します。粉末が溶解するまで攪拌する。このバッファー中のメンブレンを、攪拌しながらRTで2時間ブロックします。
8. TBSTで適切な濃度に希釈した特異的一次抗体でメンブレンをインキュベートします(ミトフィリン、1:1000; α-アクチニン-4、1:1000;CD9, 1:1000;CD81, 1:1000;アポア1, 1:1000;ゴルギン84、1:1000;フロティリン-1、1:1000;カベオリン-1、1:1000;PGD, 1:1000;PKM2, 1:1000;β-アクチン、1:3000)を4°Cで一晩放置した。
9. メンブレンを洗浄バッファー(2 LのPBS溶液に2 mLのトゥイーンを加えた)で4回(各回15分)洗浄し、メンブレンを適切な二次抗体とともに1:4000でRTで1時間撹拌しながらインキュベートします。
10. 洗浄バッファーでメンブレンを4回(各回15分)洗浄し、化学発光キットとゲルイメージングシステムを使用してメンブレンをイメージングします(材料の表を参照)。

実験ワークフローによれば、末梢血および固形組織からEVを抽出することができます(図1)。8週齢のマウスの上顎骨は約0.1±0.05gであり、マウスから約300μLの血漿を採取することができる。プロトコルステップに従って、それぞれ0.3 mgおよび3 μgのEVを収集できます。TEMとNTAで分析したように、EVの典型的な形態学的特徴は、直径50〜300 nmの範囲の丸いカップ状の膜小胞です(図2)。FCは、膜色素標識されたEVを有用なコントロール下で検出することができ、FC分析は、親細胞に由来することを示唆するEVに発現する特定の膜マーカーの割合を示しています(図3)。ウェスタンブロット解析では、血漿EVおよび骨EV中のタンパク質含量の代表としてPGDおよびPKM2の発現をそれぞれ示し、代謝状態を示しています(図4)。EVにおけるGolgin84の陰性発現は、原形質膜由来の大型EV(マイクロベシクル)に一般的に富むミトフィリン、α-アクチニン-4、フロチリン-1、カベオリン-1、およびβ-アクチンの存在によっても検出されます。小さなEVマーカーCD9も検出できますが、CD81の発現は低いか存在しないため、血漿EVにはApoa1が存在しません(図4)。

図1:EVを抽出するためのプロトコルの図。 (A)末梢血漿EVを差動遠心分離で抽出する手順。(B)示差遠心分離で組織EVを抽出するステップ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:EVの形態同定 (A)EVの形態を示す代表的な透過型電子顕微鏡(TEM)画像。スケールバー= 200 nm。(B)代表的なナノ粒子追跡解析(NTA)画像と定量結果は、EVのサイズ分布と粒子数を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:EVの起源分析 。 (A)実験の異なるコントロールを持つ異なるチューブのセット。(B)1μm、0.5μm、0.2μmサイズのビーズの分布をスキャットグラフで示した。(C)PBS(チューブA)、EVの単純染色(チューブB)、膜色素の単純染色(チューブC)、およびEVサンプル(チューブD)の二重染色を示す代表的な密度グラフ。(D)血漿中のCD18陽性EVの割合のフローサイトメトリー分析(赤色)と黒色の二次抗体のみコントロールの比較。(E)赤の骨サンプルからのOSCAR陽性EVの割合のフローサイトメトリー分析と、黒色の二次抗体のみのコントロール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:EVのタンパク質含量分析 。 (A)血漿EVにおける6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(PGD)およびミトフィリン、α-アクチニン-4、CD9、フロチリン-1、カベオリン-1、およびβ-アクチンの存在、およびCD81、Golgin84、およびApoa1の陰性発現を示す血漿EV画像の代表的なウェスタンブロット。(B)骨EVにおけるピルビン酸キナーゼM2(PKM2)およびミトフィリン、α-アクチニン-4、CD9、CD81、フロチリン-1、カベオリン-1、およびβ-アクチンの存在、およびGolgin84の陰性発現を示す骨EVの代表的なウェスタンブロット画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:BCAアッセイの標準作業溶液。 表に示すように、0.5 mg/mLのBSAと0.9%のNSを3つの複製ウェルに追加します。

著者は開示する利益相反を持っていません。