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方法論記事

筋肉損傷のリスクを低減したマウスにおける用量調整されたレジスタンストレーニング

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DOI:

10.3791/64000

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2022年8月31日

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1Physical Therapy Program, Department of Health Care Sciences, Eugene Applebaum College of Pharmacy and Health Sciences, Wayne State University, 2Department of Pharmacology, University of Nevada, Reno School of Medicine

この記事について

サマリー

本プロトコルは、マウスなどの小動物で行われる精密リハビリテーション研究に組み込むことができる、用量調整レジスタンストレーニング(DART)と呼ばれる独自の技術について説明しています。

要約

漸進的レジスタンストレーニング(PRT)は、徐々に大きな外部負荷に対して筋肉収縮を行うことを含み、健康な個人および患者集団の筋肉量と筋力を増加させる可能性があります。小動物および大型動物のモデルに関する前臨床試験では、筋肉量と筋力を維持および/または回復するためのPRTの安全性と有効性をテストするための精密リハビリテーションツールが必要です。この記事で説明されているPRT方法論とデバイスを使用して、投与量調整レジスタンストレーニング(DART)を実行できます。DARTデバイスは、マウスの足首背屈筋によって生成される同心円収縮トルクを客観的に評価するためのスタンドアロンダイナモメータとして使用することも、既存の等速性ダイナモメトリーシステムに追加することもできます。DARTデバイスは、この作業で提供される指示とオープンソースの3Dプリントファイルに基づいて、標準の3Dプリンターで製造できます。この記事では、四肢帯筋ジストロフィー2B/R2型(BLAJマウス)のマウスモデルにおいて、DARTの1回の発作によって引き起こされる収縮誘発性筋肉損傷と、同等の等尺性収縮(ISOM)によって引き起こされる筋肉損傷を比較する研究のワークフローについても説明します。8匹のBLAJマウス(各条件に4匹)のデータから、前脛骨筋(TA)の10%未満がDARTまたはISOMの1回の発作で損傷を受け、DARTはISOMよりも損傷が少ないことが示唆されています。

概要

運動は骨格筋に多くの健康上の利点をもたらします(Vina et al.1でレビューされています)。具体的には、漸進的に大きな外部負荷(バーベル、ダンベル、ケーブルプーリーウェイト回路など)に対して筋肉収縮を行うことを含むプログレッシブレジスタンストレーニング(PRT)は、健康な個人と患者集団の両方で筋肉量と筋力を増加させるのに役立つことが知られています(以前の出版物でレビュー2,3).PRTは過負荷原理に基づいており、筋肉が徐々に大きな外部負荷に対して収縮すると、生理学的断面積と力を生み出す能力を増やすことによって適応すると述べています4。げっ歯類におけるPRTの既存のモデルには、尾に抵抗を加えたはしご登り、アンタゴニストからの抵抗に対するアゴニスト筋の共収縮、加重ハーネスでの走行、電気ショックによって引き起こされるしゃがむ運動、および抵抗された車輪走行が含まれます5,6,7,8,9,10(以前の出版物でレビュー11,12).しかし、現在、ヒトの臨床研究および実践で使用されるPRTの方法およびデバイスによく似た、マウスで筋肉を標的とし、投与量を調整したPRTを正確に実行するための研究ツールはありません12,13。これは、マウスの基礎および前臨床試験において正確に投与されたPRTの安全性および有効性を研究する研究者の能力を制限する。

この障壁を克服するために、この研究では、現代の体育館のレジスタンストレーニング機器で採用されているケーブルプーリーウェイト回路設計に基づいて、PRT方法論とデバイスを開発します14,15,16。PRTのこの方法は、投与量調整レジスタンストレーニング(DART)と呼ばれ、デバイスはDARTデバイスと呼ばれます。精密リハビリテーショントレーニングツールとしての機能に加えて、DARTデバイスは、マウスの前脛骨筋(TA)によって生成される可能性のある最大同心円収縮トルクを客観的に評価するためのスタンドアロン機器としても使用でき、1回の繰り返しの最大(1RM、良好なフォームを維持しながら1回だけ正常に持ち上げ/移動/押圧/しゃがむことができる最大負荷)が人間で評価される方法と同様に17、18.DARTデバイスは、カスタムビルドまたは市販の等速性ダイナモメータと組み合わせて、マウスのTA筋肉によって生成されるピーク等尺性テタニック力(ヒトの最大随意収縮[MVC]に匹敵)を測定し、ピーク破傷風力(例えば、ピーク力の50%)に基づく抵抗で用量調整PRTを実行することもできる。

この記事では、DARTデバイスの構造について説明し、収縮トルクを評価してDARTを実行するために、以前の出版物19、20、21、22に記載されているカスタムビルドの動力計と組み合わせる方法について説明します。この研究では、DARTデバイスを使用して、DARTの1回の発作(50%1RMの同心円状に偏った収縮の4セット)によって引き起こされる運動誘発性筋肉損傷と、等尺性収縮の同等の発作(4セットの10等尺性収縮)によって引き起こされる損傷を比較する方法についても説明します 四肢帯筋ジストロフィー2B型(LGMD2B、 またはLGMDR2)23,24。研究されたマウスモデルには、有害な偏心収縮後の遅発性筋肉損傷から骨格筋を保護するのに重要な役割を果たすジスフェリンと呼ばれるタンパク質が欠けています22,25,26,27,28,29,30.また、ジスフェリン欠損の雄マウスでは、同心円状に偏った強制運動は偏心的に偏った強制運動ほど有害ではなく、同心円状に偏ったトレーニングへの以前の曝露が、その後の偏心偏った収縮の発作からの損傷に対する保護を提供することが実証されています22。現在の研究は、用量調整された同心円状に偏ったレジスタンストレーニングを実行する際の現在のDART方法論とデバイスの実現可能性をテストするために実施されたため、DARTデバイスからの新しいデータを以前のデータと比較するための調査のためにオスのジスフェリン欠損マウスが選択されました。将来の研究では、雌のBLAJマウスが生物学的変数としての性別の影響を研究するために含まれます DARTへの反応に関連して。すでに多くの筋肉群にジストロフィー変化があり、すでに筋力低下と消耗があり、筋肉量と筋力を維持するためのリハビリテーションケアを求めている患者の筋肉がいる可能性のある病態生理学的状態をモデル化しているため、~1.5歳のマウスが研究されました26。

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プロトコル

この記事に記載されている実験は、実験動物の世話と使用のためのガイド(1996年、National Academy Press、2101 Constitution Ave. NW、Washington、DC 20055、USA)に従って、米国ミシガン州デトロイトのウェイン州立大学の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されました。B6.LGMD2B/R2をモデルとしたA-Dysfprmd/GeneJマウス(別名BLAJマウス、雄、~1.5歳)を本研究に用いた。マウスは市販の供給源から入手した( 材料表参照)。

1.研究デザイン

  1. 研究の質問に関連するマウス系統を選択します—例:研究B6。A-Dysfprmd/GeneJマウス(BLAJマウス)は、同心円状に偏ったDARTがLGMD2B/R2をモデル化するマウスに広範な筋肉損傷を誘発するかどうかという質問に答えようとする場合。
  2. 研究デザインに基づいてマウスを研究グループに割り当てます-たとえば、マウスを用量調整されたレジスタンストレーニング(DART)グループまたは等尺性トレーニンググループ(ISOM)にランダムに割り当て、同腹仔および/または年齢によるマッチングに基づいて、グループのバランスを可能な限り試みます(例: 表1)。

2. DARTデバイスの製作

  1. 以下の手順に従って、適切なコンピュータ支援(CAD)ソフトウェア(図1)を使用してDARTデバイスコンポーネントを設計します。
    1. 低摩擦ホイールベアリング用の設計ハウジング(ピローブロックベアリングの設計に基づく 材料表を参照)を内蔵した分度器(足首関節角度を測定するためのゴニオメーターとして使用)。
    2. ホイールベアリングハウジングと分度器用のタワーを設計します。
    3. マウスの足を配置するためのフットプレートを設計します。フットプレートをホイールベアリングに接続する車軸を設計します。
  2. 適切な3DプリンタでDARTデバイスコンポーネントを製造します(図1)。
    1. CADソフトウェアで作成したデザインを光造形(.STL 拡張子) ファイルを作成します。
      注: .STLファイル(補足コーディングファイル1〜4)は、この記事の対応する著者にクレジットを与え、この記事を引用することによって使用および変更できます。
    2. を開きます。適切なスライスソフトウェアを含むSTLファイル( 材料表を参照)。
      注:スライスソフトウェアは、仮想3Dモデルをスライスのスタックに変換し、3Dプリンターで順番に印刷して3Dオブジェクトを生成できます。
    3. スライシングソフトウェアを使用して、G-CODEコンピュータ支援製造(CAM、.GCODE拡張子)ファイルは、使用する3Dプリンターとフィラメントに固有のものです。
    4. 3Dプリンタのマニュアル( 材料表を参照)に従って、DARTデバイスコンポーネントをで印刷します。GCODE ファイルにエクスポートします。
    5. ポリ乳酸(PLA)1.75 mm 1 kg /スプール、グレーなどの適切な3Dプリンターフィラメントを選択します(材料の表を参照)。
  3. 以下の手順に従ってDARTデバイスを組み立てます。
    1. 608低摩擦ホイールベアリング(8ステンレス鋼に収容された窒化ケイ素セラミックボールを備えたものなど、ボア直径22mm、外径420mm、 材料表を参照)をホイールベアリングハウジングに挿入します(図1)。
    2. 車軸をホイールベアリングのボアに挿入します(図1)。
    3. PLAの接着に適した接着剤( 材料表を参照)を使用してフットプレートを車軸に貼り付けます(図1)。
    4. ホイールベアリングハウジングタワーの上にホイールベアリングハウジングを配置し、アセンブリ全体をネジ留め具でアクリルベースに取り付けます(図1)。
      注意: アクリルベースには特定のサイズ要件はなく、動物とDARTデバイスを収容するのに十分な大きさで、作業面に収まるほど小さい必要があります。本研究に用いたアクリルベースは、幅約30cm、長さ約45cm、厚さ0.5cmである。

3. DARTまたはISOM用のマウスの調製

  1. ストレスと痛みを軽減するために、適切な麻酔システムを介して送達された吸入イソフルランを使用して、各マウスを全身麻酔下に置きます( 材料の表を参照、誘導の場合は2%〜5%、維持の場合は1%〜4%、効果があります)。.
    1. 麻酔システムの誘導室(2%〜5%イソフルラン)に麻酔を誘発する。
    2. マウスをノーズコーンに移し、動物(1%〜4%イソフルラン)の手順を実行している間、麻酔を維持します。ピンセットからつま先をつまむまで後肢の離脱がないことに基づいて麻酔の有効性を確認します。
    3. 等温ゲル加熱パッドと、マウスの~1 m上に配置したヒートランプなどを使用して、熱サポートを提供します。温度計で確認して、アクリルベースの上および周囲の温度が~38°Cに維持され、マウスが過熱しないことを確認します。
  2. マウスの左前脛骨筋(TA)と左後肢の前部および外側の側面全体にDARTまたはISOM用の皮膚を準備します。
    1. 脱毛クリーム(脱毛クリーム、 材料の表を参照)でマウスの毛皮を取り除きます。脱毛クリームを塗り、~2分間作用させます。
    2. 蒸留水に浸したワイプで脚をきれいにして、毛皮と残っているクリームをすべて皮膚から取り除きます。脱毛クリームは、マウスの皮膚に長期間放置すると、皮膚を刺激したり損傷したりする可能性があるため、完全に除去されます。
    3. 毛皮を除去した後、ポビドンヨードスクラブ液や70%エタノールなどの承認されたスクラブ方法で皮膚を消毒します。
  3. 目と脱毛した皮膚を乾燥から保護するために、清潔な綿棒で目と脱毛した皮膚に保護剤(ワセリンなど)を塗布します。
  4. 脛骨骨端に安定化ピンを置きます。
    1. 脛骨に5%リドカインクリームを塗り、その部分を麻痺させます。
    2. 26 G、半インチの滅菌皮下注射針を、脛骨の近位部分の最も広い部分(つまり、脛骨骨骨幹端、脛骨頭としても知られています)に通します。安定化ピンが固定されたら、滅菌止血剤で針を保持し、プラスチック部分を折れるまで曲げて、皮下注射針のプラスチック部分を取り外します。
  5. DARTまたはISOMトレーニング用にマウスを配置します。
    1. マウスを仰臥位に置きます。麻酔を維持するために、マウスがノーズコーンにしっかりと接続されていることを確認してください。
    2. 先端が滅菌されたピンセットを使用して、脛骨ピンの端がワニ口クランプによって保持されるように、脛骨ピンを金属製のワニ口クリップ( 材料の表を参照)に送ります。ワニ口クランプの調整可能なアームを動かして、マウスの足がDARTデバイスのフットプレートに配置されていることを確認します。
    3. マウスの足を粘着性の実験用テープでDARTデバイスのフットプレートにストラップで固定します。
    4. マウスの脛骨の長軸に対してマウスの足を90°の角度で配置します。正しく配置すると、フットプレートはアクリルベース(つまり、床または水平面と見なされるもの)に垂直になります。
    5. フットプレートを、DARTデバイスの分度器に事前に開けられた穴に18 G、1.5インチの長さの皮下注射針を入れて作成した足底屈止具に置きます(図1)。

4. DARTまたはISOMトレーニング

  1. マウスの膝関節の下外側側面にバイポーラ、経皮的、神経筋電気刺激(NMES、 材料表を参照)電極を配置することにより、電極配置を最適化します(図1B)。
    1. 実験室の電気刺激装置からの単一パルス(1 Hz)を使用して( 材料の表を参照)、足首背屈筋に運動神経支配を提供する坐骨神経の腓骨枝を刺激します(図1B)。
    2. 前脛骨筋(TA)は、足首背屈筋によって生成される総収縮力の90%以上を占めるため31、TA筋の腹と腱を観察して、電気的に誘発されたけいれん収縮の証拠を探します。
      注意: 腓骨に対応するわずかな骨の隆起は、テスターが電極を通してそれを感じることができれば、電極の配置に役立つ可能性があります。これには、最適な電極配置の感触をつかむために、テスター側での練習と学習が必要です。
    3. 足が脛骨に直交する位置(90°)から足底屈の20°に相当する分度器の穴に足底屈止口を移動します—これは、TA筋からの最大収縮トルクが以前の報告に基づいて典型的に観察される位置です21。これは、研究されているマウスに固有の要因に基づいて、ユーザーがカスタマイズする必要がある場合があります。
    4. DARTデバイスのフットプレートをダイナモメーターのフットプレートにリンクすることにより、マウスダイナモメーターでけいれんトルクを視覚化します—たとえば、DARTデバイスのフットプレートを非弾性シルク縫合糸を備えたカスタムビルドのロボット足首ダイナモメーターフットプレートにリンクし( 図1Aと同様)、縫合糸をダイナモメーターのフットプレートにストラップで固定します( 材料の表を参照)。
      注意: フットプレートには、3Dプリントデザインに組み込まれた穴があります。フットプレートのつま先端から2列目にある一対の穴に縫合糸を配置すると、縫合糸は背屈/足底屈の軸から~20mmに配置されます(図1A、B)。この動力計は、以前の報告19、20、21、22に記載されている。
  2. NMES刺激装置からの電圧出力を最適化します。
    1. 電極の配置を最適化した後、電気刺激装置から出力される電圧の振幅を最適化します—これは、NMESを総腓骨神経とTA筋に限定し、足底屈筋の共収縮を誘発するリスクを減らすために必要です。
      注:共収縮が誘発された場合、それらはダイナモメーターからのトルク出力によって視覚化することができ、つま先の足底屈曲にも見られます。
  3. NMESスティミュレーターをDARTまたはISOMトレーニングに設定します。
    注:次の設定は、研究対象のマウスに固有の要因と研究の目的に基づいて、ユーザーがカスタマイズする必要がある場合があります。
    1. 周波数が125Hzの繰り返しパルス列を生成するように刺激装置を設定します—この周波数は、BLAJマウス21の他の筋肉群へのNMESのオーバーフローなしに最大の融合破傷風収縮を生成します。これを行うには、パルス周波数(125 Hz)、列車の持続時間(500 ms)、および毎秒の列車(1列車/秒)のダイヤルを調整し、パルス列を繰り返すためのトグルスイッチをオンにします。
    2. パルス列の間に500ミリ秒の休憩が散在する持続時間500ミリ秒のパルス列を生成するように刺激装置を設定します。
    3. 足底屈部ストップを、脛骨の長軸に対して160°に対応する分度器の穴に移動します(脛骨に直交する足から70°足底屈)。これは、BLAJマウスの足を軟部組織抵抗なしに受動的に動かすことができる位置である21。
    4. DARTの場合、TA筋が同心円状に機能しなければならない適切な抵抗を適用します—たとえば、 図1A、Bに示すように5 g。 補足ファイル1の重量からトルクへの検量線を参照してください。
    5. DARTデバイスのフットプレートに結び付けられた非弾性シルク縫合糸でおもりを吊るして抵抗を適用します(図1A、B)。
    6. 抵抗を調整します-つまり、1回の繰り返しの最大(1RM)の~50%を適用します(たとえば、マウスが1回の収縮で最大重量10 gを持ち上げることができる場合は5 g)、足を利用可能な背屈のアクティブな範囲の少なくとも半分に引っ張ります。
    7. DARTグループに割り当てられたマウスで適切なDARTトレーニングを実行します—たとえば、ヒトで使用される漸進的レジスタンストレーニングプログラムと同様に、セット間に2分間の休息を伴う同心円収縮の10回の繰り返しを4セット含むDARTトレーニングの1回の試合を実行します32 ( 補足ビデオ1を参照)。
    8. ISOMグループに割り当てられたマウスで適切なISOMトレーニングを実行します—たとえば、DARTと同様に、セット間に2分間の休息をとって、アイソメトリック収縮を10回繰り返す4セットのISOMトレーニングを1回実行します( 補足ビデオ2を参照)。
    9. ISOMトレーニングでは、マウスの足を脛骨の長軸に対して160°(脛骨に直交する足から70°の足底屈曲)に配置し、シルク縫合糸をロボット動力計のフットプレートにテープで留めてこの静的位置を維持します。
      注意: 縫合糸はスライドできないため、DARTデバイスのフットプレートは背屈に移動できず、背屈筋が等尺性に収縮するように拘束されます。

5. マウスの術後ケア

  1. 運動した後肢の適切な衛生状態を維持し、針部位の痛みを軽減するための予防策を講じてください。
    1. DARTまたはISOMトレーニングの後、脛骨ピンの可視部分をトリプル抗生物質軟膏(400 U / gのバシトラシン、3.5 mg / gのネオマイシン、および5000 U / gのポリミキシン-B、 材料の表を参照)でコーティングし、脛骨の内側からピンを注意深く引き出します。外側の大腿部と上肢の皮膚をポビドンヨードと滅菌水ですすいでください。脛骨に5%リドカインクリームを塗り、針の部位の痛みを抑えます。
  2. マウスが麻酔から回復するのを待ちます。
    1. マウスをノーズコーンから取り外し、寝具のない回復ケージで麻酔から回復させます。マウスが麻酔から回復している間、等温ゲル加熱パッドなどでマウスに熱サポートを提供します。
  3. 麻酔から完全に回復した後、マウスを元のケージに戻します。その後、ケージを動物施設に戻し、フォローアップ実験が行われるまで研究用マウスを収容します。マウスを毎日監視します。

6.組織収集

  1. マウスのTA筋肉全体を採取し、以下の手順に従って凍結保存のためにスナップフリーズします。
    1. 研究の質問に基づいて、トレーニング後の適切な時間(例:.、DARTまたはISOMの3日後)、承認されたプロトコルに従ってマウスを安楽死させます。
      注:本研究では、マウスは全身麻酔下で頸部脱臼によって安楽死させました(吸入イソフルラン、効果が2%〜5%)。.両側開胸術は死を確実にした。
    2. マウスの後肢を解剖して、運動したTA筋(左)と運動していないTA筋(右)を取り除きます。収穫した筋肉の重さを量ります。次に、凍結保護のために各筋肉を鉱油に浸し、筋肉を清潔なラボワイプに置いて余分な油21を吸い取ります。
  2. アルミホイルの上に筋肉を置きます。ホイルの端を長い止血剤で持ち、適切なプラスチック容器に含まれる液体窒素にホイルと筋肉をすばやく浸して、筋肉をスナップフリーズさせます。
    1. 液体窒素に約2分間浸漬した後、凍結した筋肉を標識された極低温バイアルに移します。バイアルは、さらなる研究に必要になるまで-80°Cの冷凍庫に保管してください。

7. 筋肉組織の組織学的研究

  1. 厚さ5μmのTA筋のクライオスタット切片を準備します。クライオスタット切片を帯電した顕微鏡スライドに集めます。-30°Cに冷たく保たれたアセトンで切片を固定し、切片を風乾させます。
  2. 筋肉組織切片をヘマトキシリンとそれに続くエオジンで染色する(H&E染色、 材料表を参照)。
    1. 切片をガラス染色ジャー内のヘマトキシリン(濃い青色の核染色)に5分間浸します。それ以上の水の青みが見られなくなるまで切片を水道水ですすいで余分なヘマトキシリンを取り除きます。
    2. 切片をガラス瓶のブルーイング試薬に5分間浸します。ガラス吸引ピペットで切片から余分なブルーイング試薬を吸引します。
    3. 切片をガラス染色ジャーのエオジン(ピンク色の細胞質染色)に5分間浸します。ガラス染色ジャー内の95%エタノールに切片を素早く繰り返し(~10回)浸漬して、余分なエオジンを除去します。
    4. 切片を風乾させ、光学顕微鏡で視覚化します。
  3. 顕微鏡イメージングにより、TA筋断面全体の高解像度タイル画像を作成します。
    注意: ユーザーは、顕微鏡および画像取得および分析ソフトウェアに基づいて、後続のイメージングおよび画像分析手順をカスタマイズする必要がある場合があります。
    1. 光学顕微鏡の10倍対物レンズと顕微鏡に取り付けられたデジタルカメラでデジタル画像をキャプチャします。
    2. 約15〜20枚の画像をキャプチャし、各筋肉の断面に沿ってグリッド状に移動し、新しい画像が前の画像と~25%重なるようにします。
      注:このプロセスは、デジタルタイリング(画像スティッチングとも呼ばれます)できる一連の画像をキャプチャして、TA筋断面全体の高解像度合成画像を作成するのに役立ちます(図2)。
    3. デジタル画像を に保存します。TIFF 形式でエクスポートします。
    4. 適切な画像処理および解析ソフトウェアでデジタル画像を開きます( 材料表を参照)。
    5. 次の手順で、個々の画像をTA筋肉全体の合成画像に並べて表示またはステッチします。 ソフトウェアで各TA筋肉の個々の重なり合う画像をすべて開いた状態で、[ファイル]をクリックします > [自動化]を選択します> [ フォトマージ]を選択します > [コラージュ]を選択します > [開いているファイルの追加]を選択します> [OK] をクリックします。
    6. TA筋の新しいタイル/ステッチ画像が準備されて表示されたら、画像をに保存します。さらなる分析のためのTIFFフォーマット。
  4. 適切な画像解析ソフトウェアを使用して、TA筋全体のタイル画像を視覚的に分析することにより、筋肉の損傷を定量化します。
    1. 画像解析ソフトウェアで、[解析]メニューの [ 測定 ] 機能を選択して、TA筋断面全体の面積の概要を説明して測定します(図2)。
    2. 画像解析ソフトウェアで、解析メニューの測定機能を選択して、損傷している各TA筋の領域、すなわち、筋線維の細胞質破壊、筋線維の不在、および炎症性細胞浸潤を示す領域を概説して測定します22(図2)。
    3. 損傷の総面積の合計をTA筋断面積全体の百分率で表す(図2、表2)。

8. 統計分析

  1. 表1〜3に示すようにデータを整理し、適切なソフトウェアを使用して、対応のないT検定(正規性と同次分散の検定に合格した場合)33またはマンホイットニー順位和検定(正規性と同次分散の検定に合格しない場合)21を実行します(材料表を参照)。

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結果

BLAJの雄マウス(1~1.5歳)を研究した。BLAJマウスは、ヒトの筋肉疾患LGMD2B / R2をモデル化しています。これらのマウスは、偏心筋収縮の単回発作からの遅発性筋肉損傷に特に感受性である22、29。したがって、BLAJマウスは、TA筋が同心円状に偏った方法で働かなければならない抵抗を正確に調整することによって、DARTが無害な方法で実行できるかどうかを知るためにこれらの研究に選ばれました。DARTがBLAJマウスに有害ではないことが判明した場合、DARTは非傷害性レジスタンストレーニングの一形態として有用であり、単独で、または再生医療、遺伝学的、薬理学的、およびその他の介入の補助として適用できます。

BLAJマウスの年齢および体重は、DART群とISOM群の間で密接に一致した(表1)。3日目(~72時間)に、1回のトレーニングの後、運動したTA筋はDART群とISOM群の両方で低レベルの損傷(<10%損傷領域)を示...

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ディスカッション

この記事では、投与量調整レジスタンストレーニング(DART)と呼ばれる一種の精密リハビリテーショントレーニングを実行するためのデバイスを構築する方法について、段階的な手順を説明します。この研究では、DARTの1回の発作の3日後の筋肉損傷(DARTグループ)と同等の等尺性トレーニングの3日後の損傷(ISOMグループ)を比較するためのトレーニング研究におけるDARTデバイスと方法論の適用についても説明しています。

プロトコルの重要なステップは、DARTデバイス34,35の適切な構築、DARTまたはISOMトレーニングの実行に伴う正確なステップ、筋肉組織の適切な採取と凍結保存、クライオスタットによる筋肉組織の適切な切片化、およびヘマトキシリンとエオシンによる筋肉断面の適切な染色22,36です。.具体的には、DARTデバイスを構築するには、部品を正確な寸法と...

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開示事項

著者は競合する金銭的利益を持っていません。

謝辞

この研究は、Jain Foundation Inc.からの助成金、NICHDからのR03HD091648、NIH P2CHD086843に基づくAR3Tからのパイロット助成金、ウェイン州立大学のEACPHSからのFRAP賞、ウェイン州立大学の教員スタートアップパッケージ、および1R01AR079884-01(Peter L. Jones PI)からJARへの下請け契約によって資金提供されました。この研究は、JMB、MEP、およびJARに対する米国理学療法士協会-ミシガン(APTA-MI)の研究助成金からも資金提供されました。著者らは、レヌカ・ローチ博士(ミシガン州イースタンミシガン大学准教授)が原稿を批判的に読み、フィードバックを提供してくれたことを認めています。著者らは、3Dプリンティングに関するアドバイスを提供してくれたAnselm D. Motha氏を認めています。著者らは、https://www.jain-foundation.org/patient-physician-resources/patient-stories ジャイナ教財団のウェブサイトでストーリーを共有してくれたジスフェリノパチーの患者、特に運動の経験に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AnMiao Star 608 セラミックボールベアリングAnmiao Star (N/A)AMS127高精度、低摩擦ホイールベアリング。 メーカーとモデルが市販されていない場合は、608低摩擦ホイールベアリングの代替バージョン、ボア径8 mm、 外径22mm、420ステンレス鋼ハウジングに窒化ケイ素セラミックボールを入れるだけで十分です。ホイールベアリングの過剰な摩擦は、DARTデバイスの性能に悪影響を及ぼし、筋肉の収縮に対する全体的な抵抗を増加させます。
Axio Scope.A1カールツァイス(ピーボディ、マサチューセッツ州)製品 #Axio Scope.A1光と蛍光の顕微鏡
B6。A-Dysfprmd/GeneJ (別名 BLAJ マウス)ジャクソン研究所 (メイン州バーハーバー)ジャイナ教財団がジスフェリンを研究する協力者のために維持している特別なコロニー。ストック#012767ヒトの四肢ガードル筋ジストロフィー2B/R2型をモデル化するジスフェリン欠損マウス。
バイポーラ、経皮的、神経筋電気刺激(NMES)電極ハーバード装置、ホリストン、マサチューセッツ州 BS4 50–6824NMES用電極 この電極が市販されていない場合は、代替品について責任著者にお問い合わせください。
Coplin 染色皿ThermoFisher (マサチューセッツ州ウォルサム)カタログ番号 S17495ヘマトキシリンおよびエオシン用皿/瓶の染色皿/瓶 (H&E)セクション
Cura4.4.1の染色。SoftwareUltimaker、ユトレヒト、オランダUltimaker Cura 4.4.1.光造形ファイルをG-CODEファイルに変換するスライシングソフト
Deltaphase 等温ゲル加熱パッドBraintree Scientific (Braintree, MA)Item #39DPHeating pad to provide thermal support to animals while under annesthesion
Eosin YMillipore Sigma (Burlington, MA)HT110132-1LPink cytoplasmic stain
Gorilla Super GlueCompany (Cincinnati, OH)Gorilla Super Glue Micro PrecisionCyanoacrylate adhesive to bond PLA components
ヘマトキシリン溶液、Gill No.3Millipore Sigma (マサチューセッツ州バーリントン)GHS332-1L核用ダークブルーステイン
HM525NX クライオスタットThermoFisher (マサチューセッツ州ウォルサム)Catalogue #HM525NXCryostat to make frozen sections of muscle
Lab Wipes. Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-PlyThermoFisher (Waltham, MA)カタログNo. 06-666. メーカー#34120用ワイプは、スナップ凍結やその他の目的のために筋肉組織から鉱物油を吸い取ります。
Labview 2014National Instruments, Austin, Texas, USALabview 2014ダイナモメータを操作し、NMESスティミュレータをトリガするカスタムメイドのプログラム/ルーチン用のソフトウェアです。
液体窒素HDPEデュワーフラスコThermoFisher(マサチューセッツ州ウォルサム)S34074B. Thermo Scientific 41502000/EMDスナップ凍結筋肉または他の組織のための液体窒素を保持するフラスコ
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金属ワニ口クリップJINSHANGTOPK (ウェブベースのビジネス)24個 51mm 金属ワニ口クリップ スプリングクランプ脛骨ピンを保持するスプリングクランプ
マイクスコープスライドグローブサイエンティフィック (ニュージャージー州マーワー)1354W. Diamond White Glass SlidesCharged microscope slides
Mineral OilThermoFisher (Waltham, MA)BP26291Mineral oil to cryoprotect muscle tissue before snap freezezing
Monoprice Premium 3D Printer Filament PLAMonoprice (Rancho Cucamonga, CA)#11778Premium 3D Printer Filament PLA 1.75mm 1 kg/spool, Gray. これは、デバイスのコンポーネントを3Dプリントするために使用される材料です。
Monoprice Select Mini V2 3DプリンターMonoprice(カリフォルニア州ランチョクカモンガ)デバイスコンポーネントのコンピューター支援製造用のMini V2 3D
NIH画像ソフトウェアNational Instritues of Health (NIH, Bethesda, MD)NIH Image for Windows損傷の面積を定量化するための画像処理および分析ソフトウェア。 NIH ImageはImage Jとしても知られています。
Photoshop CS4Adobe (カリフォルニア州サンノゼ)Creative Suite (CS4). Windows用64ビット版画像処理・解析ソフトウェアで、個々の重なり合うフィールドの画像から筋肉断面全体のタイル化/スティッチ画像を生成するために使用される
PSIU6刺激アイソレーションユニット GrassInstruments(ロードアイランド州ウェストワーウィック)PSIU6アイソレーションユニットNMES用アイソレーションユニット AMのモデル4100などの刺激装置には、刺激アイソロエーションユニット
Roboz 4-0シルクブラック編組縫合材料Roboz Surgical(メリーランド州ゲーサーズバーグ)Roboz Surgical SUT152縫合材料を使用して、DARTデバイスのフットプレートをダイナモメーターフットプレートまたは抵抗トレーニング用の抵抗
S48矩形パルス刺激装置グラスインスツルメンツ(ロードアイランド州ウェストワーウィック)S48刺激装置NMES用の実験室用電気刺激装置. この刺激装置が市販されていない場合は、AMシステムのモデル4100絶縁型高出力刺激装置が代替品になる可能性があります。詳細については、共著者のJonesにお問い合わせください。
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顕微鏡 実験室 3Dプリンター。筋肉に接続します軟

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