Method Article

インビトロで破骨細胞再吸収を可視化および定量するためのシンプルなピットアッセイプロトコル

DOI:

10.3791/64016

⸱

June 16th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Hospital Tübingen, 3Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro
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Summary

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ここでは、リン酸カルシウムコーティング細胞培養プレートを用いた再吸収ピットアッセイのための簡単で効果的なアッセイ手順を提示する。

Abstract

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成熟破骨細胞は、酸および酵素の分泌を介して骨を分解することができる多核細胞である。それらは様々な疾患(例えば、骨粗鬆症および骨癌)において重要な役割を果たし、したがって重要な研究対象である。 インビトロで、それらの活性は、再吸収ピットの形成によって分析することができる。このプロトコールでは、容易に可視化および定量化できるリン酸カルシウム(CaP)コーティング細胞培養プレートを用いた簡易ピットアッセイ法について記載する。ヒト末梢血単核球由来の破骨細胞前駆体(PBMC)を、破骨細胞形成刺激の存在下でコーティングプレート上で培養した。9日間のインキュベーション後、破骨細胞を固定し、蛍光イメージングのために染色し、一方、CaPコーティングをカルセインによって対比染色した。再吸収領域を定量化するために、プレート上のCaPコーティングを5%AgNO3 で染色し、明視野画像によって可視化した。再吸収ピット面積をImageJを用いて定量した。

Introduction

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破骨細胞(OC)は、造血幹細胞(HSC)に由来する組織特異的マクロファージであり、骨芽細胞1とともに骨リモデリングにおいて極めて重要な役割を果たしている。骨を全身的または局所的に破壊する性ホルモン誘発性、免疫学的、および悪性骨障害は、閉経関連骨粗鬆症2、関節リウマチ3、歯周病4、骨髄腫骨疾患5、および骨溶解性骨転移6を含む過剰な破骨活動によるものである。対照的に、OC形成および機能の欠陥もまた、骨ペトロシス7を引き起こし得る。HSCは、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF、遺伝子記号ACP5)刺激下でOC前駆細胞に分化する。M−CSFおよびNF−κBリガンドの受容体アクチベーター(RANKL、遺伝子記号TNFSF11)の両方の存在下で、OC前駆細胞はさらに単核OCに分化し、続いて融合して多核OC8、9、10になる。サイトカインM-CSFおよびRANKLはいずれも、カルシトニン受容体(CT)、核因子κBの受容体活....

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Protocol

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このプロトコルは、地元の倫理委員会(承認番号287/2020B02)によってレビューされ、承認されました。

リン酸カルシウム被覆細胞培養プレートの作製

  1. カルシウム原液の調製(トリス緩衝液中で25 mM CaCl 2·2H2O、1.37 mM NaCl、15 mM MgCl2·6H2O)
    1. 1.0 M トリス緩衝液を調製し、1 M HCl を使用して pH を 7.4 に調整します。
    2. マグネチックスターラー上にガラスビーカーを設置し、100mLの1.0Mトリス緩衝液を加える。
    3. 0.368gのCaCl2・2H2O、8.0gのNaCl、0.305gのMgCl2・6H2Oの計量を行い、トリス緩衝液に1つずつ溶解する。
    4. 1 M HClを使用してpHを7.4に調整し、室温で保存します。
  2. リン酸塩原液の調製(11.H2O、トリス緩衝液中の42mMNaHCO3)
    1. マグネチックスターラー上にガラスビーカーを設置し、100mLの1.0Mトリス緩....

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Results

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細胞培養プレートの底部へのリン酸カルシウムコーティングを、3日間の事前石灰化工程と1日間の石灰化工程とを含む2つのコーティング工程で行った。 図1に示すように、96穴プレートの底部に均一に分布したリン酸カルシウムが得られた。このコーティングは、洗浄工程を行った後に底部に非常によく付着した。

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図1:96ウェル細胞培養プレート上のリン酸カルシウムコーティングの代表的な明視野画像。 コーティングは、3日間の事前石灰化工程と1日間の石灰化工程とを含む2つのコーティング工程で行った。スケール バーは 200 μm を表します。

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Discussion

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ここでは、PBMCsから インビトロで 誘導および拡張されたOCsを用いた破骨細胞再吸収アッセイのための簡単で信頼性の高い方法を説明する。使用されるCaPコーティング細胞培養プレートは、ラボで利用可能な材料を使用して簡単に調製および視覚化することができます。このプロトコールで採用された未選別PBMCに加えて、マウス単球細胞21 および骨髄マクロファージ細胞17 から生成されたOCも、ピットアッセイのために同様の合成基質上で培養されており、したがって、これらの細胞源は、対応する文献を参照してこのアプローチに移動することができる。

このプロトコルでは、高価な市販のアッセイプレートの代わりに、ラボ内で作製された単純なCaPコーティングを使用しました。骨スライスと象牙質スライスは、再吸収ピットアッセイのための2つの一般的で手頃な価格の再吸収可能な材料ですが、入手可能性と複雑な調製は大きな欠点です。簡単に調製できる合成基材として、CaPコーティングは2つの元の材料よりも便利で容易.......

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Disclosures

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著者らは開示するものは何もありません。

Acknowledgements

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この研究は、中国奨学金評議会[CSC No. 201808440394]によって部分的に資金提供されました。W.C.はCSCから資金提供を受けた。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgNO3SERVA Electrophoresis GmbH35110硝酸銀
a-MEMGibco32561-029MEM α、GlutaMAX、ヌクレオシドなし
アムホテリシンBバイオクロム03-028-1Bアムホテリシン B 溶液
CaCl2Sigma-Aldrich21097-50G塩化カルシウム二水和物
CalceinSigma-AldrichC0875Calcein
FBSSigma-AldrichF7524ウシ胎児血清
FicollCytiva17144002Ficoll Paque Plus
Fixation bufferBiolegend420801パラホルムアルデヒド
HClMerk1.09057.1000塩酸
Hoechst 33342PromokinePK-CA707-40046Hoechst 33342
M-CSFPeproTech300-25組換えヒト M-CSF
MgCl2Sigma-Aldrich7791-18-6塩化マグネシウム
Na2HPO4AppliChem GmbHA2943,0250二ナトリウムリン酸水素無水
NaClMerkS7653-250G塩化ナトリウム
NaHCO3>MerkK15322429ソーダ
PBSロンザ17-512Fダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水(1X)、カルシウムとマグネシウムを含まないDBPS
ペン-連鎖球菌ロンザDE17-602Eペニシリン-ストレプトマイシン混合物
ファロイジン-アレクサフロー546InvitrogenA22283アレクサフロー546ファロイジン
RANKLPeproTech310-01組換えヒト sRANK リガンド (E.coli 由来)
TrisSigma-Aldrich93362Tris(ヒドロキシメチル)アミノメサン
Triton X-100Sigma-AldrichT8787アルキルフェニル ポリエチレングリコール
TrypLE ExpressGibco12605010 組換え細胞解離酵素
の重炭酸塩

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
  2. Moller, A. M. J., et al. Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone....

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Pit AssayOsteoclastic ResorptionCalcium Phosphate CoatingOsteoclast DifferentiationPBMC IsolationResorption Pit QuantificationVon Kossa StainingFluorescence ImagingM CSF RANKLImageJ Analysis

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