1分子研究のためのデュアル光ピンセットとマイクロ流体工学の使用

サマリー

マイクロ流体チャンバーを介して研究される視覚的な単一分子生化学は、ガラスバレル、気密シリンジ、チューブとフローセルへのチューブの安定した接続、およびシリンジとチューブの間に切り替えバルブを配置することによる気泡の除去を使用して大幅に促進されます。このプロトコルは、DNAトランザクションと分子間相互作用の視覚化を可能にするデュアルオプティカルトラップを記述します。

要約

視覚生化学は、バルク相研究で行われる平均化では不明瞭な単一酵素または酵素複合体の確率的特性を観察するための強力な手法です。視覚化を実現するために、一方のトラップが固定され、もう一方のトラップが可動であるデュアル光学ピンセットが、倒立蛍光顕微鏡のステージ上に配置されたマルチストリームマイクロ流体チャンバーの1つのチャネルに焦点を合わせられます。光ピンセットは、蛍光標識されたDNAの単一分子をトラップし、チャンバー内を流れてトラップされたビーズを通過し、DNAをB型(最小の力、つまり0 pN)に伸ばし、核酸は黒い背景に対して白いひもとして観察されます。DNA分子は、段階を流れに垂直に変換して、制御された方法で反応を開始できるようにすることで、ある流れから次の流れに移動します。成功を達成するために、光学的に透明なチャネルを備えたマイクロ流体デバイスは、シリンジポンプの所定の位置に保持されたガラスシリンジと嵌合されます。最適な結果を得るには、フローセルに恒久的に接着されたコネクタ、機械的に剛性があり耐薬品性があり、層流を妨げる気泡を除去するスイッチングバルブに接続されたチューブを使用します。

概要

タンパク質とDNAの相互作用を1分子レベルかつリアルタイムで可視化できることは、ゲノムの安定性に関する重要な洞察を提供しました^1,2。DNAの単一分子を一度に1つずつ扱うことに加えて、近くの個々の分子間のトランザクションを表示する機能は、追加の洞察を提供します^3,4,5。追加のDNA分子の操作には、追加の光学トラップと、高品質のマルチチャネルマイクロ流体フローセルの両方が必要です⁶。

複数の光トラップを生成するには、いくつかの方法があります。これらには、検流計走査ミラー、音響光学変調器、および回折光学系が含まれ、ホログラフィック光ピンセット⁴、^7、8、9を生成します。多くの場合、走査ミラーと音響光学変調器は、タイムシェアするトラップを生成します。ここで説明するセットアップでは....

プロトコル

1.ポリスチレンビーズによるレーザートラップの位置合わせとテスト

メモ: セットアップについては、 図1A、Bを参照してください。

注意: 実験者は、レーザービームの位置合わせ中に適切な保護眼鏡またはレーザー安全メガネを着用する必要があります。本明細書で説明する光ピンセットシステムはHeNeビームとIRビームの両方を使用するため、2セットのレーザー安全ガラス器具が必要です。

1. HeNeビームアライメント
   1. すべての光学部品をブレッドボードに配置します。ブレッドボードを、顕微鏡に対してできるだけ90°の角度に近づけるように位置合わせします。
   2. 対物レンズとテランレンズが入った相手チューブを顕微鏡に取り付けます(図1A-11,12)。
      注意: テランレンズは、接眼レンズの中間像面に画像を焦点合わせるために使用されるレンズシステムです。
   3. HeNeレーザーをオンにしてシャッターを開きます(図1A-18)。ビームは、光の50%をミラー5(

結果

トラップの位置合わせと強度の初期テストは、1 μmの非蛍光ポリスチレンビーズで行われます。実験室で行われる研究のほとんどは蛍光を使用しているため、1μmのドラゴングリーンポリスチレンビーズを使用してトラップ強度をさらにテストします(図1D、E)。その後、DNAをビスインターカレート色素YOYO-1で染色するDNAビーズ複合体の光学トラップに変わります^14,29。これらの複合体がマイクロ流体フローセルのカバーガラス表面から10〜15 μm上にトラップされると、ビーズを通過する流体の流れがDNAを伸ばします(図3B、C)。流体で引き伸ばされたDNAの長さを測定して、予想される長さであるB体の長さまで引き伸ばされていることを確認することが重要です。例えば、バクテリオファージラムダDNAの場合、全長は16μmよりわずかに長く、これは48,504.......

ディスカッション

フローシステムの慎重な組み立ては、実験^4,6の成功結果にとって重要です。プロトコルの最も困難な側面の1つは、ガラス表面へのコネクタの取り付けです。このために、圧入チューブコネクタとナノポートアセンブリの2つのアプローチを使用します。圧入コネクタはガラスに容易に接着し、鉗子を使用してPTFEチューブを事前に形成された穴に押し込みます。より安定した取り付けが必要な場合は、ナノポートアセンブリの接合が好ましい。慎重な使用と洗浄により、恒久的なアセンブリを備えた単一のガラスフローセルを1年以上使用できます。フローセルをより頻繁に切り替える必要がある場合は、PDMSフローセルが優れた安価な代替品であるため、使用できます。それらは再利用できますが、PDMSは膨潤しやすく、時間の経過とともに流体の流れの挙動が変化する可能性があります。

ガラスとPDMSの両方のフローセルは破壊できないわけではありません。実験室では、使用される最大流量は800μL/hです。これを毎日および/または長.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100倍対物	Leica	506318 または 506038	Oil Immersion Lens;イメージングとオプティカルトラッピングのみ。蛍光イメージングに最適化されたAPO対物レンズ
10倍対物レンズ	ライカ	506263	アライメント中にレーザービームスポットの位置を特定するために使用; フローセル内の焦点とX-Y位置を見つけるために使用
1mm蛍光ビーズ	Bangs Labs	FSDG004	タップ性能、焦点位置決定に使用
1mmポリスチレンビーズ	Bangs	Labs CPO1004	トラップ性能評価に使用され、ビオチン化分子への結合
63倍対物	レンズ ライカ	506081	アライメント中にレーザービームスポットの位置を特定し、フローセル内の焦点とX-y位置を見つけるために使用されます。100Xと同じ背部開口部径を持つため、光トラップに使用できます。油浸レンズ
アライメント	レーザーLumentum	1100シリーズ	肉眼で見える10mW HeNeレーザー 光学系の位置決めに使用
ビームアライメントカメラ	Amscope	MU303	ビーム位置のイメージングのためのシンプルで安価なソフトウェア制御カメラ
カメラ制御と画像キャプチャソフトウェア	浜松	HCImage	ラムダDG4の活動をカメラと調整し、迅速な波長切り替えを容易にする
;オルカフラッシュ4	浜松電機	c13440-20cu	CCDカメラ 単一分子実験のイメージング用
ビームアライメントカメラ用Cマウント	スポットイメージングソリューション	DE50CMT	アライメント中のレーザービームイメージングのためのカメラの最適な位置決めを提供します
カフラッシュ4カメラ			用CマウントIRブロッキングフィルターを所定の位置に保持するためのリテーナーリングがあります。これにより、光トラップからの反射IRビームが排除され、トラップされた物体のより鮮明なイメージングが容易になります。
Cy5  蛍光フィルターキューブ	Semrock	cy5-404a-lsc-zero	Lambda DG4と組み合わせて使用 Cy5のみ
Fitc-Txred  蛍光フィルターキューブ	Semrock	fitc/txred-2x-b-000	Lambda DG4と組み合わせて使用 FITC and TXRed
Fluidicsチューブ	Grace Bio	46004	を画像化PEEKの代替品としてのPTFEチューブ。一部のフローセルでうまく機能します。Grace Bio fitチューブコネクタを使用する場合、PDMSフローセルまたはグラスフローセルで使用できます
GFP蛍光フィルターキューブ	Semrock	gfp-3035b-lsc-zero	Lambda DG4と組み合わせて使用 GFPのみ
イメージング ガラスフローセル	Translume	Custom	イメージング用のクリアフローチャネル(図2E)
ガラス接着剤	ロックタイト	233841	Nanoportアセンブリをガラスフローセルに確実かつ簡単に接着します
ガラス/PDMSサンドイッチフローセル	CIDRA精密サービス	カスタムデザイン	お客様の仕様に合わせて作られたフローセル、イメージングチャンネルはクリアです(図2C)
ハミルトン クリーニングソリューション	ハミルトン	18311	グラスフローセル用の優しく効率的なクリーニングソリューションで、慎重に使用しても泡立ちません
照明システム	サッターインスツルメント	ラムダ DG4	販売終了 ラムダ721
ミネーションシステム	サッター機器	ラムダ DG4	販売終了 ラムダ721
を推奨 画像解析ソフトウェア	メディアサイバネティクス	Image Pro Premiere	単一分子トラッキング
画像解析ソフトウェア	フィジー/NIH 画像/画像J	シェアウェア	画像と単一分子トラッキングの解析
画像ディスプレイカード	Melles Griot	06 DLA 001	Thorlabs からの代替製品: VRC5
液浸油	ツァイス	444960	イマーソール 518 F 蛍光フリー
レーザービームアライメントツール	トールラボ	FMP05/M; dgo5-1500-h1;BHM1	梁が水平で正しい高さにあることを確認するために使用されます
レーザービームビューア	カナダのフォトニクスラボ	IR 3150	ミラー上のIRビームスポットの画像化に使用され、  ターゲット
レーザーパワーメーター			レーザー出力の測定だけでなく、トラップ強度
レーザー安全メガネ(HeNe)	トールラボ	LG7または8	>波長>600nmの光の3 OD単位
レーザー安全メガネ(IR)	トールラボ	LG11	波長³の光の>7 OD単位をブロックします。1000 nm
Mcherry  蛍光フィルターキューブ	Semrock	mcherry-a-lsc-zero	Lambda DG4と組み合わせて使用 mcherry のみの画像化に使用
	顕微鏡 Leica	DMIRE2	DIC ポートを取り外してダイクロイックトラッピング/アライメントミラー
顕微鏡制御ソフトウェア	UCSF/shareware	uManager	顕微鏡を制御し、対物レンズの焦点アライメントとステージ制御を可能にします
ナノポートアセンブリ	IDEX	N333	フローセルに接着されたコネクタ
光学テーブルサポート	トールラボ	PA52502	アクティブアイソレーションテーブルサポート
光学系とレンズ	ソーラー TII	各種	干渉ミラー、望遠鏡、レンズは、システム
PDMSフローセル	ufluidix	カスタム	フローセルは、あなたの仕様に応じて構築するために設計されています。イメージングチャネルはクリアです(図2BおよびD)
PEEKチューブ	IDEX	1532	、フローセルとスイッチングバルブピン
ケル蛍光フィルターキューブ	Semrock	lf488/543/635-3x-a-000	に優れた接続を提供しますLambda DG4と組み合わせて使用し、複数の蛍光色素を迅速に画像化
圧入チューブコネクタ	GraceBio	46003	ガラスによく結合する接着剤付き透明シリコンコネクタ
スキャニングミラー	GSI Lumonics	VM500	第2の光トラップの制御に使用されます。GSI Lumonics は存在しなくなりました。ケンブリッジの科学的な段階から同様のミラーを購入することができます
	ライカ
ステージマイクロメーター	電子顕微鏡科学	68042-08	ビームとシステムキャリブレーションの位置決めのためのスクリーン定規を提供します
スイッチングバルブ	IDEX	V-101T	流体の流れの方向を制御し、フローセルへの気泡の導入を排除し
シリンジとバルブマニホールド	機械工場	なし	カスタムメイド
シリンジポンプ	ハーバード装置	PHD 2000	フローセルを通る流体の流れを制御
シリンジポンプソフトウェア	ハーバード Apparatus	70-6000	Flow 制御は、流体の流れのシームレスでプログラム可能な制御を提供します
シリン	ジ ハミルトン	81320	気密性、PTFE ルアーロック、ガラスバレルテフロンコーティングされたプランジャー
テーブルトップ	トールラボ	T36H	光学式テーブルトップまたはブレッドボード
トラッピングレーザー	ニューポート/スペクトラフィジックス	Jシリーズ;BL106C	Nd:YAGレーザー 1064 nm; 5Wレーザー

レンズ カメラ オルのイル 画像解析とブロック はます