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方法論記事

DNAアッセンブル技術を用いたアデノウイルスベクターの構築

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DOI：

10.3791/64033

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2022年6月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NHC Key Laboratory of Medical Virology and Viral Diseases, State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 2Laboratory of Infection and Virology, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University, Key Laboratory of Major Diseases in Children, Ministry of Education, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, National Center for Children’s Health, 3Henan Chemical Technician College, 4Research Unit of Critical Infection in Childre, Chinese Academy of Medical Sciences, 5Chinese Academy of Sciences Joint Research Center for Emerging Infectious Diseases and Biosafety, Chinese Center for Disease Control and Prevention-Wuhan Institute of Virology

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本研究では、ヒトアデノウイルス7型(HAdV-7)の感染性クローンを構築し、この感染性クローンを改変することでE3欠失HAdV-7ベクターシステムを確立しました。ここで用いるこの戦略は、他の野生型アデノウイルスから遺伝子導入ベクターを作製するために一般化することができます。

要約

アデノウイルスベクターは、30年以上にわたり、遺伝子治療における遺伝子導入ツールとして使用されてきました。ここでは、野生型HAdV-7のゲノムDNAをDNAアセンブリ法を用いて操作し、アデノウイルスベクターを構築するプロトコールを紹介する。まず、カナマイシン耐性遺伝子と複製元(Kan-Ori)からなるプラスミド骨格由来のPCR産物とウイルスゲノムDNAを融合させることにより、HAdV-7の感染性クローンであるpKan-Ad7をDNAアセンブリにより作製しました。これは、5'末端にHAdV-7逆末端反復配列(ITR)の末端配列の~25ヌクレオチドを含む一対のPCRプライマーを設計し、中央にHAdV-7ゲノムの非カッター制限酵素部位を、3'末端にPCRプライミング用のテンプレート特異的配列を含有させることによって行われました。次に、中間プラスミドベースの戦略を採用して、E3領域を感染性クローンの導入遺伝子発現要素に置き換えて、アデノウイルスベクターを作製しました。簡単に説明すると、pKan-Ad7をデュアルカッター制限酵素Hpa Iで消化し、E3領域を含むフラグメントをギブソンアセンブリによりプラスミド骨格の別のPCR産物にライゲーションして、中間プラスミドpKan-Ad7HpaIを構築しました。便宜上、制限アセンブリを使用して、制限酵素酵素とアセンブリを組み合わせたプラスミドクローニング法を指定しました。制限アセンブリを用いて、pKan-Ad7HpaIのE3遺伝子を緑色蛍光タンパク質(GFP)発現カセットに置換し、修飾されたE3領域を中間プラスミドから放出して感染性クローンに復元し、アデノウイルスプラスミドpKAd7-E3GFPを作製しました。最後に、pKAd7-E3GFPはPme I消化によって直鎖化され、組換えHAdV-7ウイルスをレスキューするためのHEK293パッケージング細胞のトランスフェクションに使用されました。結論として、ここでは、分子生物学の一般的な実験室で、特殊な材料や機器を必要とせずにアデノウイルスベクターを構築するためのDNAアセンブリベースの戦略を紹介しました。

概要

過去30年間で、組換えアデノウイルスベクターは、高い遺伝子導入効率、宿主ゲノムへの非組み込み、操作ウイルスゲノム、大規模生産の容易さなどの優れた生物学的特性により、ワクチン開発や遺伝子治療1,2,3,4、および基礎研究で広く使用されてきました。

現在、最も一般的に使用されているアデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス5(HAdV-5)5,6に基づいて構築されています。HAdV-5ベクター媒介形質導入は有望な結果をもたらしますが、前臨床および臨床応用では、いくつかの欠点が明らかになっています(例えば、ヒト集団内の既存の抗ベクター免疫が高いこと、コクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体(CAR)を欠く細胞では形質導入効率が低いことなど)。これらの問題を回避するために、他のヒトまたは哺乳類のアデノウイルス3,7,8型に基づくベクターを構築することに大きな関心が寄せられています。

これまで、アデノウイルスベクターを構築する最も一般的な方法は、細菌の相同組換えです5。このような細菌株は、リコンビナーゼを発現する必要があり、それがそれらが持つプラスミドの安定性または増幅に影響を与える可能性があります。一部の株は市販されていません。最近、細菌の人工染色体、直接クローニング、または直接DNA集合などの他の原理に基づく方法が、アデノウイルスまたは組換えアデノウイルスベクター9,10,11,12の感染性クローンを生成するために採用されている。しかし、これらの方法は、この分野での経験がほとんどない研究者にとってはやや不親切です。

2018年、アデノウイルス感染性クローンを構築するプロセスは、ギブソンアセンブリ13を介してプラスミド骨格を運ぶPCR産物とウイルスゲノムを直接ライゲーションすることにより、実験室で簡素化されました。その後、制限消化法とギブソンアセンブリ法を組み合わせて、既存のアデノウイルスプラスミド14,15,16,17,18に導入遺伝子をロードする。便宜上、制限酵素消化とギブソン集合を組み合わせた方法を指すために、以下、制限集合を用いる。さらに、制限集合体19を用いて感染性クローンからアデノウイルスベクターを構築するための戦略が開発された。制限集合の本質は、プラスミドから切り出されたフラグメントをDNA集合反応に可能な限り含めることであり、一方、短いPCR産物はプラスミド修飾のリンカーまたはパッチとして機能します。同時に、含まれるフラグメントの数は可能な限り少なく保たれます。このような努力は、その見返りを反映しています。PCRやDNAアセンブリによる望ましくない突然変異の可能性を最小限に抑えることができ、成功率を向上させることができます。結論として、野生型アデノウイルスからアデノウイルスベクターへのパイプラインが研究室13,14,15,16,17,18,19に設置された。

本稿では、HAdV-7感染性クローンとE3欠失複製コンピテントHAdV-7ベクターの構築例を挙げて、これらの手法を紹介することを試みたい。

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プロトコル

注:アデノウイルスはバイオセーフティレベル2(BSL-2)に分類されます。ウイルスを使用するためのすべてのステップは、バイオセーフティレベル2の実験室で行われました。野生型HAdV-7は、2017年に北京小児病院20で急性呼吸器感染症で入院した生後10ヶ月の乳児の上咽頭吸引標本から分離されました。ウイルスストックは-80°Cで保存しました。

1. HAdV-7ゲノムDNAの抽出

  1. 5 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)と10%ウシ胎児血清(FBS)を含む1つのT-25フラスコにHEK293細胞2.0 x 106 を播種し、加湿雰囲気で37°Cで培養し、5%CO2を添加します。細胞は80%〜90%がコンフルエントで、18〜24時間で感染する準備ができている必要があります。
  2. 細胞に野生型HAdV-7を2時間接種します。ウイルス含有培地を吸引して除去し、2%FBSを含む新鮮なDMEMを5mL細胞に加えます。
  3. 改変Hirt法によるウイルスゲノムDNAの抽出21
    1. 感染後2〜3日で、細胞の50%〜90%に細胞変性効果(CPE)が観察された場合は、培養上清を廃棄し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を一度すすぎます。
      注:細胞変性効果(CPE)は、ウイルス感染細胞が丸まり、膨潤し、培養フラスコから緩く付着または分離してブドウ様クラスターになる現象として定義される22。
    2. 25 mM Tris-HCl、0.5 mM EDTA、50 μg/mLプロテアーゼK、および0.8% SDS(pH7.6)を含む1.0 mLの溶解バッファーで、フラスコ内の細胞を氷上で5分間溶解します。ライセートを1.5 mLの微量遠心チューブに移し、チューブを50°Cの水浴で30分間インキュベートします。
    3. 120 μLの沈殿バッファーをチューブに加えます。穏やかに混合した後、チューブをさらに30分間氷の上に置きます。
      注:沈殿バッファーは、3 M CsCl、1 M K酢酸、および0.67 M酢酸で構成されています。これは、遠心分離後にウイルスゲノムを上清に保持しながら、細胞の破片と細胞の染色体DNAを沈殿させるのに役立ちます。
    4. チューブを15,000 x g 、4°Cで25分間遠心分離し、上清(約1.1 mL)を15 mLのポリプロピレンチューブに移します。
    5. 氷冷した無水エタノール2.2mLをチューブに加えます。穏やかに混ぜ、チューブを氷の上に15分間置きます。室温で2000 x g で5分間遠心分離します。
    6. 上清を慎重に吸引し、沈殿物(ウイルスゲノムDNA)を800μLの70%エタノールで一度洗浄します。チューブを室温で15,000 x g で6分間遠心分離します。上清を捨て、底のDNAペレットを風乾します。DNAペレットを過度に乾燥させないでください。
    7. ペレットを 200 μL の TE バッファー (10 mM Tris-HCl、pH 8.0、0.1 mM EDTA) に溶解し、1 μL の RNase A (10 mg/mL) を加えて、チューブを 37 °C で 15 分間インキュベートします。市販のゲノムDNAクリーン濃縮キットを使用して、溶解したDNAを精製します( 材料の表を参照)。
      注:実験室で一般的に使用される方法でウイルスゲノムDNAを定量します。一般に、アデノウイルスに感染したHEK293細胞のT-25フラスコで1〜5μgのゲノムDNAを取得できます。

2. DNA集合体によるHAdV-7感染性クローンの構築

  1. プラスミド骨格を増幅するためのPCRプライマーを設計します(図1)。DNAアセンブリに必要なオーバーラップ配列をPCRプライマーの5'末端に加えます。さらに、HAdV-7ゲノムの両端に非カッター制限部位(Pme I部位など)を含めて、感染性クローンからウイルスゲノムを放出するのを助けます。
    注:抗生物質耐性遺伝子と複製起源を含むプラスミド骨格は、PCRによって増幅され、HAdV-7ゲノムに融合されます。アデノウイルスは、環状アデノウイルスプラスミドの代わりに直鎖状ウイルスゲノムを使用すると、より効率的に包装細胞から救出できます。上記の要素を考慮した後、プライマーは 図1に示すように設計されます。
  2. pShuttle-CMVをテンプレートとして、Ad7KanF1およびAd7KanR1のプライマーを用いて、カナマイシン耐性遺伝子(Kan)およびpBR322起源(Ori)を含むフラグメント(Kan-Ori)をPCRして増幅します(表S1)。PCR反応を次のように設定します:98°Cで30秒間1サイクル、次に98°Cで8秒間の変性を5サイクル、68°Cで30秒間のアニーリング、72°Cで90秒間の伸展、最後に98°Cで8秒間の変性を25サイクル、72°Cで2分間のアニーリングと伸展を行います。
  3. PCR産物を1%アガロースゲル中で電気泳動により泳動し、市販のDNAゲル回収キットを使用してフラグメントを精製します。
  4. 回収したKan-OriおよびHAdV-7のウイルスゲノムDNAを市販のDNAアセンブリマスターミックスに加えます。アセンブリ反応を総容量 20 μL で、ベクターとウイルスゲノム DNA のモル比を 1:2 に設定します。50°Cで1時間インキュベートします。
    注:1〜3 μLのベクター、7〜9 μLのウイルスゲノムDNA、および10 μLのDNAアセンブリマスターミックスで、合計20 μLの反応を設定します。
  5. ケミカルコンピテントな 大腸菌 TOP10細胞を10 μLのアセンブリ製品で熱ショックを使用して形質転換します。形質転換ミックスをカナマイシン含有(50 μg/mL)Luria-Bertani(LB-Kan)プレートに広げます。プレートを37°Cで少なくとも12時間インキュベートします。
  6. 5 mLのLB-Kan培地にそれぞれ少なくとも3つのクローンを37°Cで12時間、穏やかに振とう(200-250 rpm)して接種します。市販のプラスミドMiniprep Kitを使用してプラスミドDNAを抽出します。
  7. 制限エンドヌクレアーゼを使用してプラスミドを消化し、アガロースゲル電気泳動でDNA断片のサイズを確認します(図2A)。さらに、シーケンシングによって融合部位を確認します。正しいアセンブリプラスミドはpKan-Ad7と名付けられています。
  8. 正しいクローンから100 mLの細菌培養物を増殖させます。市販のPlasmid Maxprep Kitを使用して、マキシプラスミド調製物を抽出します。

3. 中間体プラスミドの in silico 構築と修飾

注:一般的に、中間プラスミドを構築する必要があり、理想的な中間プラスミドをどのように構築するかが重要なステップです。中間プラスミドの設計には、pDRAW32(フリーソフトウェア、www.acaclone.com で入手可能)などの制限酵素モジュールを備えたDNA解析ソフトウェアが必要です。

  1. pKan-Ad7のDNA配列をpDRAW32にインポートし、プラスミドマップを描画します。マップ上の対象地域にアノテーションを付けます。pKan-Ad7については、E1、E3領域、およびプラスミド骨格(Kan-Ori)にアノテーションを施しました。
  2. pDRAW32プログラムを操作します。最初に [設定]>[酵素選択 ]をクリックし、次に [最小/最大カット]をクリックします。「最小」ボックスに1を入力し、「最大」ボックスに2を入力し、シーケンス全体で前のボックスにチェックを入れます。最後に、[ OK ]をクリックして、マップ上に一意のデュアルカッター制限酵素サイトを表示します。
    注:通常、6 bp以上の配列を認識する制限酵素のみが選択されます。 図3Aに示すように、17個の酵素が酵素選択基準に一致します。
  3. E3 が変更される予定であるため、E3 領域に隣接する最初の制限サイトについて考えてみます。Hpa I、Sal I、Avr II-Mlu I、Spe Iは要件を満たしました。
    注:この実験では、pKan-Ad7の消化によりE3領域を持つ最短のフラグメントが生成され、より小さな中間プラスミドが将来の修飾を容易にするため、Hpa Iが選択されます。Sal Iサイトの選択にも利点があります-このような中間プラスミドは、E1およびE3領域の両方の修飾に適しています(図S1)。
  4. 中間プラスミドpKan-Ad7HpaIの両方のDNA鎖を表示する最終配列ファイルを作成します。この仮想配列は、オーバーラップするプライマーを設計するためのテンプレートとして使用できます。
    1. E3領域を含む2つのHpa I制限サイト間の配列をコピーします。その後のアセンブルでは、各~20 bpの配列(Tmが48°C以上)をHpa I制限部位(図3C、オーバーラップ-ファイナル1およびオーバーラップ-ファイナル2)の外部にコピーする必要があります。
    2. 上記配列の両端にPme Iの認識配列(図3C、gtttaaac)を付加する。
    3. 抗生物質耐性遺伝子と複製起点を含むバックボーンプラスミドの配列(図3C、Kan-Ori)をPme I制限部位の外側に追加します。
    4. 最終配列をpDRAW32にインポートして、プラスミドマップを描画します。マップ上の E3 地域にアノテーションを付けます。
    5. pDRAW32プログラムを操作します。最初に [設定]>[酵素選択 ]をクリックし、 次に[最小/最大カット]をクリックします。「最小」と「最大」の両方のボックスに1を入力し、全体の順序で前のボックスにチェックを入れます。最後に 「OK 」をクリックして、マップ上にユニークな制限酵素部位を表示します。E3改造用のユニークなカッターが多数用意されていることがわかります。
      注:この実験では、BstZ17 IとMlu Iを部分的なE3の置換に選択します。デュアルカッターも便利です。例えば、オーバーラップエクステンションPCRを使用して、デュアルカッターSsp Iと独自のカッターBssH IIを組み合わせ、E3領域全体の置換に選択することができます。
  5. 仮想配列を中間プラスミド構築のテンプレートとして使用してプライマーを設計します(図3C)。
    注:各プライマーの長さを短くするために、4つのプライマーが設計されました。Ad7HpaIF1およびAd7HpaIR1のプライマーで増幅されたPCR産物は、Ad7HpaIF2およびAd7HpaIR2のプライマーを含む最終的なPCRフラグメントを得るためのテンプレートとして使用されます(図3C)。

4. HEK293細胞における感染性組換えアデノウイルスのレスキュー

注:この記事で生成された3つのアデノウイルスは、すべて次のプロトコルに従ってレスキューされます。

    5. E3欠失HAdV-7ゲノムプラスミドの構築

    注:HAdV-7のゲノム長は35,239 bpで、E3領域はゲノムの27,354 bpから31,057 bpの間に位置しています。中間プラスミドを構築するには、感染性クローンプラスミド上に2つの切断部位を持つエンドヌクレアーゼ、またはプラスミド上に1つの切断部位を持つ2つのエンドヌクレアーゼを見つけます。Hpa I、Sal I、または Avr II と Mlu I が利用可能です。BstZ17 I (28,312 bp) と Mlu I (30,757 bp) の間の配列は削除され、CMV-GFP-PA カセットまたは CMV-mCherry-PA カセットに置き換えられます。

    1. pKan-Ad7 600 ngをHpa Iで消化し、ゲル電気泳動後、DNAゲル回収キットを用いて、大きな断片pKAd7-HpaI-FL(~30 kb)と小さな断片pKAd7-HpaI-FS(~7 kb)をそれぞれ精製します。pKAd7-HpaI-FLは-20°Cで保存してください。
    2. pShuttle-CMVをテンプレートとして、Ad7HpaIF1およびAd7HpaIR1のプライマー(表S1)を用いて、KanおよびOriを含むフラグメントをPCRで増幅します。Ad7HpaIF2およびAd7HpaIR2のプライマーでKan-Ori2を増幅するためのPCR反応の2回目のラウンドのテンプレートとして使用するPCR産物(2541 bp)を回収して希釈します。
      1. PCR産物(2584 bp)を1%アガロースゲルで電気泳動により分離した後、精製します。PCR反応を次のように設定します:98°Cで30秒間1サイクル、次に98°Cで8秒間の変性を30サイクル行い、72°Cで2分間アニーリングと伸長を行います。
        注:Kan-Ori2の中央部分は、KanとOriを含む断片であり、その後に小さな断片pKAd7-HpaI-FS(例えば、Pme I)には存在しない固有の制限エンドヌクレアーゼの配列、および大きな断片pKAd7-HpaI-FLとの重複領域が続きます。最も外側の配列は、小さなフラグメントpKAd7-HpaI-FSとのオーバーラップ領域です。
    3. PCR産物Kan-Ori2とステップ5.1で回収したpKAd7-HpaI-FSをDNAアセンブリマスターミックスに加えます。50°Cで1時間インキュベートします。手順2.4〜2.6に従います。正しいプラスミドはpKan-Ad7HpaI(~10 kb)と名付けられます。
    4. Ad7E3GFPF1およびAd7E3GFPR1のプライマーを含むpShuttle-GFP23 をテンプレートとして使用して、CMVプロモーター、GFP CDS、およびSV40 polyAシグナル(PA)を含むCMV-GFP-PAフラグメント(~1.7 kb)を増幅します(表S1)。1%アガロースゲルで電気泳動により分離した後、PCR産物(1650 bp)を精製します。
      注:BstZ17 IおよびMlu Iで分解されたpKan-Ad7HpaIでアセンブルできるオーバーラップ領域をプライマーに含める必要があり、プラスミドpKan-Ad7には存在しない固有の制限部位(Sbf Iなど)をプライマーに添加して、さらなる制限アセンブリを行います。
    5. pKan-Ad7HpaI 300 ng を BstZ17 I および Mlu I で消化し、1% アガロースゲルで電気泳動により分離した後、7.3 kb のフラグメントを精製します (E3 領域の大部分は欠失しています)。回収した7.3 kbのフラグメントと回収したCMV-GFP-PAフラグメント(~1.6 kb)をDNA Assembly Master Mixに加えます。手順 2.4 から 2.6 に従います。正しいプラスミドはpKAd7-E3GFP(~9 kb)と命名されます。
      注:BstZ17 IとMlu Iの間のすべての配列はE3領域に属します。
    6. pKAd7-HE3GFP 300 ng を Pme I で消化し、ゲル電気泳動後に DNA ゲル回収キットを使用して大きなフラグメント (~6.4 kb) を精製します。精製したフラグメントとステップ5.1で回収したpKAd7-HpaI-FLをDNA Assembly Master Mixに加えます。50°Cで1時間インキュベートします。手順2.4〜2.6に従います。正しいプラスミドはpKAd7-E3GFPと命名されます。
    7. セクション3で説明したように、HEK293細胞にPme I直鎖化pKAd7-E3GFPをトランスフェクションします。レスキューされたアデノウイルスはAd7-E3GFPと名付けられました。
    8. Ad7E3CHEF1およびAd7E3CHER1のプライマーを含むpKFAV4-CX19Aをテンプレートとして使用して、CMVプロモーター、mCherry CDS、およびSV40 polyAシグナルを含むCMV-mCherry-PAフラグメント(~1.6 kb)を増幅します。1%アガロースゲルで電気泳動により分離した後、PCR産物を精製します。
    9. pKAd7-E3GFP600 ngをSbf Iで消化し、~35 kbのフラグメントを精製します。35 kb フラグメントと回収した CMV-mCherry-PA フラグメントを DNA Assembly Master Mix に添加します。50°Cで1時間インキュベートします。手順 2.4 から 2.6 に従います。正しいプラスミドはpKAd7-E3CHEと名付けられます。
    10. セクション3で説明したように、HEK293細胞にPme I直鎖化pKAd7-E3CHEをトランスフェクションします。救助されたアデノウイルスはAd7-E3CHEと名付けられました。

    6. HEK293細胞における組換えアデノウイルスの増幅と精製

    1. 直径150 mmのTC処理培養皿8枚で増殖させたHEK293細胞の80%-90%コンフルエント単層にアデノウイルスを接種します。37°Cで2時間、軽度の撹拌下でインキュベートします。上清を2%FBSを含む25mLのDMEMと交換します。
    2. 細胞を37°Cで2〜3日間インキュベートします。
      1. CPEが大部分の細胞に影響を与える場合は、直径150mmの8つの皿の上清のほとんどを廃棄します。最終溶出量が~6.0 mLのセルリフターを使用して、感染した細胞を15 mLのポリプロピレンチューブに採取します。
      2. 細胞を3回の凍結融解サイクルで破壊し、ウイルスを放出します。ライセートを1200 x g 、室温で12分間遠心分離して透明化します。ウイルスを含む上清を収集します。
    3. 上清にMgCl2 (0.1 mM)およびベンゾナーゼヌクレアーゼ(50 U/mL)を添加します。37°Cで40分間穏やかに渦巻きます。 上清にNaCl(600 mM)を加え、37°Cでさらに40分間穏やかにボルテックスします。 室温で1200 x g で12分間遠心分離します。ウイルス含有上清を採取して精製します。
    4. 1.35 g/mL、1.30 g/mL、1.25 g/mL の異なる濃度の塩化セシウム(CsCl)を 10 mM Tris-HCl で調製します。
      1. ピペットを使用して 5.1 mL Ultra-Clear チューブの底に 0.8 mL の 1.35 g/mL CsCl 溶液を加え、1 つ目の溶液の上に 0.8 mL の 1.30 g/mL CsCl 溶液と 0.8 mL の 1.25 g/mL CsCl 溶液を順次ゆっくりと加えます。
      2. 最後に、ステップ 6.3 で回収した上清 ~2.5 mL を 1.25 g/mL CsCl 溶液の上に慎重に重ね、10 mM Tris-HCl を使用してチューブを上から 2-3 mm まで満たします。
    5. スイングバケットローターで200,000 x g 、8°Cで2時間遠心分離し、加速と減速を遅くして、無傷のウイルス粒子と欠陥のあるウイルス粒子を分離します。
      注:遠心分離後、CsCl溶液中にいくつかの白いバンドがはっきりと見えます。
    6. ピペットを使用して空の粒子のバンドと細胞破片の層を慎重に除去し、2mLのシリンジを使用して成熟ウイルスを含む最も低いバンドを回収します。
    7. 回収したウイルス懸濁液を20 K MWCO透析カセットに移し、10 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1 mM MgCl2、および2%グリセロール(pH 8.0)を含む透析緩衝液中で4°Cで一晩透析します。
      1. 10 mM Tris-Cl、150 mM NaCl、1 mM MgCl2、および5%グリセロール(pH 8.0)を含む透析バッファーを翌日交換し、4°Cで5時間透析します。
      2. 透析したウイルス粒子を2mLシリンジで回収します。所望の少量(20-200 μL)の複数のアリコートを調製し、精製したウイルスを-80°Cで保存します。
        注:精製されたウイルスの粒子力価は、ゲノムDNAの含有量を測定することによって決定することができ、感染力価は、制限希釈アッセイでGFP陽性細胞をカウントすることにより、HEK293細胞で決定することができる。

    7. 制限酵素消化による組換えアデノウイルスゲノムの同定

    1. 1つのT-25フラスコで増殖したHEK293細胞の80%〜90%のコンフルエント単層に組換えアデノウイルスを感染させます。37°Cで2時間インキュベートします。 培地を2%FBSを含む新鮮なDMEMと交換します。
    2. CPEが2〜3日以内に発生した場合は、培養上清を除去し、ステップ1.3で説明した改変Hirt's法でウイルスゲノムDNAを抽出します。
    3. 遺伝子組換えアデノウイルスのゲノムDNAを指示された酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動で解析します。組換えアデノウイルスプラスミドは、コントロールとして機能しました。

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    結果

    HAdV-7の感染性クローンの構築戦略を 図1 と 図2に示します。2つの感染性クローンプラスミドを無作為に選択し、それぞれBstZ17 I、BamH I、およびEcoR Vによって同定しました。その結果、フラグメントが予想サイズと一致していることが示され(図 2A)、プラスミドが正しく構築されていることが示されました。Pme I直鎖状プラスミドをHEK293細胞にトランスフェクションしてから12日後に細胞内に彗星病巣が見られ(図2B)、ウイルスが成功裏に救助されたことを示しています。

    この研究では、例としてGFP(図4)またはmCherryを過剰発現させるために、E3欠失アデノウイルスベクターを作製しました。E3領域の修飾中に、中間プラスミドpKan-Ad7HpaI(

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    ディスカッション

    異なるアデノウイルスはさまざまな組織指向性を持ち、異なるアデノウイルスに対する宿主の既存の免疫の有病率は、ヒトで集中的に変動する可能性があり24、遺伝子治療またはワクチン開発のための新規アデノウイルスベクターの構築に関心を集めています。しかし、新しいアデノウイルスベクターシステムの確立は、分子生物学の一般的な研究室にとって依然として面倒なままです。

    ここでは、制限消化法およびギブソンアセンブリ技術13,14,15,16,17,18,19を用いて野生型アデノウイルスからベクターを生成するためのプロトコルを紹介した。

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    開示事項

    著者は、利益相反を宣言しません。

    謝辞

    この研究は、北京自然科学基金会(7204258)、中国国家自然科学基金会(82161138001、82072266)、CAMS Innovation Fund for Medical Sciences(2019-I2M-5-026)、および北京における必須呼吸器病原体の分子追跡に関する研究と応用、Capital Health Development and Research of Special(2021-1G-3012)から資金提供を受けました。

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    材料

    この記事で使用された材料の一覧
    名前会社カタログ番号コメント
    1.5mLポリプロピレン微量遠心チューブAxygenMCT-150-Cウイルスの保存
    15mLポリプロピレン遠心分離チューブCorning430790ウイルスの保存
    150 mm TC処理培養皿Corning430599HEK29E細胞の増殖
    20 K MWCO透析カセットThermoFisher Scientific66005ウイルス
    酢酸Amresco714DNA の抽出
    Afl IINEBR0520消化
    アガロース宝5260電気泳動
    Age INEBR0552消化
    Asc INEBR0558消化
    BamH INEBR0136消化
    ベンゾナーゼヌクレアーゼSigmaE8263-25KUウイルスの精製
    BsrG INEBR0575消化
    セルリフターCorning3008細胞を削り取る 
    CsClSigmaC3032ウイルス
    の精製 DNA ゲル回収キットZymoD4045DNA
    Dulbecco' の回収修正されたイーグル」S medium (DMEM)CytivaSH30022.01HEK293 cells medium
    E.coli TOP10 competent cellsTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.CB-104組立製品の変換
    EcoR VNEBR3195消化
    EDTAサーモフィッシャーサイエンティフィックR3104DNAの抽出
    ウシ胎児血清 (FBS)CytivaSV30208.02HEK293 細胞培養
    ゲノムDNA クリーンおよび濃縮キットZymoD4065
    グリセロールの精製上海マックリン生化学株式会社G810575ウイルスの透析
    HEK293細胞ATCCCRL-1573ウイルスの増幅
    高忠実度DNAポリメラーゼNEBM0491PCR
    Hind IIINEBR3104消化
    硫酸カナマイシンAmresco408プラスミド
    の選択 Kpn INEBR3142消化
    ラムダ/ヒンディーIII DNAマーカー宝3403電気泳動
    LBブロスBD240230LBプレート
    バクテリア用 LB培地 ソーラーバイオライフサイエンスL1010細菌用培地
    MgCl2Sigma63068ウイルスの透析
    微量遠心分離機サーモフィッシャーサイエンティフィックソルバル レジェンド マイクロDNAの21R
    NaClSigmaS5886ウイルスの透析
    Nde INEBR0111消化
    NEBuilder HiFi DNAアセンブリ マスターミックスNEBE2621DNAアセンブリ
    Nhe INEBR0131消化
    リン酸緩衝生理食塩水CytivaSH30256.01細胞
    の洗浄ピペットサーモフィッシャーサイエンティフィックマトリックスは、中程度の
    プラスミドMaxprepキットVigorous Biotechnology Beijing Co., Ltd.N001DNA
    プラスミドミニプレップキットTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.DP103DNA
    Pme INEBR0560消化
    酢酸カリウムAmresco698DNA
    プロテアーゼKThermo Fisher ScientificAM2542DNA
    pShuttle-CMVStratagene240007PCR template
    RNaseBeyotimeD7089DNAの抽出
    Sal INEBR0138Digestion
    Sbf INEBR3642Digestion
    SDSAmresco227DNAの抽出
    スイングバケットローターHITACHIS52STウイルスの精製
    T-25 細胞フラスコCorning430639HEK29E細胞の増殖
    T-75細胞フラスコCorning430641HEK29E細胞の増殖
    トランスフェクション試薬Polyplus-transfection114-15トランスフェクション
    透過型電子顕微鏡FEITECNAI 12ウイルスのオブセベーション
    Tris-HClAmresco234ウイルスの透析
    超遠心機日立ハイマック CS120GXIIウイルスの精製
    の透析 DNA抽出 を吸引します の抽出 の抽出

    参考文献

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