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方法論記事

新しい抗生物質をテストするための新しいハイスループット Ex Vivo ヒツジ皮膚創傷モデル

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DOI:

10.3791/64041

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2022年9月16日

 ,  , 
1Sheffield Collaboratorium for Antimicrobial Resistance and Biofilms (SCARAB), University of Sheffield, 2Department of Chemical and Biological Engineering, University of Sheffield

この記事について

サマリー

プロトコルは、黄色ブドウ球菌に感染したex vivoヒツジ創傷皮膚モデルをセットアップするための段階的な方法を説明しています。このハイスループットモデルは、従来の微生物学技術と比較してin vivoでの感染をよりよくシミュレートし、新しい抗菌薬の有効性をテストするための生理学的に関連するプラットフォームを研究者に提供します。

要約

抗菌薬の開発は費用のかかるプロセスであり、成功率はますます低くなっているため、抗菌薬発見研究へのさらなる投資はそれほど魅力的ではありません。抗菌薬の発見とその後の商品化は、研究者が医薬品の設計と処方をより細かく制御できるリード最適化段階でフェイルファストアンドフェイルチープアプローチを実装できれば、より収益性の高いものにすることができます。この記事では、黄色ブドウ球菌に感染したex vivoヒツジ創傷皮膚モデルのセットアップについて説明しますが、これはシンプルで費用効果が高く、スループットが高く、再現性があります。モデルの細菌生理機能は、感染中の細菌増殖が病原体の組織を損傷する能力に依存することを模倣しています。創傷感染の確立は、接種材料と比較して生存細菌数の増加によって検証される。このモデルは、リード最適化段階で新しい抗菌薬の有効性をテストするためのプラットフォームとして使用できます。このモデルの利用可能性は、抗菌薬を開発する研究者にフェイルファストアンドフェイルチープモデルを提供し、その後の動物試験の成功率を高めるのに役立つと主張することができます。このモデルはまた、研究のための動物使用の削減と改良を促進し、最終的には皮膚および軟部組織感染症に対する新規抗菌剤の臨床へのより迅速かつ費用効果の高い翻訳を可能にします。

概要

皮膚感染症は重要な地球規模の問題であり、世界中の医療提供者に大きな経済的コストがかかります。病原体による多剤耐性およびバイオフィルム形成の発達は、非治癒性創傷の有病率において重要な役割を果たす1,2,3,4。この結果、皮膚軟部組織の感染症は、長期入院とその後の再入院の最も一般的な理由の1つです5。創傷治癒の遅れは、患者と医療提供者の両方にとってコストがかかり、米国では年間約650万人の患者が罹患していることを示唆する推定もあります。英国では、皮膚感染症とそれに関連する合併症により、年間約75,000人が死亡しています2,4,6。

黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌)は、患者の創傷から頻繁に単離される手ごわい創傷病原体である2、7。多剤耐性の出現率は2000年代に劇的に増加しました。この間、急性細菌性皮膚および皮膚構造感染症の約60%がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌1の培養陽性でした。ブドウ球菌、そして実際に他の病原体の間で過去20年以内に多剤耐性株の数が増加していることは、耐性を克服することができる新しい作用機序を備えた抗生物質の迅速な開発の緊急の必要性を示しています。

しかし、2000年代初頭以降、抗菌薬探索プログラムは、より長い開発期間と低い成功率によって支配されており、米国で臨床試験に入った新規抗菌薬のわずか17%が市場承認を達成しています8。これは、新興抗生物質のin vitro試験の結果とそれらの臨床転帰との間に格差があることを示唆しています。この格差は、in vitroの前臨床段階で抗生物質の有効性をテストする際のin vivo感染中および従来の微生物学的方法中の細菌生理機能の違いに大きく起因していると主張することができます。したがって、抗生物質発見プログラムの成功率を向上させるためには、感染中の細菌生理学をより代表する新しい実験室方法が必要です。

皮膚感染症を研究するための現在の方法には、生きた動物(マウスなど)、ex vivo皮膚モデル(ブタなど)、および3D組織工学皮膚モデル(ヒトなど)での研究が含まれます9,10,11,12。生きた動物での研究は厳しく規制されており、スループットは比較的低いです。動物モデルでは、創傷と感染は動物に重大な苦痛を引き起こし、倫理的懸念を引き起こします。ex vivoまたは組織工学によるヒト皮膚モデルは、倫理的承認、国内および世界の法律(ヒト組織法、ヘルシンキ宣言)の遵守が必要であり、組織の取得が困難であり、一部の要求を満たすのに数年かかる場合があります13,14。どちらのモデルタイプも労働集約的であり、実験を成功させるにはかなりの専門知識が必要です。現在のex vivo皮膚感染モデルの中には、感染を可能にするために創傷床に事前に接種された椎間板と添加剤を必要とするものがあります。これらのモデルは非常に有用であるが、添加剤が栄養源としての創傷床の利用を制限するため、感染プロセスには制限がある10、15、16、17。この研究で説明されているモデルは、創傷床に添加物を使用していないため、感染の病理と生細胞数は、唯一の栄養源としての創傷床の直接利用の結果であることを保証します。

新しい実験室法の必要性を考慮して、新しい抗生物質の有効性を評価するために使用するための皮膚感染症の新しいハイスループットex vivoヒツジモデルが開発されました。皮膚感染症の研究は、高コスト、倫理的懸念、全体像を示さないモデルなど、多くの課題に直面しています20,21。生体外モデルと3D外植片モデルにより、疾患プロセスをより適切に視覚化でき、より臨床的に関連性のあるモデルから治療がもたらす影響が可能になります。ここでは、単純で再現性があり、臨床的に関連性があり、高いスループットを有する新しいヒツジ皮膚モデルのセットアップについて説明する。ヒツジがin vivoでの感染に対する応答をモデル化するために一般的に使用される大型哺乳類の1つとして選択されたヒツジの皮膚。さらに、それらは食肉処理場から容易に入手でき、研究用の皮膚の安定した供給を保証し、それらの死体はやけどを負わず、良好な組織品質を保証します。この研究では、黄色ブドウ球菌を模範的な病原体として使用しました。ただし、このモデルは他の微生物でもうまく機能します。

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プロトコル

R.Bエリオットとサンアモントワールの子羊の頭は、このプロジェクトの皮膚サンプルのソースとして使用されました。すべての子羊は食物として消費するために屠殺されました。頭を捨てる代わりに、これらは研究のために再利用されました。組織は食肉処理場から廃棄された廃棄物から供給されたため、倫理的承認は必要ありませんでした。

1.滅菌

  1. ヘッドを採取する前に、清潔な鉗子を取り、200°Cのオーブンで1時間の乾熱処理を行うことにより、鉗子を消毒します。使用前に、すべてのガラス製品を121°Cで15分間オートクレーブします。
  2. 記載されているすべての作業を微生物学クラス2キャビネット内で実行します。製造元の指示に従ってすべての試薬を準備します。

2. サンプル収集

  1. 食肉処理場では、スワレデールの子羊は電気またはキャプティブボルトピストルを使用して見事な方法で屠殺され、放血されました。屠殺後4時間以内に子羊の頭を集めてください。

3.ヘッドの準備

  1. サンプルエリアに約100 mLの200 ppm二酸化塩素溶液を注ぎ、子羊の額部分を消毒します。電気バリカンを使用して頭の額部分を剃り、200 mLの200 ppm二酸化塩素溶液でその領域を洗います。
  2. エタノールとブルーロールで領域を拭き、サンプル領域を脱毛クリームで35分間覆います。掻き取りツールを使用して脱毛クリームをそっとこすり落とし、サンプル領域を評価します。かなりの量の髪が残っている場合は、脱毛プロセスを繰り返します。
  3. さらに200 mLの二酸化塩素溶液を使用して領域をすすぎ、エタノールですすぎ、青いロールで拭きます。
  4. 滅菌した8 mm生検パンチを使用して、準備した領域から8 mmの皮膚サンプルを切り取ります。滅菌鉗子と15枚羽根メスを使用してサンプルを取り除き、すべての皮膚脂肪が確実に除去されるようにします。
  5. サンプルを滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で満たされた滅菌0.5 Lジャーに入れ、50 mLの200 ppm二酸化塩素溶液を含む滅菌50 mLチューブに移し、2回反転させ、30分間滅菌します。
  6. 二酸化塩素溶液からサンプルを取り出し、40 mLの滅菌PBSで満たされた50 mLチューブに入れて洗浄します。洗浄したら、個々の皮膚サンプルを24ウェルプレートの別々のウェルに入れます。
  7. サンプルを気液界面に維持しながら、350 μLの予熱培地を追加します。培地の組成は、MK培地(ハンクス塩、L-グルタミン酸塩、1.75 mg/mL重炭酸ナトリウムを含む培地199)とハムのF12を1:1の比率で、FBS(10%v/v)、EGF(10 ng/mL)、インスリン(5 μg/mL)、ペニシリン-ストレプトマイシン(100 U/mL)、アムホテリシンB(2.5 μg/mL)を加えたものです。
  8. 24ウェルプレートを気体透過性プレートシールで密封し、加湿した5%CO2 組織インキュベーター内で37°Cで最大24時間インキュベートします。

4.皮膚サンプルのメンテナンス

  1. インキュベーション後、培養液を取り出し、500 μLの滅菌PBSでサンプルをすすぎます。抗生物質を含まない培地を各サンプルに加え、加湿した5%CO2 組織インキュベーターで37°Cで24時間インキュベートして、サンプル中の残留抗生物質を除去します。
  2. 24時間後に抗生物質を含まない培地で濁りまたは真菌感染症が発生した場合は、サンプルを廃棄してください。

5.接種材料の準備

  1. 10 mLの滅菌トリプシン大豆ブロスを含む50 mLチューブを準備します。 黄色ブドウ 球菌の新鮮な寒天プレートを取り、綿棒を使用していくつかのコロニーをブロスに移します。37°C、150rpmで18時間インキュベートします。
  2. 4,000 x g で3分間遠心分離します。上清を除去し、細胞ペレットを10 mLの滅菌PBSに再懸濁します。細胞の適切な洗浄を確実にするために2回繰り返します。
  3. 接種材料を滅菌PBSで0.6 OD600 に調整します。手動で実行可能なプレートカウントを行うことにより、接種材料の負荷を確認します。

6.皮膚サンプルの感染

  1. 400 μLの予熱した抗生物質フリー培地を含む新しい24ウェルプレートを準備し、滅菌鉗子を使用して24ウェルインサートを追加します。
  2. 皮膚サンプルから培地を取り除き、500 μLの滅菌PBSで洗浄し、洗浄液を除去します。滅菌鉗子を使用して、サンプルをウェルの底にそっと保持します。
  3. 4mmのパンチ生検を使用して中央の創傷フラップを作り、1〜2mmの大まかな深さまで突き刺します。次に、15枚羽根メスと滅菌歯付きアリス組織鉗子を使用して、創傷フラップの最上層を取り除きます。創傷寸法の変動性は、感染の結果およびエンドポイントコロニー形成単位(CFU)に影響を与える可能性があります。
  4. すべてのサンプルが傷ついたら、滅菌鉗子を使用して24ウェルインサートに移します。15μLの細菌接種材料を創傷床にピペットで入れます。次いで、加湿した5%CO2 組織インキュベーター内で37°Cで24時間インキュベートする。
  5. より長いインキュベーション期間が必要な場合は、培地を取り出し、24時間ごとに新しい培地と交換し、同じ条件でインキュベートします。

7.細菌量の決定

  1. ウェルの底からメディアを取り除きます。滅菌鉗子を使用して、各サンプルを1 mLの滅菌PBSで満たされた個別の50 mLチューブに移します。
  2. 先端の細かいホモジナイザーを使用して、サンプルの表面を均質化します。創傷床がホモジナイザーの先端に直接接触していることを確認するように注意してください。
  3. 各サンプルを中/高で35秒間均質化します。ホモジナイザーは、細菌負荷の列挙を可能にするために、創傷床の表面から細菌を剥離する。
  4. すべてのサンプルが処理されたら、ピペッティングの前に各サンプルを順番にボルテックスします。これは、細菌ホモジネートが確実に混合されるようにするためです。
  5. 20 μLのボルテックスホモジネートを、180 μLの滅菌PBSを含む96ウェルプレートの対応するウェルにピペットで入れます。
  6. 各サンプルホモジネートを1 x 10−7 に連続希釈し、希釈したホモジネート10 μLをトリプシン大豆寒天プレートに3回ピペットでピペットします。
  7. 寒天プレートを37°Cで18時間インキュベートします。 次に、コロニー数をカウントし、各サンプルについてCFUを決定した。

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結果

創傷感染モデルを設定する前に皮膚を滅菌する経路を特定することは困難でした。課題は、さまざまな皮膚層に損傷を与えることなく皮膚を滅菌することにあり、感染の結果に意図しない結果をもたらす可能性があります。適切な滅菌レジームを特定するために、 表1に概説されているように、さまざまな治療をさまざまな長さで試行しました。汚染は、皮膚サンプルを維持するために使用されたMK培地における48時間後の濁りの発生として記録された。組織の完全性を組織学でモニタリングし、治療直後にヘマトキシリンとエオジン(H&E)で染色しました(図1)。二酸化塩素による30分間の治療は、組織の完全性を維持しながら皮膚組織を再現的に滅菌するのに最も効果的であることが証明されました。

実験セットアップでは、傷ついた無菌組織は、気液界面にある24ウェルインサートの頂端チャンバーに配置されます(図2A)。パンチ生検ツールで組織を創傷し、15枚羽根メスと滅菌歯付きアリス組...

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ディスカッション

抗菌薬の開発は重要だが費用のかかるベンチャーであり、約10億ドルの費用がかかり、完了するまでに約15年かかると推定されています。抗菌薬の発見と抗菌薬の有効性の前臨床試験の90%以上は、学術研究者や通常50人未満の中小企業によって実施されています22。これらのチームは非常に財政的に制約されており、トランスレーショナルリサーチの後期段階での鉛分子の失敗を悲惨なものにします。抗菌薬耐性の上昇は、新規抗菌薬の開発を上回っており、責任を持って抗菌薬研究へのすでに限られた投資を管理する必要性をさらに強めています23。

in vivoおよびin vitroの実験室培養における感染の間の細菌生理機能の不一致は、鉛同定段階でヒットの抗菌効果の過大評価を引き起こす傾向があります。このような過大評価は、翻訳の後続の段階で見られる高い離職率の一因となります。in vivoでの感染中に見られる生理機能をよりよく模倣する細菌を組み込んだin vitro<...

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開示事項

著者は開示するものは何もありません

謝辞

著者らは、EPSRC(EP/R513313/1)の資金提供に感謝する。著者らはまた、チェスターフィールドのカローにあるR.Bエリオットとサンアバトワールに子羊の頭を提供し、プロジェクトの初期段階で非常に親切にしてくれたこと、このプロトコルの開発を通じてサポートしてくれたカシアエメリー、シェフィールド大学の感染、免疫、心血管疾患学部のフィオナライトに組織学サンプルを処理し、このプロジェクト全体で非常に役立ったことに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
24ウェルコンパニオンプレートSLS 
4 mm 生検パンチウィリアムズ メディカルD7484
50 ml 遠心分離管フィッシャー サイエンティフィック 
8 mm 生検パンチウィリアムズ メディカルD7488
アムホテリシン B 溶液、滅菌シグマ A2942
カラー プロ スタイル コードレス バリカンウォール9639-2117Xバリカン
デュアル オーブン インキュベーターSLSOVe1020滅菌オーブン
表皮成長因子 SLSE5036-200UG
エタノールハネウェル社458600-2.5L
F12 HAMSigmaN4888
ウシ胎児血清 Labtech InternationalCA-115/500
鉗子フィッシャー サイエンティフィック15307805
脱毛クリームヴィート該当
Heracell VIOS 160iThermo Scientific15373212 組織培養インキュベーター
ヘレウス メガフージ 16RVWR521-2242遠心分離
機ホモジナイザー 220、ハンドヘルドフィッシャー サイエンティフィ15575809
ホモジナイザー 220、プラスチック ブレンディング コーンフィッシャー サイエンティフィック 
Insert Individual 24 well 0.4um membraneVWR International353095
Insulin, recombinant HumanSLS91077C-1G
Medium 199 (MK media)SigmaM0393
Microplate, cell culture Costar 96 wellFisher Scientific10687551
MultitronInfors該当なし細菌インキュベーター
PBSタブレットSigma P4417-100TAB
ペニシリン-ストレプトマイシンSLS P0781
プレートシールフィッシャーサイエンティフィックESI-B-100
安全 2020フィッシャーサイエンティフィ1284804クラス II 微生物学安全キャビネット
メスブレード番号 15フィッシャーサイエンティフィO305
メス スワン モートンフィッシャーサイエンティフィ11849002
重炭酸ナトリウムシグマS5761-1KG
歯付きアリス組織鉗子RocialleRSPU500-322
プシン大豆寒天Merck Life Science UK Limited14432-500G-F
トリプシン大豆ブロスMerck Life Science UK Limited41298-500G-F
Vimoba TabletsQuip LabsVMTAB75BX
35350410788561なしック 15585819ック ック ック トリ

参考文献

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