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方法論記事

網膜色素変性症をモデル化するためのヒト患者iPS細胞由来網膜オルガノイドの作製

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DOI：

10.3791/64045

⸱

2022年6月16日

 ,  , 
1Beijing Tongren Hospital, Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Ophthalmology & Visual Science Key Laboratory, Beijing Tongren Eye Center, Capital Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルでは、網膜色素変性症患者が誘発した多能性幹細胞(iPSC)由来の3D網膜オルガノイドが生成されました。これらのオルガノイドは、網膜色素変性症のいくつかの臨床表現型を成功裏に再現しました。

要約

網膜色素変性症(RP)は、世界中で約4,000人に1人の有病率を持つまれな遺伝性の網膜変性疾患です。RP患者の大多数は進行性の視細胞変性を患っており、周辺視野の喪失、夜盲症、そして最終的には完全な失明につながります。現在までに、90以上の遺伝子の数千の突然変異がRPに関連していると報告されています。現在、罹患したすべての遺伝子と異なるタイプの突然変異について利用可能な動物モデルはほとんどなく、遺伝子/突然変異の病理の根底にあるメカニズムの解読を大きく妨げ、治療と医薬品開発を制限しています。患者人工多能性幹細胞(iPSC)由来の3D網膜オルガノイド(RO)は、細胞や動物よりもヒトの早期発症疾患をモデル化するための優れたシステムを提供しています。RPを研究するために、これらの患者由来の3D網膜オルガノイドを利用して、RPの臨床表現型を再現しました。RP患者由来のROでは、ロドプシンの誤局在が明確に示されました。他の動物モデルと比較して、患者のiPS細胞由来網膜オルガノイドモデルは、RPの特徴をより忠実に再現しており、疾患の病因の調査や医薬品開発に理想的なアプローチとなっています。

概要

網膜色素変性症や加齢性黄斑変性症などのヒト網膜疾患は、適切な実験モデルがないため、十分に理解されていません1,2。マウスの網膜は人間の網膜と非常によく似ており、網膜変性の病因を研究するための強力なツールですが、マウスとヒトの間には大きな種差があります3,4。例えば、マウスとヒトでは視細胞の核構造が異なり、マウスの網膜には黄斑がありません5,6。人工多能性幹細胞(iPSC)技術は、転写因子や化合物の組み合わせによる「リプログラミング」プロセスを通じて、生物の特殊な細胞を初期の多能性状態に戻すことを可能にします7,8,9,10。これらのiPS細胞は、ほぼ無限の分裂と増殖能力を持ち、さまざまな種類の細胞に成長する可能性があります。最近、iPS細胞由来の3D網膜オルガノイドが開発され、ヒトの網膜発生の初期のイベントをモデル化し、ヒトの網膜疾患の病態生理学を描写している11,12,13,14,15。網膜オルガノイドには多くの利点があります:(1)それらは、in vivoの網膜発生と疾患の病因を再現するために使用できます。(2)遺伝子治療のハイスループット薬物スクリーニングおよび前臨床試験に使用できます。(3)それらは、網膜変性疾患16,17の治療選択肢の前臨床評価として使用できます。

このプロジェクトの目的の1つは、網膜色素変性症(RP)の病因を研究することでした。これは、その極端な不均一性のために不治のままである病気です18。現在までに、90を超える遺伝子がRP19,20に関連していることが特定されています。RPGR遺伝子は、RP15の最も一般的な原因遺伝子の1つと考えられており、全RPの約16%を占めています4,21,22。RPGR遺伝子にフレームシフト変異を持つiPS細胞は、成功裏に生成され、組織化および層別化された3D網膜オルガノイドに分化されています14。これらのオルガノイドを利用することにより、異常な視細胞層の形態と光受容体におけるオプシンの転位が観察されました。

全体として、患者由来の3D網膜オルガノイド23,24を生成する方法について、段階的かつ親しみやすいプロトコルがここで詳細に説明されている。これらのオルガノイドは、この疾患のいくつかの臨床表現型を成功裏に再現しました。これは、網膜の発達と疾患メカニズムを研究し、治療スクリーニングを行い、将来の前臨床遺伝子治療を評価するための有望なモデルを提供します。

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プロトコル

このプロトコルは、キャピタル医科大学のヒト研究倫理委員会のガイドラインに従っています。

1. iPS細胞の培養と作製

  1. この研究には RPGR 患者を選択します。ここでは、3人の患者、1人の家族性保因者、3人の健康な対照者が使用されました。患者1はRPGR遺伝子のエクソン14に変異c.1685_1686delATを有し、患者2はRPGR遺伝子のエクソン15に変異c.2234_2235delGAを有し、患者3はRPGR遺伝子のエクソン15に変異c.2403_2404delAGを有していた。コントロールとして3人の健康なボランティアを選択します14.静脈穿刺で患者と健康な対照者から末梢全血サンプルを採取し、採血管に入れます(材料の表)。
  2. 末梢血単核細胞(PBMC)を、密度勾配培地25を用いた密度勾配遠心分離により単離する。サイトカインで活性化されたCD34+ PBMCを、ペトリ皿中の8 mLの成長促進培地(表1)で増殖させます。
  3. 1週間後、トランスフェクションシステム(材料表)でCD34陽性末梢血単核細胞をエレクトロポレーションし、CD34陽性細胞と組み込みのT-01プログラムを何も変更せずに選択します。ヒトOCT4、SOX2、NANOG、LIN28、c-MYC、およびKLF4タンパク質を産生する可能性のあるリプログラミングプラスミド(2 μg)のカクテルをトランスフェクションします。
  4. B-27 (1x)、N-2 (1x)、PD0325901 (0.5 μM)、bFGF (100 ng/mL)、CHIR99021 (3 μM)、HA-100 (10 μM)、A-83-01 (0.5 μM)、および hLIF (1000 U/mL) を添加した 2 mL の DMEM/F12 に、in vitronectin ヒト組換えタンパク質被覆 6 ウェルプレートでトランスフェクションした細胞を播種して、iPSC の増殖を維持します。
  5. 形質導入から3週間後、iPS細胞のコロニーを手作業で選択し、その後6ウェルプレートに移し、試薬B(Table of Materials)で増殖させます。
    注:6ウェルプレートは、ビトロネクチンヒト組換えタンパク質でコーティングする必要があります。ビトロネクチン溶液をDPBSで希釈して、最終濃度10 μg/mLにします。希釈したビトロネクチンを組織培養処理した6ウェルプレートに加えます。培養器を渦巻かせて、ビトロネクチン溶液を6ウェルプレートの表面全体に均一に広げます。プレートを37°Cで少なくとも1時間インキュベートします。
  6. iPSCが約80%〜90%のコンフルエンスに達したときに、細胞が0.5 mM EDTAでディスアグリゲーションされ、分割比が1:8または1:10であることを確認してください。通過日には、ブレビスタチン(2.5 μM)を試薬B(表1)に添加します。
    注:ブレビスタチンは、細胞接着と幹細胞の生存率を促進し、幹細胞のアポトーシスを防ぐために使用されました。18時間後、培地を試薬Bでリフレッシュする必要があります。

2. ヒトROの生成

注:iPSCが約80%〜90%の合流点に達したときに、iPS細胞を解離する必要があります。

  1. 0.5 mM EDTAを37°Cで5分間使用して、ヒトiPSC(hiPSC)コロニーを解離します。
  2. 穏やかなピペッティングにより、hiPSCの凝集体を単一細胞に分離します。維持のために細胞をカウントし、試薬Bで増殖させます(表1)。
  3. 0日目に、96個のV底円錐形ウェルに12,000細胞/ウェルを播種し、100 μLの分化培地で細胞再凝集を行います(表1)。
  4. 6日目に、細胞培養培地を慎重に吸引し、20 μM Y 27632と1.5 nM(55 ng/mL)hBMP4を含む分化培地100 μLを加えます。
  5. 9日目に、分化培地の半分を交換して、hBMP4濃度を約0.75nMに保ちます。
  6. 各ウェルから60μLの分化培地を希望し、20μM Y-27632を含む60μLの新鮮な分化培地を各ウェルに加えます。
  7. 12日目に、分化培地の半分を新しい分化培地と交換して、0.375 nM hBMP4を達成します。
  8. 18日目に、凝集体を10mLの先端を持つ新しいペトリ皿に移し、倒立顕微鏡下で顕微手術用ナイフで各凝集体を2〜4個に切断して、さらにオルガノイドを生成します。
  9. 同じグループの凝集体を1本の15 mL遠心分離チューブに移します。凝集体がチューブの底に落ち着いたら、上清を吸引します。
  10. 凝集体を1mLの神経網膜培地(DMEM/F12、10%ウシ胎児血清、1%N-2サプリメント、0.5μMレチノイン酸、0.1mMタウリン、1%ペニシリン-ストレプトマイシン)で再懸濁し、15mLの神経網膜培地を入れた焦げ付き防止のペトリ皿に移します。1つのシャーレに10-15個の網膜オルガノイドを入れます。
  11. 5日ごとに培地をリフレッシュしてください。レチノイン酸は光に感受性があるため、培養物を暗所に保管し(図1)、倒立顕微鏡26,27,28,29で自己組織化ヒト網膜組織の形成を確認する。

3. レチナールオルガノイドの解析

  1. hiPSC由来3D網膜の免疫蛍光染色
    1. 3Dレチネを新鮮な4%パラホルムアルデヒド1 mLのDPBS溶液に4°Cで20分間固定します。 次に、オルガノイドを1 mLのDPBSバッファーですすいでください。
    2. 0.5 gのアガロース(材料表)を測定し、アガロース粉末を100 mLのDPBSと電子レンジフラスコで混合します。電子レンジを使用して、アガロースが完全に溶解するまで1〜3分間溶解します。アガロース溶液を約40°Cまで冷まします。
    3. DPBSの2%に埋め込む。
    4. ビブラトームを使用して、サンプルを厚さ50μmのセクションにスライスします。スライスした切片を接着顕微鏡スライド(材料表)に置き、-80°Cで保存します。
    5. スライスを室温(RT)で15分間解凍します。
    6. スライスをDPBSで5分間洗い、3回繰り返します。
    7. 0.5% Triton X-100をDPBS溶液中で使用し、室温で15分間スライスを透過化します。
    8. 透過化溶液を取り出し、スライスをDPBSで5分間洗浄し、3回繰り返します。
    9. スライスを1% BSAおよび0.5% Triton X-100とDPBSで室温で30分間インキュベートします。
    10. 1% BSAおよび0.1% Triton X-100で希釈した抗ロドプシン抗体(1:1000)および抗L/Mオプシン抗体(1:1000)とスライスを4°Cで16時間インキュベートします。
    11. スライスをDPBSで5分間洗い、3回繰り返します。
    12. スライスをロバ抗マウスおよびウサギ二次抗体(1:500)と1% BSAおよび0.1% Triton X-100で希釈し、室温で1時間インキュベートします。
    13. 30 nM 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)をDPBSに添加し、室温で15分間核染色します。
    14. スライスをDPBSで5分間洗浄し、5回繰り返します。
    15. スライスを埋め込み媒体(材料表)でマウントし、スライドを覆います(材料表)。暗い色調の箱に入れ、4°Cで最大4週間保存してください。
  2. RNA抽出とRNAシーケンシング
    1. 同じ分化時点(0日目、47日目、91日目、121日目、および151日目)で各コントロールおよび患者から得られた1〜3個(サイズによる)3D網膜を、氷上のRNA抽出試薬1mL(材料表)に収集します。
    2. ホモジナイザー(材料表)を使用して、サンプルを1分間オン、30秒オフで3サイクル中断し、サンプルの破壊を確認します。
    3. サンプルが完全に均質化されたら均質化を停止し、チューブを30秒間激しくボルテックスします。
    4. サンプルを氷上で15分間インキュベートします。
    5. サンプルを13,800 x g で4°Cで15分間遠心分離し、上清を新しい2 mL RNaseフリーチューブに移します。
    6. 0.4 mLのクロロホルムをチューブに加え、ボルテックスで13,800 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。
    7. 無色の上相の一部(約2/3)を新しいRNaseフリーチューブに慎重に移します。DNAを含む白い界面を吸引したり、乱したりしないでください。
    8. 0.5 mLの冷イソプロパノールを加え、ボルテックスで30秒間ボルテックスし、13,800 x g で4°Cで15分間遠心分離します。 チューブ底の側面にペレットが形成されます。
    9. ピペットチップで上清を慎重に吸引し、ペレットを保持します。
      注:RNAペレットはゼリー状で、純度が非常に高いと透明になります。
    10. 1 mLの冷70%エタノールを加え、サンプルを30秒間激しくボルテックスし、13,800 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
    11. ピペットチップで上清を慎重に吸引し、RTでフード内のペレットを5〜10分間風乾します。ペレットを過度に乾燥させないでください。
    12. 20-50μLのRNaseフリー水を加え、ピペッティングで上下させてペレットを慎重に再懸濁します。
    13. 1 μL の RNA を分光光度計に塗布します (材料の表)。対照群と患者からそれぞれ約10μgのRNAをIlluminaライブラリー調製に使用した30。
    14. RNAを-80°Cで保存します。

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結果

概略図は、健康で患者様のiPS細胞由来網膜オルガノイドを作製するための鑑別手順を示しています(図1)。iPS細胞からROまで、いくつかの要因によりばらつきが生じることがあります。iPSCのステータスは、RO世代の決定的なステップです。さらに、研究者は、実験全体を追跡できるように、すべての培地のすべてのステップ、カタログ、およびロット番号を記録することを強くお勧めします。 図2Aでは、健常者および患者様のiPS細胞由来網膜オルガノイドにおけるロッドマーカーRhodopsin(赤)およびL/M-coneマーカーL/M-opsin(緑)の130日目における免疫染色を示しています。iPS細胞由来のRO患者では、ONLの細胞形態が破壊され、RPの臨床表現型と一致していました。0日目、47日目、91日目、121日目、151日目における、iPS細胞由来網膜オルガノイドの健常者と患者患者の光受容体の転写因子の違いを調べるために、RNA-seq解析を行った。その結果、一部の転写因子と光受容体の成熟制御遺伝子の発現は、コントロールのiPS...

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ディスカッション

網膜オルガノイドは、hiPS細胞または胚性幹細胞(ESC)に由来する3Dの積層構造であり、ヒトの網膜発達の空間的および時間的パターンを模倣する非常に有望なモデルとして特徴付けられています31,32。ROは、光受容体、双極細胞、神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、ミュラーグリア33など、さまざまな種類の網膜細胞で構成されています。2D培養では、視細胞の外側セグメントの配向と発達を正確に模倣することはできません。ROの生成は長いプロセスであり、多くの場合、6か月以上の労働集約的な作業が必要ですが、これらの3Dヒト網膜オルガノイドは、I)このin vitroアプローチには異なる神経発達分化段階があり、in vivoの対応物と類似しているため、優れたシステムです。重要なことに、II)それらは、さまざまな種類の網膜細胞タイプを含む、よく構造化され組織化された組織を形成します。II...

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開示事項

すべての著者は、利益相反を開示していません。

謝辞

M.S. Yan-ping Li氏とZhuo-lin Liu氏には、原稿に関する技術サポートと有益なコメントをいただき、感謝いたします。この研究は、中国国家自然科学基金会(82171470、31871497、81970838、Z20J00122)、北京市自然科学基金会(Z200014、82125007)、および中国の国家重点研究開発プログラム(2017YFA0105300)によって部分的に支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
96 V底円錐井住友ベークライトMS-9096VZ
A-83–01R&D Systems2939/10
接着顕微鏡スライドCITOtest188105
AgaroseGene Tech111760
Amaxa Nucleofector 2b DeviceLonzaAAB-1001Transfection system
B-27Thermo Fisher Scientific17504044
bFGFR&Dシステムズ3718-FB
ブレビスタチンNuwacellバイオテクノロジーRP01008
採血チューブBDバキュテイナーEDTA366643
CHIR99021TOCRIS4423/10
スライドCITOGLAS10212440C
cTarget hPSC媒体NuwacellバイオテクノロジーRP01020
DAPIインビトロジェンD-1306
DMEM/ハム's F12Gibco10565-042
Donkey anti-mouse 488InvitrogenA-21202
Donkey anti-rabbit 594InvitrogenA-21207
EDTANuwacell BiotechnologiesRP01007
Embedding mediumFluorSaveTM Reagent345789
EX-CYTE growth enhancementmedium Sigma811292成長促進培地
ウシ胎児血清Gibco04-002-1A
FicollSigma-Aldrich26873-85-8密度勾配培地
FLT3LPeprotech300-19
GlutaMAXLife Technologies35050-061L-グルタミンサプリメント
HA-100STEMCELL Technologies72482
ハムs F12Gibco11765-054
hLIFサーモフィッシャーサイエンティフィックAF-250-NA
ホモジナイザーEDEN labD-130
IL-3Peprotech213-13
IL-6Peprotech200-06
Iscove's Modified Dulbecco MediumGibco12440053
KnockOut Serum Replacement - Multi-SpeciesGibcoA3181502Serum Replacement Medium
L/M-opsinMilliporeab5405
MonothioglycerolSigmaM6145
N-2 supplementThermo Fisher Scientific17502048
Nanodrop分光光度計サーモフィッシャーサイエンティフィックND2000分光光度計
ncEpic 125x SupplementNuwacell BiotechnologiesRP01001-02125x Supplement
ncEpic Basal MediumNuwacell BiotechnologiesRP01001-01Basal hpsc medium
ncLaminin511 human recombinant proteinNuwacell BiotechnologiesRP01025
PD0325901STEMCELL Technologies72182
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15140-122
組換えヒト BMP4R&D Systems314-BP
レチノイン酸Sigma R2625
RhodopsinSigmaO4886
RNeasy Mini KitQiagen74104
RNeasy Mini KitQiagen74104
sIL6-RThermo Fisher ScientificRP-75602
StemSpan SFEM mediumSTEMCELL Technologies09600
タウリンシグマT8691
トリゾール試薬Invitrogen15596026
ビトロネクチンNuwacell BiotechnologiesRP01002
V-Lance ナイフアルコン サージカル8065912001
カバー

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