本プロトコルは、 カエノラブディティス ・ダウアー幼虫を用いて大規模な重力試験を実施するための方法を概説する。このプロトコルにより、プレートベースのアッセイと比較して、グラビタキシスの挙動をより適切に検出できます。
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この記事について
サマリー
要約
重力感覚は重要で比較的研究されていないプロセスです。重力を感知することで、動物は周囲をナビゲートし、動きを容易にすることができます。さらに、哺乳類の内耳で発生する重力感覚は聴覚と密接に関連しているため、このプロセスを理解することは、聴覚および前庭研究に影響を及ぼします。グラビタキシスアッセイは、 ショウジョウバエを含むいくつかのモデル生物に存在します。単一のワームは、溶液に定着する際の配向の好みについて以前にアッセイされています。ただし、 カエノラブディティス グラビタキシスの信頼性が高く堅牢なアッセイは記載されていません。.本プロトコルは、一度に数百の カエノラブディティス ダウアーを試験するために使用できるグラビタキシスアッセイを実行するための手順を概説しています。この大規模な長距離アッセイにより、詳細なデータ収集が可能になり、標準的なプレートベースのアッセイでは見逃される可能性のある表現型が明らかになります。垂直軸に沿ったダウアーの動きを水平コントロールと比較し、方向バイアスが重力によるものであることを確認します。次いで、重力選好を、菌株間または実験条件間で比較することができる。この方法は、ワームの重力症の分子、細胞、および環境要件を決定できます。
概要
地球の引力を感知することは、多くの生物の方向、動き、調整、およびバランスにとって非常に重要です。しかし、重力感覚の分子機構や神経回路は、他の感覚に比べてよくわかっていません。動物では、重力感覚は相互作用し、行動に影響を与えるために他の刺激と競争することができます。視覚的手がかり、固有受容感覚的フィードバック、および前庭情報を統合して、動物の周囲に対する身体意識の感覚を生成することができる1,2。逆に、重量性嗜好は、他の刺激の存在下で変化させることができる3、4、5。したがって、重力行動は、重力感覚を研究し、神経系の複雑な感覚統合と意思決定を理解するのに理想的です。
C. elegansは、そのポリフェニックライフサイクルのために、グラビタキシスを研究するための特に有用なモデル生物です。発育中に熱、過密、食物不足などのストレッサーにさらされると、C.エレガンスの幼虫はストレス耐性の高いダウアーに成長します6。ダウアーとして、ワームは、ワームが尾に「立ち」、頭を振るニクテーションなどの特徴的な行動....
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プロトコル
本研究で使用した菌株は、C. エレガンス (N2)と C.ブリグサエ (AF16)です( 資料表を参照)。ダウアーの男女混合集団を各アッセイに使用した。
1. チャンバーの準備
- ドラフトで作業します。ブンゼンバーナー、1〜2個のかみそりの刃、ペンチ、ピンセット、およびプラスチック製の切断面を使用してワークスペースをセットアップします(材料の表を参照)。
- チャンバーごとに、5 mLの血清学的ピペットを2つ集めます。ピンセットで1つのピペットから綿プラグを取り外します。ペンチを使用して、ブンゼンバーナーにかみそりの刃を熱くなるまでかざします。加熱されたブレードを使用して、ピペット全体の直径が均一になるように、2番目のピペットのテーパー端を切り取ります(図1A)。
- すばやく作業して、2つの修正されたピペットの端を炎に近づけ、わずかに溶かします。これらの端をしっかりと押し合わせて結合し、両方のピペットの壁が連続していることを確認します。接合後にギャップが見える場合は、それらを分解してこの手順を繰り返します(図1A、B)。
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結果
種間の重力差の比較
上記の手順に従って、 C. briggsae dauer gravitaxisは、 C. elegans gravitaxisおよび水平コントロールと比較することができる。 C. briggsae dauersの垂直分布(あずき色)はチャンバーの上部に偏っており、ワームの大部分は+7に達します(図2A)。ダウアーがチャンバーの中心の周りにほぼ釣鐘型の曲線で分布している水平コントロール(アクア)とは対照的に、この傾向は負の重力挙動を示しています。これらのデータは、同じ実験日に実施された C.エレガンス グラビタキシスと比較することができる(図2B)。
クラスカル-ウォリス検定とそれに続く多重比較のためのボンフェローニ補正によるダンの検定により、アッセイ間の有意差が決定されました9.......
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ディスカッション
従来工法との比較
走化性とは異なり、 カエノラブディティス のグラビタキシスは、従来の寒天プレート実験デザインを使用して確実に観察することはできません。標準的なペトリ皿は直径150mmで、ダウアーが重力の好みを示すためにどちらの方向にも75mmしか利用できません。 C. elegansの 配向選好は溶液12でアッセイできますが、この方法はワームを一度に1つずつ分析する必要があるため、スループットが低くなります。さらに、重力の好みや行動は、培地に浮かぶワームと表面を這うワームで異なる場合があります。これらの理由から、クロールまたはクライミングワームのグラビタキシス行動を分析するために使用できる、感度を高めたハイスループットアッセイを開発しました。 C.エレガンスは 光と電磁場に敏感であり、どちらも重力嗜好を妨害するため9、これらのアッセイはどちらの刺激もせずに実行する必要があります。自家製のファラデーケージを使用している場合は、ケージの強度を確認して補.......
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開示事項
著者は競合する利益を宣言しません。
謝辞
本研究は、米国国立衛生研究所からJHRへの研究助成金(#R01 5R01HD081266および#R01GM141493)の支援を受けて行われました。一部の菌株は、NIH研究インフラストラクチャプログラム局(P40 OD010440)によって資金提供されているCGCによって提供されました。プラディープ・ジョシ(UCSB)の編集上の意見に感謝します。UCSB DATALABが提供する統計コンサルティング。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1% ドデシル硫酸ナトリウム溶液 | ストックから 10% (w/v) SDS in DI water | ||
| 15 mL 遠心分離管 | ファルコン | 14-959-53A | |
| 3 mm 六角レンチ | 他の同様のサイズの金属工具を使用することもできます | ||
| 4% 寒天培地 (NGM) - 1 L | オートクレーブ前:NaCl 3 g、寒天 40 g、ペプトン 2.5 g、デキストロース 2 g、ウラシル 10 mL (2 mg/mL)、500 μLコレステロール(10mg / mL)、1mL CaCl2、962mLのDI水。オートクレーブ後:リン酸緩衝液24.5 mL、1 MgSO4 (1 M)、ストレプトマイシン1 mL(200 mg/mL) | ||
| 5 mL 血清ピペット | フィッシャーブランド | S68228C | ポリスチレン、ホウケイ酸ガラスではない |
| 60% 冷ショ糖溶液 | 60% スクロース(w/v) 脱イオン水中; ろ過(0.45 μm フィルター)。4°に保ちます。C | ||
| AF16 C. briggsaeまたはその他の実験株 | CGC(Caenorhabditis Genetics Center)から入手可能 | ||
| ブンゼンバーナー | |||
| しがみつくラップ | フィッシャーブランド | 22-305654 | |
| 臨床遠心分離機 | |||
| 使い捨てカミソリブレード | フィッシャーブランド | 12-640 | |
| ファラデーケージ | とアルミホイルを使用して構築できます; 30インチ L x 6" W x 26" H またはそれ以上の | ||
| インクマーカー | シャーピーまたはプラスチック上のマーキング用他のブランド | ||
| ラベリングテープ | カロライナ | 215620 | |
| M9 バッファー | 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4、86 mM NaCl | ||
| N2 C. elegans株 | |||
| NGM プレート | です (説明: NGM 中の 4% 寒天)。OP50 | ||
| パラフィンフィルム | Bemis | 13-374-10 | |
| プラスチックまな板 | |||
| プライヤー | |||
| 回転垂直ミキサー | BTLab SYSTEMS | BT913 | 22 x 15 mLチューブバー付き |
| セロロジカルピペッター | コーニング | 357469 | |
| 実体顕微鏡 | Laxco | S2103LS100 | |
| タリーカウンター | ULINE | H-7350 | |
| 厚型NGM/寒天プレートメディア - 1 L | NGMレシピの4%寒天を参照;40 gの寒天を20 gの寒天 | ||
| ピンセット |
参考文献
- Peterka, R. J. Sensory integration for human balance control. Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).
- Lacquaniti, F., et al. Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates. BioMed Researc....
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再版と許可
