複合ラット後肢の手術手技と脱細胞化プロセスについて説明します。脱細胞化は、 ex vivo マシン灌流システムを介して低濃度ドデシル硫酸ナトリウムを使用して行われます。
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この記事について
サマリー
要約
重度の外傷および組織喪失を有する患者は、複雑な外科的再建を必要とする。血管新生複合同種移植(VCA)は、複数の組織を複合サブユニットとして移植するための進化する再建手段です。VCAの有望な性質にもかかわらず、長期的な免疫抑制要件は、悪性腫瘍、末端臓器毒性、および日和見感染のリスクが高いため、重大な制限です。無細胞複合足場の組織工学は、免疫抑制の必要性を減らすための潜在的な代替手段です。本明細書では、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を用いたラット後肢の調達およびその後の脱細胞化について説明する。提示された調達戦略は、総大腿動脈に基づいています。機械灌流ベースのバイオリアクターシステムを構築し、後肢の 生体外 脱細胞化に使用しました。灌流脱細胞化に成功し、後肢の白色半透明様の外観をもたらした。後肢全体に無傷の灌流可能な血管網が観察された。組織学的分析は、核内容物の除去とすべての組織コンパートメントにわたる組織構造の保存を示しました。
概要
VCAは、複雑な外科的再建を必要とする患者にとって新たな選択肢です。外傷または腫瘍切除は、再建が困難な体積組織の喪失をもたらします。VCAは、皮膚、骨、筋肉、神経、血管などの複数の組織を、ドナーからレシピエントへの複合移植片として移植します1。その有望な性質にもかかわらず、VCAは長期の免疫抑制レジメンのために制限されています。このような薬物の生涯使用は、日和見感染症、悪性腫瘍、および末端臓器毒性のリスクの増加をもたらします1,2,3。免疫抑制の必要性を軽減および/または排除するために、VCAの脱細胞化アプローチを使用した組織工学的足場は大きな期待を示しています。
組織の脱細胞化は、細胞および核の内容物を除去しながら、細胞外マトリックス構造を保持することを伴います。この脱細胞化足場は、患者特異的細胞4で再増殖することができる。ただし、複合組織のECMネットワークを維持することは、追加の課題です。これは、足場内の組織密度、構造、および解剖学的位置が異なる複数の組織タイプが存在するためです。本プロトコールは、ラット後肢に対する外科的手法および脱細胞化方法を提供する。これは、この組織工学技術を複合組織に適用するための概念実証モデルです。これはまた、再細胞化によって複合組織を再生するためのその後の努力を促すことができる。
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プロトコル
トロント総合病院研究所から得られた死体雄ルイスラット(300〜430g)を全ての実験に使用した。すべての外科手術では、無菌技術を維持するために滅菌器具と消耗品が使用されました( 材料の表を参照)。すべての手順は、トロント総合病院研究所、大学保健ネットワーク(カナダ、オンタリオ州トロント)の動物ケア委員会のガイドラインに従って実行されました。合計4つの後肢が脱細胞化されました。
1.手術前の準備
- 50 mLの5%ヘパリン化生理食塩水を調製します。50 mLの生理食塩水バッグから、5 mLシリンジを使用して2.5 mLの生理食塩水を取り出し、廃棄します。5 mLシリンジを使用して、生理食塩水バッグに2.5 mLのヘパリンを追加します。生理食塩水バッグをひっくり返して内容物を混ぜます。
- 死体ラットを青いパッドの下の仰臥位に置きます。電気シェーバーを使用して後肢と鼠径部を円周方向に剃り、脱毛します。
- ラットを手術ステーションに持ち込み、ガーゼを使用してポビドンヨードスクラブ溶液を後肢と鼠径部に塗布します。続いて、70%イソプロピルアルコールを塗布し、ガーゼを使用してスクラブ溶液を拭き取ります。
- 手順1.2の青いパッドを廃棄し、新しい滅菌手袋に交換します。
2. ラット後肢の調達
- 鼠径靭帯レベルに沿って#10外科用ブレードと#3ブレードランナーを使用して、外側から内側に向かって皮膚を切開します(図1A)。アドソン鉗子を使用して周囲の皮膚を保持し、滑らかな切開を確保します。
- 下にある脂肪が露出したら、鈍い解剖を使用して脂肪を注意深く解剖します。上腹部血管を見つけます。
- マイクロハサミを使用して近位に解剖し、下にある大腿神経、動脈、静脈を鼠径靭帯レベルで露出させます。
- 解剖顕微鏡下で、大腿血管を特定し、細い鉗子を使用して動脈と静脈を近位に解剖し、動脈網の分岐点から十分な長さを取得します(図1B)。
- 6-0縫合糸を使用して大腿動脈と静脈を別々に結睭します。
- 結紮された大腿骨血管を破壊することなく、後肢の残りの部分の周囲を円周方向に解剖します。
- ボーンカッターを使用して大腿骨を中央の長さに切断します。
- 後肢を完全に隔離するには、マイクロハサミを使用して結紮した大腿骨血管を結紮糸の下に交差させます。
- 解剖顕微鏡下で24G血管カテーテルを使用して大腿動脈をカニュレ挿入します。細かい鉗子を使用して、カニューレを慎重に挿入します。大腿静脈から明らかな流出が観察されるまで、ヘパリン化生理食塩水でフラッシュします。
- カニューレ自体の周りに1本の縫合糸を結び、カニューレ自体の周りに遠位に別の縫合糸を結ぶことによって、カニューレを固定します。分岐点が塞がれないように、カニューレが近位に配置されていることを確認してください。
- 調達した後肢をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に脱細胞化するまで沈めます。
図1:ラット後肢の調達。(A)外側から内側までの鼠径靭帯レベルでの皮膚切開のマーキング。(B)鼠径靭帯に向かって近位に解剖された大腿静脈と大腿動脈のビュー、点線で示した。略語:L =側面;M =内側;FV =大腿静脈;FA =大腿動脈。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
3.溶液の調製
- 6 Lのガラスフラスコに、12.5 gのSDS粉末を5 Lの超高純度蒸留水に溶解することにより、0.25%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の5 L洗剤リザーバーを準備します。フラスコの開口部をパラフィルムで覆い、密閉します。
- 1Lのガラス瓶に、2.5gのSDSを1Lの超高純度蒸留水に溶解することにより、1Lの0.25%SDS溶液を別途調製する。攪拌子を追加して、すべてのSDSが溶解するまでマグネチックスターラーで溶液を混合します。
- 1%抗生物質抗真菌薬(AA)溶液を含む1 Lの1x PBS洗浄溶液を調製します。1 L フラスコに、990 mL の 1x PBS 溶液と 10 mL の AA 液を加えます。
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結果
調達プロトコルは、その後の灌流ステップのために総大腿動脈を分離およびカニューレすることに成功しました。図1A,Bの代表的な解剖像は、分岐点から十分な距離を置いた大腿血管の切開位置と露出を示しています。図2は、バイオリアクターおよび灌流回路を調製するために必要な装置を示す。脱細胞化のエンドポイントは、組織の白色の半透明のような外観を観察することによって決定されました。ex vivoマシン灌流システムは、ラット後肢の灌流脱細胞化に成功しました。シングルパスの閉系回路が維持されました(図3)。天然後肢の肉眼的形態は、0.25%SDS灌流の5日後に白色の淡い外観に変化しました(図4)。
核が見つからなかった大腿血管、皮膚、神経、骨、筋肉でヘマトキシリンとエオジン(H&E)で染色すると、細胞内容物...
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ディスカッション
ラットの後肢はVCA5の実験モデルとして有用である。無細胞足場の組織工学は、VCAに関連する長期免疫抑制レジメンの欠点に対処するための最初のステップを表しています。複合グラフトの使用は、それぞれが独自の機能的、免疫原性、および構造的特性を持つ複数の組織が存在することを考えると、追加の課題をもたらします。本プロトコールは、ラット後肢の無細胞複合を得るための成功した方法を示す。これらのスキャフォールドはさらに再セル化でき、VCAの概念実証モデルを表します。
調達と脱細胞化を成功させるために、外科的および脱細胞化の段階でさまざまな重要なステップがあります。天然血管系全体にわたる洗剤および滅菌液の全身分布を確実にするために、重要なステップは、上腹部血管の結紮、ならびに大腿血管の結紮の前に動静脈ネットワークの分岐点から十分な距離を得ることを含む。記載された滅菌手順は、細胞の付着、生存、および成長に無菌環境が必要とされる再細胞化実験のバイオバーデンを減らすのに役立ちます6。
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開示事項
著者は宣言する利益相反はありません。
謝辞
図3A は BioRender.com 年に作成されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.9% 塩化ナトリウムの注入 USP 50 mL | バクスター コーポレーション | JB1308M | |
| 1 mL 使い捨て血清ピペット | VWR | 75816-102 | |
| 10 cc 使い捨て注射器 | 研究機関から入手 | ||
| 3 ウェイ ストップコック | 研究機関から入手 | ||
| 5cc 使い捨て注射器 | 研究機関から入手 | ||
| 70% イソプロピルアルコール | 研究機関から入手 | ||
| アクロディスク シリンジ フィルター 0.2 & マイクロ;m | VWR | CA28143-310 | |
| アドソン鉗子、ストレート | ファインサイエンスツール | 11006-12 | |
| 血管カテーテル 24 G 19 mm (¾”) | VWR | 38112 | |
| 抗生物質-抗真菌剤溶液 (100x) 100 mL | マルチセル | 450-115-EL | |
| ボーンカッター | ファイン サイエンス ツール | 12029-12 | |
| コネクタ 1/16" から 1/8" チューブ | McMasterCarr | 5117K52 | |
| メス ルアー - とげのあるアダプター (PVDF) - 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K328 | |
| ファインフォーセプス | ファインサイエンスツール | 11254-20 | |
| マイクロブランテッドチップ付きファインフォーセプス | ファインサイエンスツール | 11253-20 | |
| ヘパリンナトリウム注射 10,000 IU/10 mL | LEO Pharma Inc. | 006174-09 | |
| オス ルアー - とげのあるアダプター (PVDF) - 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K322 | |
| マイクロ ニードル ホルダー | WLorenz | 04-4125 | |
| マイクロハサ | WLorenz | SP-4506 | |
| 過酢酸 | シグマ Aldrich | 269336-100ML | |
| 蠕動ポンプ、3 チャンネル | コール パーマー | RK-78001-68 | |
| リン酸塩緩衝生理食塩水 1x 500 mL | Wisent | 311-425-CL | |
| Povidone 外科用スクラブ溶液 | 研究機関から入手 | ||
| ポンプチューブ、3-ストップ、Tygon E-LFL | コールパーマー | RK-96450-40 | |
| ポンプチューブ、プラチナ硬化シリコン | コールパーマー | RK-96410-16 | |
| メスブレード - #10 | ファインサイエンスツール | 10010-00 | |
| メスハンドル - #3 | ファインサイエンスツール | 10003-12 | |
| ドデシル硫酸ナトリウム試薬グレード:純度:>99%、1 kg | Bioshop | SDS003.1 | |
| 外科用縫合糸#6-0 | Covidien | VS889 |
参考文献
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
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- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016 (10), 1-16 (2016).
- Fleissig, Y. Y., Beare, J. E., LeBlanc, A. J., Kaufman, C. L. Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages. SAGE Open Medicine. 8, 205031212096871(2020).
- Tao, M., et al. Sterilization and disinfection methods for decellularized matrix materials: Review, consideration and proposal. Bioactive Materials. 6 (9), 2927-2945 (2021).
- Chen, Y., Geerts, S., Jaramillo, M., Uygun, B. E. Preparation of decellularized liver scaffolds and recellularized liver grafts. Methods in Molecular Biology. 1577, 255-270 (2018).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Cohen, S., et al. Generation of vascular chimerism within donor organs. Scientific Reports. 11 (1), 13437(2021).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).
- Urciuolo, A., et al. Decellularised skeletal muscles allow functional muscle regeneration by promoting host cell migration. Scientific Reports. 8 (1), 8398(2018).
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