氷およびクラスレート水和物結晶化の研究のためのマイクロ流体アプローチ

サマリー

本プロトコルは、マイクロ流体デバイスにおける微視的な氷結晶および包接水和物の結晶化を記述し、形成された結晶の周りの液体交換を可能にする。これにより、阻害剤の結晶化プロセスと結合メカニズムを調べるための比類のない可能性がもたらされます。

要約

水結晶化の正確な機構記述は困難であり、単一の微視的結晶の形成を可能にする優れた温度制御と、低温ステージに結合された適切な顕微鏡システムといういくつかの重要な要素が必要です。本明細書に記載される方法は、氷および包接水和物結晶の周りの溶液を交換することを含む別の重要な特徴を追加する。記載されたシステムは、マイクロ流体工学、高分解能コールドステージ、および蛍光顕微鏡を含む、独自のおよび自社開発の機器の組み合わせを含む。コールドステージはマイクロ流体デバイス用に設計されており、マイクロ流体チャネル内にミクロンサイズの氷/水和物結晶を形成し、それらの周囲の溶液を交換することができます。コールドステージの温度分解能と安定性は1ミリケルビンであり、これらの小さな結晶の成長を制御するために重要です。この多様なシステムは、氷と水和物の結晶化のさまざまなプロセスと、これらの結晶の成長が阻害されるメカニズムを研究するために使用されます。このプロトコルでは、マイクロ流体デバイスの調製方法、マイクロ流体チャネル内の微視的な結晶を成長および制御する方法、および氷/水和物結晶の周りの液体の流れを利用することで、水の結晶化に関する新しい洞察が得られる方法について説明します。

概要

不凍タンパク質(AFP)と不凍糖タンパク質(AFGP)は、さまざまな寒冷適応生物を霜害から保護します¹。AFPとAFGP(一般にAF(G)Ps)は、それらの表面に不可逆的に結合し、ギブス・トムソン効果によるさらなる成長を阻害することにより、氷晶の成長を阻害します2,3,4,5。ほとんど変化しない融解温度と新たに低下した凍結温度との間に形成される結果として生じるギャップは、熱ヒステリシス(TH)と呼ばれ、AFP活性⁶に対応する測定可能なパラメータを表す。氷の成長を抑制するためのAFPの使用は、広範囲にわたる多様な用途があり、凍結保存、冷凍食品の品質、低温にさらされた作物の保護など、さまざまな分野で潜在的な強化を提供します。

小さな有機分子の存在下での低温高圧での水の結晶化は、包接水和物(またはガスハイドレート)の形成をもたらし、そこで最も豊富なハイドレートはメタンハイドレート⁷である。ガス/オイルフローラインでのメタンハイドレートの結晶化はプラグを引き起こす可能性があり、ガスの発火による爆発を引き起こす可能性があります^8,9,10。フローラインにおける水和物の結晶化を防ぐための現在の努力には、熱力学的(アルコールおよびグリコール)および動力学的(主にポリマー)阻害剤の使用が含まれる¹¹、^12、13、14。AFPはまた、包接水和物結晶に結合し、それらの成長を阻害することが見出されており、これは、プラグの形成を妨げるAFPの使用の可能性を示しており、それによってより環境に優しい溶液を提供する¹⁵。

マイクロフルイディクスは、マイクロチャネル¹⁶のネットワークを通って流れるごくわずかなサンプル量(fLまで)の流体の特性を研究するために使用される一般的な方法です。マイクロチャネルは、リソグラフィ¹⁷を用いてシリコンウェーハ(モールド)上に作成されたパターンに従う。マイクロ流体デバイスの製造に一般的に使用される材料はポリジメチルシロキサン(PDMS)であり、これは安価で研究室での作業が比較的簡単です。機能(チャネル)の設計は、デバイスの特定の目的に関して構成されます。したがって、DNAセンシング¹⁸、医療診断¹⁹および結晶化プロセス³、^20、21を含む様々な用途に利用することができる。

本プロトコルは、AFPおよびAFGPを含む様々な阻害剤を用いてミクロンサイズの氷および水和物結晶を成長させる独自のマイクロ流体法を記載している。これらの実験のために、テトラヒドロフラン(THF)ハイドレートを使用して、圧力および温度制御のための特殊な装置を必要とするメタンガスハイドレート²²の特性を模倣した²³。蛍光標識されたAF(G)Pを使用して、結晶表面へのタンパク質の吸着を視覚化および分析し、蛍光イメージングと組み合わせることで、マイクロ流体アプローチにより、これらの分子の結晶表面への結合プロセスの重要な特徴を得ることができました。

プロトコル

1. マイクロ流体デバイスの作製

1. ペトリ皿の内面をアルミホイルで覆い、あらかじめ用意した型をペトリ皿に入れます。
   1. 参考文献に記載されているリソグラフィ技術を使用して金型を作製します。本研究で使用した2つのデバイス設計を 図1に示します。
2. 硬化剤とエラストマーの1:10(重量)混合物を秤量し( 材料の表を参照)、混合物が白くほぼ不透明になるまで約5分間連続的に混合することにより、30〜40mLのPDMS混合物を調製します。
   注意: プラスチックカップを計量スケールに置き、エラストマーをカップに注ぎ、硬化剤を加えて1:10の重量比を実現します。
3. PDMS混合物を型と一緒にペトリ皿に注ぎ、気泡がなくなるまで(約30分)デシケーターで脱気します。
4. 液体PDMSを使用して、ゴムのような粘稠度が得られるまで、70°Cのオーブンまたはホットプレートで金型を焼きます。このプロセスには約 1 時間かかります。
5. カビは壊れやすいので、メスではなくメスで前方に押すように注意しながら、メスで特徴の周りをなぞってデバイスを切り取ります。切り取ったPDMSデバイスを取り外し、逆さまにして新しいペトリ皿に入れます。粘着テープを貼ったり取り外したりして、底面からほこりや汚れの粒子を取り除きます(材料の表を参照)。
6. 鈍い注射針(20 G)を使用して、必要に応じて顕微鏡を使用して、刻印パターンに基づいてデバイスに穴を開けます。穴がデバイスの反対側を貫通していることを確認し、ピンセットを使用して打ち抜かれた部分を取り除きます。
7. カバーガラス(18 x 18 mm、厚さ0.14 mm)を水と石鹸で徹底的に洗い、次にイソプロパノールで洗います。空気圧を使用して、クリーニングしたカバーガラスを乾燥させます。
8. 洗浄したPDMSとカバーガラスをプラズマクリーナーに挿入し、バルブを閉じて、電源、真空、ポンプをオンにします。プラズマクリーナーを約1分間稼働させ、RFをHIに設定し、細かいバルブを使用してプラズマクリーナーに空気が入るようにします。
   1. 表示ウィンドウの色が紫からピンクに変わったら、プラズマクリーナーを50秒間動作させ、RFをオフにします。ポンプを1分間オンのままにし、オフにした後、メインバルブを徐々に開いて、プラズマクリーナーに空気を入れます。
      注意: 同等の結果を得るための別の方法は、熱接着です。この方法では、金型をカバーガラスの上に置き、70〜80°Cに設定されたホットプレートに約60分間置きます。
9. PDMSの表面をクリーニングしたカバーガラスに押し付け、カバーガラスを少し引き上げたときに剥離がないことを確認して、カバーガラスが接着されていることを確認します。
10. 90°鈍い針(18 G)の針をペンチで固定し、プラスチック製のシリンジコネクタを引き抜いて取り外します。針の一方の端をタイゴンチューブ(0.020インチID、0.060インチOD、 材料表を参照)に挿入し、もう一方の端をデバイスのパンチアウト穴の1つに挿入します。他の穴についてもこのプロセスを繰り返します。
11. 気泡を除去するには、ガラスシリンジを使用してチャネルに水/バッファーを注入します(ポンプはオプションですが、ここではポンプを使用しませんでした)。デバイスに注入する前に、0.22μmフィルターですべての液体をろ過します。
12. 1%BSA溶液などのブロッキング剤を使用して、蛍光標識されたAFPがPDMS壁に結合するのを防ぎます。ブロッキング剤を入口チャネルに注入し、マイクロチャネルに20分間留まらせます。次に、緩衝液を入口チャネルに注入してBSA溶液を洗い流します。
    注意: 得られたPDMSデバイスは、底面に沿ってカバーガラスに取り付けられ、入口と出口の穴でチューブに接続され、チャネルでブロッキング剤でコーティングされます。

2. マイクロ流体デバイスのセットアップ

1. 銅のコールドステージの表面に少量の浸漬オイルを塗布し( 材料の表を参照)、糸くずの出ないワイプを使用して広げて、オイルの薄い層を作成します。次に、作成した油層の上にきれいなサファイアディスク( 材料表を参照)を置きます。液浸オイルの液滴をサファイアディスクの中央に塗布し、デバイスの機能がコールドステージの表示穴に揃うようにPDMSデバイスを液滴に配置します。
2. デバイスを所定の位置に保持し、粘着テープを使用してコールドステージを収容するアルミニウムボックスの外壁にチューブを固定します。特定の各チューブの配置をメモします。
3. ガラスシリンジを使用して、4〜5 μLのAF(G)P溶液( 材料の表を参照)を入口チャネルに注入します。コールドステージの蓋を閉めます。
   注:AFP溶液の濃度は、蛍光強度に基づいて変化させ、決定することができます。本プロトコールでは、濃度の範囲は5〜40μLであった。

3. マイクロ流体チャネルにおける単結晶の形成

1. コールドステージを乾燥した空気/窒素でパージして、内部に結露が発生しないようにします。循環冷却槽をアクティブにして、コールドステージに水を循環させ、ヒートシンクとして機能します。
2. 温度制御プログラムを開始し、温度を-25°Cに設定します。
   注:サンプルが~-20°Cの温度に達すると凍結が発生し、サンプルの突然の暗色化と粗面化として観察できます。この時点で任意の対物レンズ、好ましくは4倍対物レンズを使用することができ、これにより、ユーザーはマイクロ流体チャネル全体を観察できます。
3. ゆっくりと温度を約1°C / 5秒上昇させ、AF(G)P溶液に使用されるバッファーに応じて-1〜-0.2°Cの範囲でサンプルの融点に近づきます。温度が融点に近づいたら、いくつかの単結晶が分離されるまで待ちます。
   注:必要に応じて、顕微鏡に固定されているIRレーザー(980 nm)を使用して不要な氷を局所的に溶かすことができます( 材料の表を参照)。レーザーは、オンになっている限り、近くの氷の結晶を溶かします。
4. この時点で、単結晶をよりよく観察するために、10倍または20倍の対物レンズに切り替えることをお勧めします。目的の位置に単結晶を得た後、結晶の端がチャネル壁に合うまで温度をわずかに下げて(~0.01°C)、結晶を成長させます。
5. 50倍対物レンズに切り替え、AF(G)P溶液をチャンネルに注入し、蛍光強度の増加を観察して、タンパク質溶液がチャンネルに正常に注入されたことを示します。溶液の交換中に氷結晶が溶けないように、この手順を慎重に実行してください。溶液交換プロセス中の流量(ガラスシリンジに増減する圧力を加えることにより)と温度の両方を注意深く監視および調整します。
6. タンパク質が蓄積して結晶表面に結合するのに十分な時間を与えます。
   注意: これは、AF(G)P ^5,25の蓄積率と吸着率によって異なります。典型的な実験では、AFPの蓄積に5〜10分かかります

4. 熱ヒステリシス(TH)活性測定

注: この手順はオプションです。

1. 0.002°Cの小さなステップで温度を調整し、小さな結晶が溶けることなくさらすことができる最高温度を観察することにより、結晶の融点を決定します。
2. 温度コントローラーの ランプ 機能で、冷却速度を-0.05〜-0.01°C / 4秒に設定し、ランプをアクティブにします。突然の結晶成長が起こる正確な温度に注意してください。
   注:この値はバースト温度と呼ばれ、凍結温度に対応します。融解温度と凍結温度の差はTH活性²⁵である。

5. 単結晶周りの溶液交換

1. 実験中の結晶の融解や成長を防ぐために、サンプル温度がTHギャップ内にあることを確認してください。
2. 後で蛍光データ解析を行うために、NIS Elementsイメージングプログラム( 材料表を参照)を使用して溶液交換プロセスを記録します。マイクロ流体デバイスの第2の入口に緩衝溶液をゆっくりと注入し、シリンジに加えられる圧力に依存する速度で蛍光シグナルの減少を観察します。
   1. この視覚的表現を使用して、結晶が溶けないように、加えられた圧力が高すぎないようにしてください。ソリューション交換プロセスを示す一連の画像については、 図2 を参照してください。
3. イメージングプログラムを使用してマイクロ流体チャネル内の蛍光強度を測定します。
   注:シグナルは、AFP結合を示す結晶の表面近くの領域でピークに達し、バッファーでフラッシュされた周囲の溶液では比較的低いはずです。
4. ステップ4に続いて溶液交換後のTH活性を測定します。
5. 新しい結晶を分離して実験を繰り返します(ステップ3.3〜3.5)。ガラスシリンジでAFP溶液を注入し、溶液交換を繰り返します(手順5.1〜5.3)。新しい単結晶を入手し(ステップ3.3〜3.5)、ガラスシリンジを使用してAFP溶液をチャネルに流します。

6. 包接水和物を用いた実験

1. THF水和物を得るには、モル比1:15、つまり体積比1:3.3²⁶のTHF /水溶液を準備します。AF(G)Psまたは他の阻害剤を含むものを含む、以下の実験で使用されるすべての溶液でこの比率を維持します。.
2. 手順1と2に従ってマイクロ流体デバイスを準備し、コールドステージに配置します。温度を-25°Cに設定します。サンプルは、ステップ3.2で説明されているように、~-20°Cで凍結します。
3. THF溶液が凍結した後、すべての氷が溶けるまでゆっくりと温度を上げます。
   注:氷の融点はTHFによってわずかに低下します。
4. 水和物を除いてすべての氷の結晶が確実に溶けるように、温度を1°Cで3分間保持します。
5. 温度を-2°Cに設定し、阻害剤の非存在下でマイクロ流体チャネルに現れる水和物の存在量を観察します。
   注:THFハイドレートは八面体の形をしており(図2)、場合によっては結晶が非常に薄いことがあります。したがって、明確な観察は難しいかもしれません。このような場合は、手順6.4〜6.5を繰り返して新しい結晶を取得することをお勧めします。
6. 得られた結晶が溶融/成長しないように温度を調整しながら、ガラスシリンジを使用してAF(G)P/阻害剤をマイクロ流体チャネルに注入します。阻害剤分子が結晶表面に吸着するまで数分待ちます。
7. 必要に応じて、ステップ4に従ってTH活性を測定します。
8. 手順5.2〜5.3で説明されているように、結晶の周りの溶液を交換します。

結果

氷晶との溶液交換
氷晶の周りの成功した溶液交換を 図3に示します。各スナップショットのタイム スタンプは、ソリューションの交換が比較的高速であったことを示しています。ただし、交換が遅くなる可能性があります。交換が完了した後、氷に吸着されたAFGP分子からの蛍光強度がはっきりと観察されます(図3右)。氷表面のAFP濃度の定量分析は、指定された関心領域(ROI)ツールを使用して監視されます(図4)。この実験⁴では、50 mM Tris-HCl(pH 7.8)および100 mM NaClで希釈したAFPタイプIII(QAEアイソフォーム)を使用しました。溶液を双ピラミッド型の結晶の周りで交換し、溶液中および氷上の蛍光強度をモニターします。溶液中の蛍光シグナルを示す赤いプロットは、溶液交換中に100倍減少しますが、氷の表面で計算されたシグナル(緑色のプロット)は一定のままです。氷吸着分子の計算された信号は、氷⁴から来る信号から溶液から来る信号(マイクロ流体チャネルの厚さに関する定数を乗じたもの)を差し引くことによって得られた。

THF水和物との溶液交換
THF水和物を用いたマイクロ流体実験は、氷を用いた実験と同様に行った。水和物結晶を溶液から阻害剤分子に吸着させた後、阻害剤を含まない溶液をチャネルに注入した。図5は、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)で標識されたAFGP_1〜5(図5A)と蛍光色素26であるサフラニンO(材料の表を参照)の2種類の阻害剤との溶液交換後のTHF水和物を示しています²⁶(図5B)。これは、クラスレート水和物の表面へのAFGP結合の最初の実証です。

図1:本研究で使用したマイクロ流体チャネルの概略図。どちらの設計にも、2つの入口と1つの出口が含まれています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:温度を~-2°Cに冷却した後にマイクロ流体チャネルに形成されたTHFハイドレート。 提示されたすべての結晶の形態は四面体です。ただし、一部の結晶の向きは異なります。スケールバー= 20μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:マイクロ流体チャネル内の単一の氷晶の周りの溶液交換を示す代表的な実験。 当初、溶液にはFITCで標識された_AFGP1-5 が含まれており、氷吸着AFGPは観察されませんでした。溶液をAFGPフリー溶液に交換したところ、氷表面に吸着していたタンパク質がはっきりと検出されました(右の画像)。スケールバー = 25 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:氷表面のAFP濃度の定量的および定性的な分析。 (A)AFP溶液濃度が高い氷晶(溶液交換前)。(b)AFP溶液をAFPフリー緩衝溶液で交換した後の同結晶。スケールバー = 20 μm。 (C)溶液交換中の氷表面(黒)および溶液中(赤)の蛍光強度の定量分析。緑色の曲線は、氷の表面で計算された強度を表します。この図は、参考文献⁴の許可を得て適合しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:マイクロ流体チャネル内の単一のTHF水和物結晶は、それらの周囲の溶液(A、AFGP_1-5)または(B、 サフラニンO)を交換した後。(B)の画像は参考文献²⁶より転載。スケールバー = 25 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

本プロトコルは、結晶成長とその阻害に関する新しい洞察を明らかにするために、マイクロ流体の流れと微視的な結晶の組み合わせを利用するように設計されました。ミリケルビン分解能の温度制御されたコールドステージ²⁷は、マイクロ流体チャネル内に位置する単一の微視的結晶の制御を可能にし、それによってそれらの周囲の溶液の交換を可能にする。マイクロ流体デバイスの製造は標準的であり、一般的な慣行^17,18に似ていますが、デバイス内の結晶の成長と融解の制御は独特で斬新です。このシステムの最も重要なコンポーネントは、ペルチェ熱電冷却器、サンプルの近くに配置されたサーミスタからのフィードバック、およびフィードバックループを制御する高分解能温度コントローラを使用して実現される優れた温度制御です。

別の重要なステップは、このプロセス中に結晶が溶けたり成長したりする可能性があるため、溶液交換自体です。したがって、成長/融解を防ぐために、溶液交換中に温度を調整する必要があります。マイクロ流体チャネルでの結晶の形成は、液体の流れを妨げ、このシステムの主な課題をもたらします。したがって、これらの結晶の成長を制御する必要があります。ここでは、IRレーザー(980nm)を倒立顕微鏡に搭載し、不要な氷/水和物結晶²⁸を局所的に融解するために使用した。このようなレーザーを使用できない場合は、マイクロ流体デバイスの金属コネクタを追加のペルチェ熱電冷却器で加熱することができ、これにより、デバイスの入口/出口の氷が溶けます。

ここで説明する方法には、自家製の機器(コールドステージ)が含まれており、上記の手順のいくつかは難しいため、トレーニングが必要です。結晶を取り囲む溶液の濃度は、流れが意図しない場合でも変化する可能性があるため、簡単なキャリブレーションステップ⁵ で、蛍光シグナルに基づいて濃度を確実に推定できます。不要な流れ(例えば、TH測定中)に対する別の可能な解決策は、参考文献⁴に記載されているマイクロ流体バルブです。

このシステムは、H2O液体中の_D2O氷の成長挙動を探査するためにも使用され、微視的なスカラップ氷表面の新しい現象を明らかにした研究²⁷。したがって、マイクロフルイディクスは、温度変化によく反応する様々な結晶系の研究に使用することができる。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.22ミクロンフィルター	フィッシャーサイエンティフィック
90度曲げ鈍い針			18ゲージ
不凍タンパク質と不凍糖タンパク質	ギフト		参考文献を見る 5と28
鈍い針			18ゲージと20ゲージの
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ・アルドリッチ
・コールドステージ	ホームメイド
カバースリップ	グローブサイエンティフィック		18 X 18 mm、厚さ0.14 mm
ガラスシリンジ
赤外線レーザー 980 nm	オプトエンジンLLC
倒立顕微鏡、エクリプス Ti - S	ニコン
見えないテープ	ホチキス
、糸くずの出ないワイ	Kimwipes
Newport 3040 温度調節器	Newport
NIS-Elements イメージングソフトウェア	ニコン
オイル 真空ポンプ	ハリックプラズマ
プラズマクリーナー	ハリックプラズマ	PDC-32G
ポリジメチルシロキサン (ダウ コーニング シルガード 184 シリコーンエラストマーキット)	ダウ コーニング シグラード
Safranine O	Sigma-Aldrich	S2255-25G
サファイアディスク	Ted Pella Inc	16005-1010	直径25.4 mm、厚さ0.3 mm
sCMOSカメラ、Neo 5.5	Andor
Tetrahydrofuran (THF)	Sigma-Aldrich	401757-100ML
マイクロ流体デバイス用タイゴンマイクロボアチューブ	Cole-Parmer		0.020インチID、0.060インチOD、100フィート/ロール。
水循環および窒素ガス用タイゴンチューブ	コール・パーマー		1/8インチID、3/16インチ外径