IL-9発現TおよびILC2細胞は、 N. brasiliensis 感染中に誘導されますが、その特性評価は、その低頻度および異なる動態のために、感染した腸ではほとんど見過ごされてきました。このプロトコルは、異なる標的臓器からのこれらの細胞の単離と、異なる感染段階でのフローサイトメトリー による それらの同一性の確認について説明しています。
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方法論記事
ニッポストロンギルス・ブラジリエンシス感染モデルにおけるIL-9産生リンパ系細胞研究戦略
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
IL-9は、抗腫瘍免疫、アレルギー病理の誘導、および寄生虫の排除に重要な役割を果たす蠕虫感染に対する免疫応答を含む様々な過程に関連する多面的サイトカインである。 ニッポストロンギルス・ブラジリエンシス 感染症のマウスモデルでは、IL-9は主に肺、小腸、排液リンパ節に見られるCD4+ Tリンパ球と自然リンパ球によって産生されます。IL-9の細胞内染色に伴う技術的な困難、および感染時に小腸から造血細胞を単離することの複雑さを考えると、このモデルの異なるリンパ組織および非リンパ組織におけるIL-9の発現を分析するための包括的で簡単なプロトコルが差し迫っています。ここで説明するプロトコルは、CD4+ T細胞と自然リンパ球細胞によって産生されるIL-9の動態を概説しています 肺と小腸、ブラ ジリエンシス菌の標的となる主な臓器、ならびに縦隔と腸間膜リンパ節で、感染全体を通して。さらに、細胞の種類と目的の臓器に応じて、感染に必要な幼虫の数を詳しく説明します。このプロトコルは、 N. brasiliensis 感染モデルで関心のある特定の細胞、臓器、および疾患段階に焦点を当てる機会を提供することにより、時間とリソースを節約するためのアッセイの標準化を支援することを目的としています。
概要
鉤虫は、主に発展途上国の熱帯地域で、世界中で約7億人に感染する腸内寄生虫です。ヒトで最も一般的な鉤虫寄生虫である 十二指腸下腺腫 と ネクターアメリカヌスによる高強度感染症は、貧血とタンパク質欠乏症を引き起こし、成長と精神発達の遅延を引き起こす可能性があります1。 N. americanus とげっ歯類の寄生虫 Nippostrongylus brasiliensis は、宿主にプロトタイプの2型免疫応答を誘導し、ライフサイクルの類似点を共有しています。したがって、 N.ブラジリエンシス によるマウスの感染は、ヒト鉤虫感染の最も一般的に使用されるモデルです。ステージ3(L3) N.ブラジリエンシス 感染性幼虫は、感染後最初の数時間で皮膚から肺に移動します。肺に入ると、L4になり、気管を上って飲み込み、胃を通過し、腸に到達して4〜5日以内に成人(L5)になります。腸内では、L5ワームが糞便中に排泄される卵を産み、寄生虫のライフサイクルを再開します2。
N. brasiliensisによって誘導される免疫応答は、好酸球増加症、好塩基球増加症、杯および肥満細胞の過形成、ならびにIgG1およびIgE産生の増加とともに、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、および....
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プロトコル
ここに記載されているすべての動物実験は、メキシコ国立自治大学細胞生理学研究所の動物取り扱い内部委員会(CICUAL)によって承認されました。
メモ: プロトコル全体のフローチャートを 図1に示します。
1.マウスの飼育
- 8〜10週齢の雌または雄のマウス群を使用し、12時間の明暗サイクルで一定の温度と湿度の動物施設に収容し、水と食物に 自由 にアクセスできるようにします。
注:このプロトコルは、前述のように、C57BL / 6バックグラウンドのIL-9レポーターマウス系統を使用します4;しかしながら、他のIL−9レポーター株は、6、7、8、ならびに細胞内IL−9染色を使用することができ、結果は変動した9であった。
2.マウスの感染
- 感染の1日前にマウスの背中を体の中央....
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結果
マウスに200匹のL3ステージ のN.ブラジリエンシス 幼虫、または偽対照用のPBSを皮下注射しました。このプロトコルで使用される幼虫の数は、リンパ組織および肺の細胞を検出するために高負荷のワームが使用された以前の報告とは異なり、肺、リンパ組織、および小腸から生細胞を分離するために調整されました4。肺、縦隔リンパ節、腸間膜リンパ節、および小腸は、リンパ球の単離とIL-9産生集団の特性評価のために、感染後0、4、7、および10日目に採取されました。分析された時点ごとに9匹の対照および4〜6匹の N.ブラジリエンシス感染マウスを含む、合計27匹のマウスを2つ以上の独立した実験に使用した。偽感染対照は、基礎数を得るためにすべての実験に含まれていました。このプロトコルを使用して、IL-9産生CD4+ T細胞(このモデルでは主にTh9細胞)を肺、腸間膜、縦隔リンパ節から単離して、定量化とさらなる分析を行うことができます。
自然な感染過程に続いて、最初に肺と縦隔リンパ節に存在するIL-9産生CD4+ Tリンパ球.......
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ディスカッション
腸の寄生虫と宿主の相互作用と蠕虫感染に対する免疫応答を完全に理解するには、組織のリモデリングと線虫の排出の誘導に鍵となるさまざまな細胞集団とエフェクター分子の同定と分析が必要です。土壌伝染性蠕虫感染症は、世界中の発展途上国で大きな問題となっています。しかし、最近まで、この感染症の影響を受ける主な臓器である小腸に存在する希少細胞集団の分析を可能にするプロトコルは利用できませんでした5。このプロトコルは、 N. brasiliensis 感染中の肺、縦隔、および腸間膜リンパ節におけるIL-9発現リンパ系細胞のフローサイトメトリー分析を可能にする前述の方法をカバーしており、小腸で初めてこの集団を同定するという追加の利点があります。
このプロトコルの成功は、組織処理時間に大きく依存します。一人当たり最大6個の小腸サンプルを一度に処理することが不可欠です。異なる臓器を処理する場合は、他の人が並行して処理することをお勧めします。比較的低い寄生虫負荷(200匹のL3幼虫)を使用することにより、このプロトコルは、他の臓器からこれらの.......
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開示事項
著者は開示するものは何もありません。
謝辞
著者は、ホセ・ルイス・ラモス・バルデラスの技術サポートに感謝したいと思います。この研究は、CONACYTからPLLへの以下の助成金(FORDECYT-PRONACE-303027)によってサポートされました。OM-PとEO-MはCONACYTからフェローシップを受けました(それぞれ736162と481437)。MCM-MはCONACYTからフェローシップを受けました(Estancias Posdoctorales por México 2022 (3))。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ACKバッファー | 自家製 | ||
| Attune Nxtサイトメーター | サーモフィ | ||
| レジェンド | 103204 | ||
| CD11b | バイオレジェンド | 101204 | |
| CD11c | 117304 | バイオレジェン | |
| バイオレジェン | 115504 | ||
| CD4 | バイオレジェン | 100404 | |
| CD4 (BV421) | バイオレジェン | 100443 | |
| CD45.2 | バイオレジェンド | 109846 | |
| CD8 | Biolegend | 100703 | |
| CD90.2 | Biolegend | 105314 | |
| Collagenase D Roche | 11088866001 | ||
| DNAse I | Invitrogen | 18068015 | 比活性: ≥10,000ユニット/mg |
| Facs ARIA II ソーター | BD Biosciences | ||
| FACS Melody cell sorter | BD Biosciences | ||
| Fc-Block | Biolegend | 101320 | |
| FcεRI | eBioscience | 13589885 | |
| ウシ胎児血清 | Gibco | 26140079 | |
| FlowJo | FlowJo | フローサイトメトリー解析データソフト | |
| Gr-1 | とんぼ | 305931 | |
| ハンクス平衡塩溶液 (HBSS) | 自家製 | ||
| IL-9 | バイオレジェンド | 514103 | |
| NK1.1 | Biolegend | 108704 | |
| ナイロンメッシュ | lba | B07HYHHX5V | |
| OptiPrep 密度勾配 Medium | Sigma | D1556 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 | |||
| RPMI | Gibco | 11875093 | |
| Siglec F | バイオレジェンド | 155512 | |
| ストレプトアビジン | バイオレジェンド | 405206 | |
| TCR-&β; | バイオレジェンド | 109203 | |
| TCR-&β;(PE/Cy7) | バイオレジェンド | 109222 | |
| TCR-&ガンマ;&デルタ; | Biolegend | 118103 | |
| Ter119 | Biolegend | 116204 | |
| トリシン緩衝剤 | 自家製 | ||
| ゾンビアクア固定可能生存能力染料 | バイオレジェンド | 423101 |
参考文献
- Centers for Disease Control and Prevention. Parasites - Hookworm. , (2022).
- Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , Chapter 19 (Unit 19.12) (2003).
- Mearns, H., et al.
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再版と許可
