造血サイトカインによる腫瘍ワクチン接種を用いた実験的黒色腫免疫療法モデル

がん免疫療法は、毒性の低い副作用とより耐久性のある反応に基づいて、有望な治療戦略として認識されています。腫瘍溶解性ウイルス療法、癌ワクチン、サイトカイン療法、モノクローナル抗体、養子細胞移植(CAR-T細胞またはCAR-NK)、免疫チェックポイント遮断など、いくつかのタイプの免疫療法が開発されています¹。

がんワクチンの場合、全細胞ベースのワクチン、タンパク質またはペプチドワクチン、RNAまたはDNAワクチンなど、さまざまな形態の治療用ワクチンがあります。ワクチン接種は、抗原提示細胞(APC)が腫瘍特異的抗原を含む腫瘍抗原を処理し、それらを免疫原性の形でT細胞に提示する能力に依存しています。樹状細胞(DC)は最も強力なAPCであることが知られており、抗腫瘍免疫に重要な役割を果たすと考えられています^2,3。これらの細胞は腫瘍抗原を取り込んで処理した後、ドレナージュリンパ節(dLN)に移動して、T細胞受容体(TCR)と共刺激分子の関与を介して腫瘍特異的Tエフェクター(Teff)細胞をプライミングおよび活性化します。これにより、腫瘍特異的な細胞傷害性T細胞(CTL)が分化および増殖し、腫瘍に浸潤して腫瘍細胞を死滅させます⁴。したがって、DCの活性化と成熟は、腫瘍抗原に対する免疫を刺激するための魅力的な戦略を表しています。

Flt3Lは、MHCクラスII、CD11c、DEC205、およびCD86タンパク質を発現する機能的に成熟したDCの成熟と拡大を促進することが知られています⁵。静脈内ではなく腫瘍内、 Flt3L 遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクター(Adv-Flt3L)の投与は、オルトピー腫瘍に対する免疫治療活性を促進することが示されている⁶。Flt3Lは、DCによる腫瘍抗原のクロスプレゼンテーションを増強し、抗腫瘍応答を増加させる方法として、レトロウイルス形質導入Flt3Lを安定的に発現する照射B16-F10細胞からなる腫瘍細胞ベースのワクチンにも使用されています。ここで説明するB16-Flt3L腫瘍ワクチン接種のプロトコルは、ジェームズ・アリソン博士のグループ⁷によって発表された研究に基づいています。この論文では、CTLA-4遮断と組み合わせたB16-Flt3Lワクチンが相乗的に確立された黒色腫の拒絶反応を誘発し、生存期間が延びることを報告しました。

このプロトコルの目標は、黒色腫の前臨床免疫療法モデルを提供することです。ここでは、腫瘍ワクチンの調製方法や移植方法、固形腫瘍由来の腫瘍内免疫細胞の組成や機能を解析する方法の詳細な手順について説明する。

研究で使用されたすべてのマウスは、温度と湿度が制御された特定の病原体のない条件下で、ラホーヤ免疫学研究所(LJI)のビバリウムに維持および収容されました。動物実験は、LJI動物管理委員会によって承認されたガイドラインとプロトコルに従って、8〜14週齢の雌C57BL / 6マウスで実施されました。

1. 移植用培養腫瘍細胞の調製

1. B16-F10メラノーマ細胞を、10%熱不活化FBS、2 mMグルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム、1 mM MEM非必須アミノ酸、およびペニシリンとストレプトマイシンの各100 U/mLを含むIscoveの改変ダルベッコ培地(IMDM)で培養します。細胞株を5%_CO2下で37°Cに維持する。
2. 175Tフラスコに1.5-2 x 10⁶ B16-F10細胞を播種し、2日間培養する。細胞が75%〜80%コンフルエントになったら細胞を収穫します。
3. 培養液を取り出し、フラスコをPBSで1回洗浄します。PBSを吸引し、5 mLの0.25%トリプシン-EDTAを加えた後、培養フラスコの縁を強くたたきます。
4. 15 mLの培養液を加えてトリプシン-EDTAを中和し、フラスコの内容物を50 mLの遠沈管に注ぎます。皿の表面を10 mLのPBSで洗浄し、同じ50 mLのチューブに注ぎます。
5. 細胞を200 x gで5分間遠心分離します。上清を捨て、チューブの底を指で軽くたたくことで細胞ペレットを壊します。
6. 冷たい10 mLのPBSを加え、細胞懸濁液を穏やかにピペッティングします。次に、血球計算盤を使用して手動で細胞をカウントします。注射前に細胞を氷上に保管してください。

2.腫瘍移植

1. ヒュームフード内で毎分1.0 Lのガス流量で5%イソフルランでマウスをガス麻酔します。マウスが完全に麻酔されたら、流量を2%イソフルランの維持用量に変更します。.このプロトコルでは、麻酔は、施設の動物の世話と使用のガイドラインに従って獣医によって行われました。
2. マウスの左脇腹の毛を剃り、アルコールワイプを使用して注射部位を滅菌します。皮内(i.d.)30 G針を使用して、左脇腹の50 μLの冷たいPBSに5 x 10⁵ 細胞でB16-F10腫瘍細胞を移植します。
   注:移植されたB16-F10腫瘍細胞の用量は、腫瘍の発生を成功させるために0.5〜5 x 10⁵ 細胞の範囲で調整する必要がある場合があります。
3. 移植後、電子デジタルノギスを使用して週に3回腫瘍の長さと幅を測定します。次の式を使用して腫瘍体積(mm³)を計算します。
   腫瘍体積(^mm3)=幅² ×長さ×0.5
   腫瘍が≥2mmのサイズに達したら、マウスを腫瘍ワクチンで治療する。
   注:腫瘍は通常、5 x 10⁵腫瘍細胞の移植後3日目に測定できます。より速いB16-F10腫瘍増殖速度は、雄のC57BL/6、Rag1-/-、またはRag2-/-γc-^/-マウスで観察された。同様の観察が他の研究にも記載されています⁸。マウスの性別を一定に保つことをお勧めします。ただし、NIHは、生物医学研究における重要な生物学的変数として性別に重点を置いていることに注意してください。

3. Flt3L発現B16-F10(B16-Flt3L)細胞のワクチン調製と注射

1. B16-Flt3L細胞を、8%熱不活化FBS、2 mMグルタミン、およびペニシリンとストレプトマイシンのそれぞれ100 U / mLを含むDMEMで、5%_CO2下で37°Cに維持します。
2. 175Tフラスコに1 x 10⁶ B16-Flt3L細胞を播種し、2日間培養する。ステップ1.3〜1.6に記載されているように、細胞が75%〜80%コンフルエントになったら細胞を回収し、1 mLの冷たいPBSに懸濁します。
3. 160 kV、25 mAのパラメータ設定でX線照射器を使用して、150 Gy線量のガンマ線を細胞に照射します。注射前にトリパンブルー染色により細胞生存率をカウントして確認する。
4. 前述のようにマウスをガス麻酔し、アルコールワイプを使用して注射部位を滅菌します。最初の細胞移植後3、6、および9日目に、原発腫瘍の部位から~1 cm離れた、元の腫瘍移植と同じ脇腹に、50 μLの冷たいPBSで1 x 10⁶ 照射されたB16-Flt3L細胞をマウスに皮内注射します。
5. 原発腫瘍と区別するために、ワクチン注射部位を色付きのペンでマークします。
   注:0.5 x 10⁵ B16-F10細胞を最初に移植する場合は、8、11、および14日目にワクチン治療を行うことをお勧めします。

4. 腫瘍内免疫細胞単離

1. 実験終了時(腫瘍移植後15日目;図1)。
2. 各マウスから皮膚を含む腫瘍を外科的に除去し、1 mL 10%FBS/RPMI-1640培地を含む24ウェルプレートに入れます。体重を量る前にペーパータオルを使用して腫瘍を乾かします。
3. 腫瘍を細かく切ります。2 mLの消化バッファー(RPMI-1640培地中の100 μg/mL TLリベラーゼおよび200 μg/mL DNase I)を加え、37°Cで25分間インキュベートします。
4. 10 mLの10%FBS/RPMI-1640培地を加えて消化を停止します。25 mLの血清学的ピペットを使用して細胞を移し、1 mLシリンジのプランジャーを使用して40 μmの細胞ストレーナーで組織を粉砕します。
5. 細胞を500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 ペレットをPBS中の40%密度勾配特異的培地の5mLに再懸濁し、1倍濃度に希釈する)。
6. PBSを含む80%密度勾配特異的培地5 mLの上に細胞懸濁液をゆっくりと加えます。室温(RT)で23分間、低ブレーキ設定で325 x g で細胞を遠心分離します。
7. 遠心分離後、40%と80%の密度勾配特異的培地の間の界面にある白血球層を注意深く収集し、40 μmの細胞ストレーナーに通します。細胞を500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
8. ペレットを2 mLの赤血球(RBC)溶解バッファー中でRTで5分間インキュベートします。インキュベーション後、10 mLの10%FBS/RPMI-1640培地を加えて、RBC溶解バッファーをクエンチします。
9. 細胞を500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 細胞を0.5 mLの10%FBS/RPMI-1640培地に再懸濁し、さらなる分析のために使用前に細胞の総数をカウントします。
   注:フローサイトメトリー分析による免疫細胞サブセットのゲーティング戦略のためのコントロールとして脾臓またはdLNを収集します。上記の細胞単離方法に従いますが、次の変更を加えます:1 mLシリンジのプランジャーを使用して、70 μmメッシュフィルターで組織を粉砕します。10%FBS/RPMI-1640培地で組織を洗浄し、単一細胞懸濁液を取得します。説明されているようにRBCを溶解します。

5. フローサイトメトリー解析

注:白血球層から採取された細胞には、免疫細胞と腫瘍細胞が含まれています。2枚の独立した染色パネルをお勧めします。

1. 表面染色
   1. 細胞を96ウェルのV字型底板に移します。細胞をPBSで洗浄し、細胞生存率色素(50-100 μL/ウェル)でRTで15分間染色します。
   2. 細胞を500 x gで4°Cで5分間遠心分離します。 表面マーカーをFACSバッファー(1%FBSおよび0.05%NaN₃ PBS中)の混合抗体(材料の表に記載されています)で氷上で30分間染色します(50-100 μL /ウェル)。
   3. 細胞を500 x g で5分間遠心分離し、FACSバッファーで2回洗浄します。
   4. 細胞固定バッファー(50-100 μL/ウェル)で細胞を氷上で35分間固定します。細胞を500 x g で5分間遠心分離し、FACSバッファーで2回洗浄します。
   5. サンプルを4°CのFACSバッファー(150-200 μL /チューブ)に保存し、光から保護します。フローサイトメーターでサンプルを取得します。DCおよびT細胞集団については、図 2B および 図3Aに示すゲーティング戦略に従ってください。
      注:骨髄性DCの染色には、表面抗体のインキュベーション(ステップ5.1.2)の前に、FCブロッカー(ラット抗マウスCD16 / CD32)を氷上で15分間インキュベートすることをお勧めします。
2. 生体外再刺激時のサイトカイン分析
   1. 細胞を完全培地(10%FBS、10 mM HEPES、pH 7.2-7.6、0.1 mM非必須アミノ酸、1 mMピルビン酸ナトリウム、各100 U/mLペニシリンおよびストレプトマイシン、50 μM 2-メルカプトエタノール、および2 mM L-グルタミンを添加したRPMI-1640)にプレートし、50 ng/mLのPMAと1 μMのイオノマイシンをタンパク質輸送阻害剤の存在下で5%_CO2下で37°Cで4時間刺激します。
   2. 上記のステップ5.1で説明したように、表面マーカーの表面染色を実行します。
   3. 透過処理液(50-100 μL/ウェル)を加え、RTで5分間インキュベートして細胞内染色を行います。サイトカインまたは核タンパク質に特異的な抗体を含む細胞を透過処理溶液(50-100 μL/ウェル)中で、氷上で60分間、または4°Cで一晩インキュベートします。
   4. 細胞を500 x g で5分間遠心分離し、FACSバッファーで2回洗浄します。サンプルは4°Cで保管し、光から保護してください。フローサイトメーターでサンプルを取得します。
      注:最適な染色を行うには、必要に応じて抗体希釈を調整する必要がある場合があります。

移植されたB16-F10細胞の目に見える黒い点は、通常、腫瘍移植後~3日後に皮膚表面に観察されます。マウスは、腫瘍結節が≥2mmのサイズに達してから3、6、および9日後に腫瘍ワクチンで治療されます。ワクチン接種マウス群~腫瘍移植後2週間で腫瘍増殖の有意な減少が観察されました(図1)。実験の最後に、腫瘍内免疫細胞を単離し、それらの数と細胞表面マーカー発現、および上記のように短時間のin vitro刺激後のサイトカイン産生を分析しました。白血球層から採取された細胞は依然として多くの腫瘍細胞を含み、リンパ球集団を容易に定義することはやや困難である。したがって、フローサイトメトリー解析における腫瘍内免疫細胞サブセットの適切なゲーティングのために、脾細胞を並行して使用することが推奨されます(図2A)。ここでは、CD103+CD11c+DC、CD8+、CD4+、およびTregのゲーティング戦略を補償マトリックス(表1および表2)とともに示します(図2Bおよび図3A)。各集団の取得数と頻度の代表的なデータも図2Cおよび図3Bに提供されます。

ワクチン接種マウス由来の腫瘍内CD103+CD11c+DCは、最も強力な腫瘍抗原処理および提示細胞9,10を表し、共刺激リガンドCD86の発現が有意に上昇した(図4)。ワクチン接種マウスは、腫瘍浸潤CD8+およびCD4+Foxp3−T細胞(図5A)、ならびにCD8+GzmB+およびIFN-γ+ CTLの増加も示しました(図5B)。これらの結果は、この腫瘍ワクチン接種がDC成熟を促進し、より強力な抗腫瘍免疫を誘導することを示唆しています。

図1:Flt3L発現B16-F10メラノーマ細胞を用いた細胞ベースの腫瘍ワクチンの治療モデルにおける腫瘍増殖の解析。 雌のC57BL/6マウスにB16-F10細胞(5 x 105)をi.d.移植し、照射(150 Gy)B16-Flt3L細胞(1 x 106)を同じ側面の隣接部位に注射した。矢印はワクチン接種の時点を示しています。4つの実験の累積データが示されている(対照、n = 12;B16-FLT3L, n = 10)。データはSEM±平均値として提示されます。 二元配置反復測定による統計分析 ANOVA検定 ボンフェローニ事後検定。*P < 0.05;0.001<。 この数値は11 から変更されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:リンパ球とCD103 + CD11c + DCのゲーティング戦略。 (A)脾臓および腫瘍サンプル中のリンパ球のゲーティング戦略。(B)腫瘍サンプル中の腫瘍内CD103 + CD11c + DCのゲーティング戦略。(C)代表的なワクチン未接種対照マウスから取得した各集団の数および頻度を示す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:CD8+、CD4+、およびTregのゲーティング戦略。 (A)腫瘍試料中のT細胞のゲーティング戦略。(B)代表的なワクチン未接種対照マウスから取得した各集団の数および頻度を示す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:CD103+ 腫瘍内DCでのCD86表面発現。 発現は、対照群における平均MFIに対して正規化された蛍光強度(MFI)の中央値(=1)として報告される。コントロール、n = 8;B16-Flt3L, n = 10.データはSEM±平均値として提示されます。 対応のないスチューデント のt検定による統計分析。**P < 0.01この数値は11 から変更されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:対照マウスおよびワクチン接種マウスにおける腫瘍内T細胞の分析。 (A)腫瘍組織のグラムあたりの腫瘍浸潤CD8+(左)および非Treg CD4+(右)の列挙。(B)腫瘍内GzmB+(左)およびIFNγ+(右)CD8+ T細胞の列挙。コントロール、n = 11;B16-Flt3L, n = 10.データはSEM±平均値として提示されます。 対応のないスチューデントのt検定による統計分析。*P < 0.05;**P < 0.01この数値は11 から変更されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:図2の補償マトリックス。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:図3の補償マトリックス。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者は開示するものは何もありません。