方法論記事

Caenorhabditis elegansの寿命と健康寿命を測定するための低コストの方法の調査

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DOI:

10.3791/64091

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2022年5月18日

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1Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

Caenorhabditis elegansは 、健康寿命、寿命、ストレスに対する回復力を調査するための堅牢で低コストの方法を備えた優れたモデルシステムとして機能します。

要約

モデル生物としての Caenorhabditis elegansの 発見と開発は、生物学、特に老化の分野に影響を与えました。多くの歴史的および現代的な研究は、遺伝子変異、トランスジェニック遺伝子発現、およびストレスへの有益で低悪性度の曝露であるホルミシスを含む、寿命を変える何千ものパラダイムを特定している。 C. elegans は、寿命の短さ、簡単で低コストのメンテナンス、全ヒト遺伝子のほぼ3分の2と相同性のある完全に配列決定されたゲノムなど、多くの利点により、ストレスおよび老化生物学の優れたモデルとして急速に採用されています。ここでは、寿命と健康寿命を測定するためのいくつかの標準化された方法が調査されており、ほぼすべての研究環境、特に機器や資金が限られている研究環境に簡単に適応できます。 C. elegans の信じられないほどの有用性が紹介され、広範なインフラストラクチャを必要とせずに老化生物学における強力な遺伝子解析を実行する能力を強調しています。最後に、各分析の限界と代替アプローチについて検討のために説明します。

概要

1974年にシドニー・ブレナーによって最も影響力のある論文の1つである「Caenorhabditis elegansの遺伝学」が出版されて以来、この顕微鏡ワームは生物学的謎を研究するための優れたモデルシステムと見なされてきました1。1977年、Michael R. KlassはC. elegansの寿命を測定する方法を発表し、老化2を研究するためにこのモデルシステムを確立しました。ストレスと長寿の関係を理解するための調査は、1歳遺伝子の単一の突然変異の同定から始まり、その結果、C. elegans3の寿命が延びました。さらに、現代の研究では、他の寿命を延ばす変異が同定されており、ストレスに対する耐性の増加を示す長寿命の変異ワームが明らかになりました4,5,6。短い寿命、容易なメンテナンス、すべてのヒト疾患原因遺伝子の約3分の2との相同性を含む完全に配列決定されたゲノム、RNA干渉(RNAi)ライブラリの可用性と使いやすさ、ヒトとの生理学的類似性7,8,9を含む多くの利点により、C. elegansはストレスおよび老化生物学の優れたモデルとして急速に採用されています。

おそらく、C. elegansの最大の有用性は、その非常に低い維持費、実験の容易さ、および研究に利用可能な様々な遺伝的ツールである。C.エレガンスは、典型的には、大腸菌食物源を有する固体寒天培地上で増殖される。2つの一般的に使用される大腸菌株は、標準OP50、おそらく最も一般的に使用されるB株10、およびHT115、主にRNAi実験に使用されるK−12株11,12である。HT115 K-12株はRNAIII RNaseの欠失を運び、これはRNAi法に不可欠な変異であり、個々のC.エレガンス遺伝子に対応するdsRNAを発現するプラスミドが使用される。dsRNA供給ベクターは、これらのプラスミドを運ぶ細菌を線虫に直接供給することができるため、複雑な交配やゲノム編集を必要とせずに、C. elegans遺伝子の堅牢なノックダウンを可能にします。これらの細菌RNAiベクターの数千がHT115バックグラウンドに存在し、その中には、>19,000個体のRNAi構築物13を有する最も人気のあるVidal RNAiライブラリーおよび16,757個のRNAi構築物14を有するアーリンガーRNAiライブラリーが含まれる。しかしながら、OP50およびHT115細菌食は、ビタミンB1215,16の違いを含む代謝プロファイルに大きな違いを有する。したがって、可能であれば、前述のように複数の交絡因子を導入する可能性のある遺伝子と食事の相互作用を避けるために、単一の細菌源に対してすべての実験を実行することが推奨される17、18、19。その容易さのために、動物は、ここに記載されるすべての実験条件についてOP50上で維持されるが、すべての実験は、前述のようにHT115上で行われる20。簡単に言えば、動物はOP50で維持され、RNAi実験と非RNAi実験の間の一貫性のために同期後(漂白後)にHT115に移されます。あるいは、大腸菌K12 HT115株に見られるRNAIII RNaseの類似の欠失を担持するRNAiコンピテントOP50株21を使用することもできる。

おそらく、C. elegansにおけるRNAi実験の主な制限の1つは、ノックダウン効率の懸念です。ノックダウン効率はqPCRまたはウェスタンブロッティングで検証できますが、これらは高価な機器と試薬を必要とし、バルク分析に限定されます。これは、RNAiに対して不応性(感受性が低い)であるニューロンなどの特定の細胞を見ると、さらに懸念事項です。特定の細胞におけるRNAi効率は、dsRNA取り込みに不可欠な膜貫通タンパク質であるSID−1の過剰発現を介して増強され得るが、これは依然としてこれらの構築物に使用されるプロモーターの細胞型特異的発現パターンに限定されているため、遺伝子ノックアウトおよび突然変異は、遺伝子機能を枯渇させる最も確実な手段である。RNAi媒介ノックダウンを超えて、C. elegansはCRISPRベースの戦略23、24、25およびマイクロインジェクションによるトランスジェニック構築物の過剰発現によるゲノム編集にも非常に適しており、照射またはトランスポゾンベースの統合によってトランスジェニック構築物を統合するオプションがある26,27,28,29.しかし、これらの方法は高価なマイクロインジェクション装置を必要とし、ガイドRNAまたはCas9酵素の高コストは、限られた資金を有する機関においてこれらの方法を禁止する可能性がある。代わりに、何千ものトランスジェニック株と変異株が、Caenorhabditis Genetics Center(CGC)とNational Bioresource Project(NBRP)の両方で数ドルで容易に入手可能です。NBRPは、公開され、したがって検証された変異株、パイロットプロジェクトに由来する変異株、およびまだ特徴付けられていない変異株を含む、多数のC. elegans遺伝子の単離された変異体を提供する。対照的に、CGCは、研究コミュニティから主に出版され確立されたC. elegansラインの寄託所です。どちらも非常にリーズナブルな料金で世界中の株を出荷し、社内で株を合成する能力が限られている人のために多種多様なオプションを提供しています。

ここでは、C. elegansの寿命と健康寿命をアッセイするための最も低コストの方法である可能性が高い、キュレーションされたメソッドコレクションが提供されています。ここで紹介するすべての方法は、低コストの機器と消耗品を必要とし、CGCから容易に入手可能な株のみを利用する。おそらく、C. elegansにおける長寿および生存アッセイにとって最も法外なのは、線虫成長培地(NGM)プレートのコストである。C. elegansは雌雄同体であり、自己受精するので、標準的な生存アッセイでは、成体動物を子孫からの汚染を避けるために子孫から継続的に遠ざける必要があります。このプロセスには時間がかかるだけでなく、単一の寿命アッセイを実行するために条件ごとに約100枚のプレートが必要であるため、高価になる可能性があります。ここでは、温度感受性生殖細胞系列レス変異体glp-4(bn2)の利用、または5-フルオロ-2'-デオキシウリジン(FUDR)を用いた化学滅菌の2つの選択肢が提供される。glp-4はバリルアミノアシルtRNA合成酵素をコードし、温度感受性glp-4(bn2)はタンパク質翻訳の減少により制限温度で生殖的に欠損している30,31。FUDRは、DNA複製を予防することによってC.エレガンスを化学的に滅菌し、したがって再生を阻害する堅牢な方法である32。FUDRは一部のラボでは法外に高価になる可能性がありますが、ワームを化学的に滅菌するために必要な量はわずかであり、粉末形態の安定性により、ほとんどのグループで実現可能になる可能性があります。温度に敏感なglp-4(bn2)変異体を利用することは、動物を制限的な25°Cにシフトさせるためのインキュベーターが唯一の要件であるため、確かに最も安価な選択肢です。ただし、25°Cでの成長は軽度の熱ストレス33,34を引き起こす可能性があることに注意してください。方法にかかわらず、滅菌動物を使用することで、加齢関連アッセイに必要な消耗品のコストを大幅に削減できます。

老化を研究するために、寿命を変えるパラダイムは老化に直接影響するため、標準的な寿命アッセイが一般的です。しかし、健康期間とストレス耐性の測定は、生物の健康に関する追加情報を提示する。ここでは、健康期間を測定するためにいくつかの方法が提供されています:1)リプロダクティブヘルスの尺度としての繁殖力。2)産まれた子孫の発達上の健康と生存可能性の尺度としてのひなの大きさ。3)筋肉機能および運動性の尺度としての自発運動行動は、いずれも加齢と直接相関している。さらに、ERストレスに対する生存、ミトコンドリア/酸化ストレス、および熱ストレス生存のストレス耐性のアッセイも提供されています。実際、ERストレス35、36、ミトコンドリアストレス37、および熱ストレス38に対する耐性の増加を有する動物は、寿命の延長を示す。小胞体ストレスは、C.エレガンスをツニカマイシンに曝露することによって加えられ、これはN結合型グリコシル化を遮断し、ミスフォールディングされたタンパク質の蓄積を引き起こす39。ミトコンドリア/酸化ストレスは、パラコートへの曝露によって誘発され、これはミトコンドリア40において特異的にスーパーオキシド形成を誘導する。熱ストレスは、34〜37°C33,41での動物のインキュベーションを通して加えられる。ここで説明するすべてのアッセイは、最小限の機器と資金で実行することができ、多様なグループの老化を研究するためのさまざまなツールを提供します。

プロトコル

1. C. elegansの成長と維持

  1. 線虫成長培地(NGM)プレートの注ぎ込み
    1. 1 mM CaCl 2、5 μg/mL コレステロール、25 mM KPO 4 (pH 6.0)、1 mMMgSO 4、0.25% w/v ペプトン、および 51.3 mM NaCl からなる線虫増殖培地 (NGM) を使用して、標準的な 2% 寒天プレートで C. elegans を増殖させます。
    2. 1 LのNGM-寒天プレートの場合、2.5 gのペプトン、3.0 gのNaCl、および20 gの寒天を攪拌子付きの1 Lフラスコに測定します。
      注:ブランド間の剛性のばらつきが見られたため、特定の寒天源を標準化することが推奨され、再現性に影響を与える可能性があります。ここでは、バクト寒天が厳密に使用されています。さらに、寒天は加熱せずに完全に溶解せず、寒天を含む溶液を移すと寒天の損失と濃度誤差が生じるため、オートクレーブ処理中のフラスコに寒天を直接添加することをお勧めします。
    3. dH2O を 970 mL まで加える。
      注:滅菌後の液体添加剤30mLは、最終容量を1Lにします。私たちの手では、最終容量の970 mLに達するために〜951 mLのdH2Oが必要になります。
    4. NGM-寒天溶液は、標準的なオートクレーブまたは培地滅菌器を使用して滅菌し、効率的な滅菌を行います。
      注:この時点で、滅菌NGM寒天は室温で数ヶ月間保存することができます。保存されている場合、NGM-寒天は、溶液がふきこぼれるのを防ぐために、または加熱された水浴中で、15〜45秒パルスのマイクロ波で再液化することができる。
    5. 60〜75°Cに冷却されるまで溶液をかき混ぜる。 冷却しながら攪拌することは、一部の寒天が固化する原因となる可能性のある冷却ムラを防ぐために重要です。
    6. 溶液が冷却されている間、水浴またはビーズ浴を65〜70°Cに加熱する。
    7. 溶液が 60 ~ 75 °C に冷却したら、液体添加剤 (0.5 M CaCl 22.0 mL、コレステロール 5 mg/mL 1 mL、1 M KPO 4 (pH 6.0)、および 0.5 M MgSO4 (すべての試薬のレシピについては表 1 を参照) を加え、溶液を約 5 分間混合して完全に混合できるようにします。
      注:薬物もここのプレートに含めることができます(例えば、100 mg/mLカルベニシリン1 mLと1 mLの1 M IPTGを加え、2.5 mg/mLのツニカマイシンを10 mL加え、400 mMパラコートを10 mL加えます)。
    8. NGM-寒天を入れたフラスコを65-70°Cの水浴に沈め、プレートに流し込む際にNGM-寒天が固化するのを防ぎます。
    9. 各60 mmプレートに9〜11 mLの溶液をピペットで、または各100 mmプレートに20〜30 mLの溶液をピペットで送ります。
      注:ピペット内の空気膨張によって引き起こされるNGM漏れを避けるために、利用可能な最小のピペット容量を使用することをお勧めします。ピペットを完全に空にしないように、各プレートに添加するよりも1〜2 mL多くの媒体をピペッティングすると、気泡の形成を防ぐのに役立ちます。あるいは、プレートをボトルから直接プレートに直接手で注ぐこともできますが、プレートを同じ容量にするためにピペッティングを強くお勧めします。溶液をプレートの上に直接塗布する方法を使用する場合、同じ体積プレートは、同様の濃度の溶液を確保するために重要です(ステップ1.1.17を参照)。等量はまた、プレート間で同様の焦点面を維持するための容易な顕微鏡観察を可能にする。
    10. ピペットを加熱溶液に戻して温度を維持し、NGM-寒天が固化するのを防ぎます。
    11. すべてのプレートについて、上記の2つの手順を繰り返します。
    12. NGM-寒天プレートを一晩固化させます。
    13. プレートが固まったら、プレートを4°Cで最大3ヶ月間保存するか、ステップ1.1.14に進んでプレートに細菌を播種します。プレートを密閉容器に保管して、水分を保持してプレートの品質を維持します。
    14. OP50の培養物を溶解ブロス(LB)または選択した同等の培地で周囲温度(〜22〜25°C)で24〜48時間増殖させるか、LB +抗生物質(HT115ではアンピシリン/炭水化物+テトラサイクリンが推奨されます)中のHT115の培養物を37°Cで12〜16時間振とうしながら成長させます。
      注:OP50のより積極的な成長が37°Cで見出されており、 これはC. elegans の寿命に影響するため、室温でOP50を成長させることをお勧めします。対照的に、HT115は増殖速度が遅く、密度の低い培養物を作ります。したがって、振とうしながらHT115を37°Cで成長させることをお勧めします。
    15. 100 ~ 200 μL の飽和 OP50/HT115 培養物を 60 mm プレートに、または 100 mm プレートの場合は 1 mL に播種します。
    16. プレートをベンチトップで一晩乾燥させ、プレートがまだ濡れている場合はさらに1日乾燥させます。プレートを密閉容器に4°Cで約2ヶ月間保管します。
    17. オプション:播種したNGM-寒天プレート(例えば、100 μLの10 mg/mL FUDR溶液)に直接薬物を加えて、ワームを化学的に滅菌します。
  2. C.エレガンス株の維持
    1. 播種したNGM-寒天プレートの底に適切にラベルを付けます。標準的な解剖顕微鏡の光の通過を妨げないように、プレートの底部の端にラベルを付けます。
    2. 標準的な解剖顕微鏡を使用して、選択した細菌を C. elegans ピックにすくい取ります。
      注:このプロトコルでは、ガラスパスツールピペットの端に取り付けられた90%/10%の白金/イリジウムワイヤで構成されるピックが使用されました。
    3. 細菌を使用して、10〜20個の卵、L1、L2、またはL3動物を収集し、それらを新しく標識された播種NGM寒天プレートに移す。
      注:若い動物を集めるのが最善です。著者らの経験では、標準的な野生型動物の場合、10〜20個の卵/若い動物を動かすと、プレートは飢餓なしに15°Cで成長することができます。繁殖力が低下したトランスジェニックまたは変異動物の場合、より多くの動物をプレートに移動する必要があります。
    4. 野生型繁殖力を有し、15°Cで生育した動物の場合、7日ごとにステップ1.2.1-1.2.3を繰り返して、毎週の在庫を維持する。20°Cで増殖した動物の場合、飢餓を防ぐために4〜5日ごとにステップ1.2.1〜1.2.3を繰り返します。
  3. ワームの同期 via 漂白
    注:完全な60 mm NGM-寒天プレート(例えば、15°Cで増殖させた1週間齢のストックプレート)は、記載されているほとんどの標準的なアッセイに十分な数の動物を提供します。一般的に、1人のグラビッド成虫(卵でいっぱいの成虫)は10〜15個の卵を提供します42そして、完全な60 mm NGM寒天プレートには、100〜200人のグラビッド成虫がおり、〜1000〜2000個の卵を提供します。
    1. より多くの動物を必要とするより大規模な実験のために、完全な60 mm NGM-寒天を4〜6個の等しい断片に切断し、それらを播種した100 mmプレートにチャンクして拡張する。
      注:ここでのチャンキングとは、ワームを含むNGM-寒天プレートの一部を切断し、寒天+ワームのチャンク全体を新しいプレートに移動し、ワーム側を下にしてワームが新しいプレートに這うことができるようにすることです。基準の枠組みとして、野生型の繁殖力を持つ動物は、チャンク化後2〜3日間20°Cで成長させると、完全な100mmプレートを生成します。
    2. 線虫の収集を開始するには、少量のM9溶液(表1)をワームを含むプレートに注ぎ、ペトリ皿を過剰に充填しないように注意します。M9溶液を静かに渦巻いて、細菌の芝生からワームをほぐします。
    3. 血清学的ピペットで肉質成虫を集め、ピペットチップで寒天を突き刺さないように注意してください。
      注: C.エレガン スはプラスチックに固執する傾向があるため、ガラス血清学的ピペットが推奨されます。ガラスピペットが利用できない場合は、プラスチックピペットに固執するために失われるものもあるため、必要以上に多くの動物から始めることをお勧めします。
    4. 1,100 x gで30秒間遠心分離することによって動物をペレット 化する。上清を吸引する。
      注: C. elegans ペレットは非常に緩いので、上清を吸引しながらペレットを振ったり混乱させたりしないように注意してください。
    5. 動物が遠心分離している間、1株あたり5mLの漂白溶液を調製する(レシピの詳細については 表1 を参照)。5 mL の溶液に、1.5 mL の 6% 次亜塩素酸ナトリウム (漂白剤)、0.75 mL の 5 M NaOH または KOH および 2.75 mL の dH2O を混ぜます。
      警告: 次亜塩素酸ナトリウムおよび高濃度水酸化物溶液は腐食性があるため、取り扱い時には手袋と白衣を着用することをお勧めします。
    6. 5mLの漂白液をワームペレット/M9混合物に加える。
    7. すべての成虫の体が溶解し、卵だけが混合物に残るまで、数分ごとに解剖顕微鏡でワームをチェックします。ワーム/漂白剤のミックスを激しく振って、漂白プロセスをスピードアップします。
      注:卵を漂白剤ミックスの中に長期間放置すると、卵が損傷し、動物の生存率に影響します。野生型動物の場合、漂白は通常、振盪で4〜6分かかります。したがって、4分のマークから30秒間隔で顕微鏡下で動物をチェックすることをお勧めします。
    8. 卵/漂白剤ミックスを1,100 x gで30秒間回転させて卵をペレット 状にします。
      注: 一部の 15 mL 円錐形チューブには、チューブの内側にグラデーション ラインがあります。これらのチューブでは、卵がチューブの底にペレット状になり、勾配線に残らないように、卵をより高速(例えば、2,000 x gで30秒)で回転させることが推奨される。
    9. 漂白溶液を吸引します。
      注:卵ペレットはワームペレットよりも硬いですが、それでも簡単に破壊される可能性があります。そのため、遠心分離後にチューブを振らないように注意してください。
    10. M9溶液を最大15mL添加し、チューブを4〜5回反転させて卵を洗浄し、卵がM9溶液中に完全に分散していることを確認する。
    11. ペレット卵を1,100 x g で30秒間遠心分離して卵をペレット化し、M9溶液を吸引する。
    12. 上記の2つのステップを繰り返して合計4回の洗浄を行い、卵ミックスから漂白剤を除去します。
    13. 最終洗浄後、卵を100 μLの2 mLのM9溶液に再懸濁する(すなわち、漂白されたワームの総数に依存する)。卵を徹底的に振って塊を分解し、ペレットが完全に蘇生していることを確認します。
    14. あるいは、動物をより厳密な時間的同期のためにL1逮捕することができる。L1停止のために、M9溶液を卵ペレットに15mLの円錐形チューブで〜10mLまで加える。ワームを回転子内で20°Cまたは周囲温度で最大24時間回転させます。L1動物は一般に、ステップ1.3.16で説明した卵のタイミングと比較して、成人期に達するのに半日もかかりません。
    15. 卵の濃度(またはL1濃度;ステップ1.3.14を参照)を近似するには、4 μLの卵/M9混合物を細菌を播種したNGMプレートにピペッティングします。μLメッキあたりに存在する卵の数を数えて計算します。カウントを 3 ~ 4 回繰り返して、近似値を改善します。
      注:卵の濃度を近似すると、過剰めっきを行わずに実験に適したサンプルサイズに十分な数の動物が播種され、飢餓の原因となります。
    16. 近似値に基づいて、適切な数の卵を、選択した細菌を播種したNGM-寒天プレートにプレートします。OP50プレートの場合、60 mmプレートに最大200匹、100 mmプレートに最大1,000匹をプレートします。HT115プレートの場合、60 mmプレートに最大150匹、100 mmプレートに600匹をプレートします。
      注:これらは当社のラボ条件に基づいて近似された数値であり、数値は細菌芝生の厚さに基づいて変更される可能性があります。15°Cで成長した卵は、成体1日目に達するまでに約5日かかります(産卵の最大、重厚な成体段階に達するには〜140時間)。20°Cで成長した卵は、成虫1日目に達するまでに約4日かかります(産卵最大、重力成体段階に達するまでに約96時間)。25°Cで成長した卵は、成体1日目に達するまでに約3.5日かかります(産卵の最大、重力成体段階に達するまでに約62時間)。
  4. C. elegansの個体群を同期させるための代替方法としての産卵
    1. 漂白プロトコルが実現不可能な場合(例えば、遠心分離機が利用できない場合)、 C.エレガンスの集団を同期させる代替方法として、産卵手順を実行する。このプロトコルはより労働集約的であり、動物の収量が少なくなることに注意してください。
    2. 産卵のために、8〜12匹のグラビッド成虫を、選択した細菌を播種した標準的なNGM-寒天プレートの上に置き、プレート上に置かれた動物の正確な数を文書化する。
      注:産卵手順は、実験に使用される温度で実行する必要があります。
    3. 動物が4〜8時間卵を産むのを許してください。
      注:動物がプレート上に残されている期間は、必要に応じて調整することができます。例えば、より少ない時間が利用可能なときに、より短い産卵期間のために、より多くの動物をプレートに置くことができる。 C. elegansは 一般的にバーストで卵を産むが、これは野生型の繁殖力を持つ動物では約5個の卵/hの割合で推定することができる43。ステップ 1.3.16 の推奨事項に従って、動物の過大評価を回避してください。
    4. すべての成体動物をプレートから取り除きます。
      注:プレート上に残された成体動物は卵を産み続け、その結果、集団が同期しません。
    5. 卵を15°Cで〜5日間、または20°Cで〜4日間置いて、成人1日目に達する。

2. C. elegansの寿命の測定

  1. 標準寿命
    1. NGM-寒天プレートを調製するには、プレートに100 μLの細菌を播種します。一貫性を保つために、すべての反復で同じバクテリアが使用されていることを確認してください。ワームは成虫期の産卵段階で毎日移動するので、寿命の間はNGM-寒天プレートを5〜7セット、成体期まで動物を成長させるためには1株あたり2〜4枚のプレートを播種する(すなわち、寿命のために15匹の動物の8枚のプレートを使用する場合、1条件あたり40〜56枚のプレートを播種する必要がある)。
    2. 保管前にプレートを一晩乾燥させてください。
      注:プレートは4°Cで保管し、必要な数のプレートを毎日冷蔵保管から取り除いて、バクテリアが厚い芝生を作って寿命を移動/計数することを困難にする可能性があります。プレートをプレートワームにする前にウォームアップしてください。
    3. ステップ1.3および1.4に記載されている標準的な漂白アッセイを使用して 、C. elegansの 同期集団を収集する。
    4. 10-15日目に成体動物1匹をそれぞれ8-12枚のプレートに移す。標準的な寿命を得るには、検閲イベント後にサンプルサイズが100をはるかに下回らないように、〜120匹から始めてください(例えば、15匹の8枚のプレート= 120匹、10匹の12匹のプレート= 120匹)。
      注:現在のケースでは、ほとんどの研究者にとって10〜15匹の動物が管理可能な数ですが、消耗品のコストを削減するために20匹の動物を6枚プレートすることも可能です。
    5. 最初の7〜8日間、または子孫が見えなくなるまで、成体動物を1〜2日ごとに子孫から遠ざけてください。
      注:動物は材料を節約するために1日おきに移動することができますが、子孫を持つ成人集団の汚染を防ぐために、卵/幼虫動物が成体と一緒に移動しないように注意する必要があります。この研究では、最も簡単な方法は、産卵が最大になる1〜3日目から毎日動物を動かし、産卵が最小の5〜8日目は1日おきに動物を動かすことに切り替えることです。この方法では、成虫は毎日移動し、卵/幼虫は1日で成虫期に発達することができないため、1〜3日目に卵/幼虫動物の移動を防ぐことは必須ではありません。
    6. 動物が子孫の産生を停止した後、すべての動物が死亡または検閲としてスコア付けされるまで、1日おきに寿命をスコアリングします。すべての死んだ動物や検閲された動物をプレートから取り除いて、混乱を避けたり、同じ動物を数えたりしないようにします。
      注:死は、ピックで優しく触れたときに動きを示さない動物としてスコアリングされます。検閲は、袋に入れられた動物、外陰部/腸の突起を示す動物、または乾燥するプレートの側面まで這い上がる動物として採点されます。
  2. FUDRを使用した化学殺菌による寿命
    1. NGM-寒天プレートを調製するには、プレートに100 μLの細菌を播種します。一貫性を保つために、すべての反復で同じバクテリアが使用されていることを確認してください。種子は寿命実験のために1株あたり8〜12プレート、および成体期まで動物を成長させるために1株あたり2〜4プレートとする。プレートを一晩乾燥させます。
    2. 100 μL の 10 mg/mL FUDR を細菌芝生の中央に加え、寿命アッセイに使用する 8 ~ 12 枚のプレートを作成します。動物が成人期まで成長できるように、スタータープレートとしてFUDRなしで2〜4枚のプレートを残すことを忘れないでください。プレートを一晩乾燥させます。
      注意: FUDR は DNA 合成をブロックするため、取り扱い時には手袋を着用することをお勧めします。
    3. ステップ1.3および1.4に記載されている標準的な漂白アッセイを使用して 、C. elegansの 同期集団を収集する。
      注:これらの動物は、FUDRが動物を逮捕/死なせるため、FUDRなしでプレート上で栽培する必要があります。
    4. 10〜15日目に成体動物1匹をそれぞれ8〜12枚のプレート上に移動し、FUDRを含む。標準的な寿命を得るには、検閲イベント後にサンプルサイズが100をはるかに下回らないように、〜120匹から始めてください(例えば、15匹の8枚のプレート= 120匹、10匹の12匹のプレート= 120匹)。
      注:子孫の形成を完全に避けることが不可欠な場合は、L4段階で動物をFUDRに移動することもできますが、動物を外陰部/腸の突起のリスクが高くなり、検閲が強化されるため、動物を早すぎる時期に移動させないでください。
    5. すべての動物が死亡または検閲済みとしてスコア付けされるまで、1日おきに寿命をスコア付けします。すべての死んだ動物や検閲された動物をプレートから取り除いて、混乱を避けたり、同じ動物を数えたりしないようにします。
      注:FUDRの寿命については、L1段階で逮捕され、最終的に死ぬため、子孫は無視できます。
  3. 温度に敏感な滅菌変異体を使用した寿命
    1. NGM-寒天プレートを調製するには、プレートに100 μLの細菌を播種します。一貫性を保つために、すべての反復で同じバクテリアが使用されていることを確認してください。種子は、寿命実験のために1株あたり8〜12プレート、および成体期まで動物を成長させるために1株あたり2〜4プレートである。プレートを一晩乾燥させます。
    2. ステップ1.3および1.4に記載されている標準的な漂白アッセイを使用して 、C. elegansの 同期集団を収集する。動物が無菌であることを確認するために、25°C (78 °F) の制限温度で動物を育てることを忘れないでください。
    3. 10-15日目に成体動物1匹をそれぞれ8-12枚のプレートに移す。標準的な寿命を得るには、検閲イベント後にサンプルサイズが100をはるかに下回らないように、〜120匹から始めてください(例えば、15匹の8枚のプレート= 120匹、10匹の12匹のプレート= 120匹)。
    4. すべての動物が死亡または検閲済みとしてスコア付けされるまで、1日おきに寿命をスコア付けします。すべての死んだ動物や検閲された動物をプレートから取り除いて、混乱を避けたり、同じ動物を数えたりしないようにします。
      注:短寿命株を扱う場合、25°Cでの寿命ははるかに短く、ダイナミックレンジが制限されるため、毎日寿命をスコアリングすることをお勧めします。著者の経験では、動物は2日目以降に20°Cに戻すことができ、20°Cで寿命をスコアリングすることが望ましい場合、動物は無菌のままになります。

3. C. elegansにおけるヘルススパンの測定

  1. スラッシング による 運動運動行動の測定
    1. ステップ1.3および1.4に記載されている標準的な漂白アッセイを使用して 、C. elegansの 同期集団を収集する。
    2. 1日目の成虫の小さなコロニーを、解剖スコープ下のNGM-寒天プレート上に10〜20μLのM9溶液上に移動する。10-15匹の動物は数えられる動物の管理可能な数として推薦されます。
    3. 一度に1匹のワームに焦点を当てて、標本が凹状から凸状に切り替わる回数を15秒で数えます。ハンドカウンターとタイマーを使用して、アッセイ期間中ワームに焦点を合わせることができます。
      注:プレートのビデオは、より徹底的/より簡単な分析のために記録される場合があります。たとえば、標準的な顕微鏡接眼レンズアタッチメントは、ほとんどのスマートフォンやデジタルカメラ($ 15-$ 30)で利用でき、これらは低コストでビデオスラッシングに最適なオプションです。
    4. 液体中の他のワームについてステップ3.1.3を繰り返し、10〜15匹のワームの総運動率を平均化します。サンプルサイズを大きくするには、手順3.1.2~3.1.4を繰り返します。
    5. ワームを希望の年齢にエイジアウトします。ステップ2.1〜2.3で説明した寿命アッセイのための同様の方法は、ワームの老化に使用することができる。ステップ3.1.2-3.1.4を繰り返して、所望の年齢でスラッシングをアッセイする。
      注: ステップ 3.1.2 の別の方法は、プレート上のワームのグループに 30 μL 以上の M9 溶液を添加することです。これにより、ワームを手動で転送する必要がなくなりますが、ワームが単一のプレート上のどこにいるかのランダムなチャンスのために、ワームのグループがプレート上の単一のポイントに残るという保証はありません。
  2. C. elegansにおける繁殖力(卵数)の測定
    1. ステップ1.3および1.4に記載されている標準的な漂白アッセイを使用して 、C. elegansの 同期集団を収集する。卵数に関するアッセイは、成人期1日目の〜1日前(15°Cで〜3日間またはL1停止後20°Cで〜2日間)であるL4段階で開始する。
    2. L4ワームを、選択した細菌を播種した別々のNGM-寒天プレートに選別します。〜10〜15匹の動物を繁殖力アッセイに使用することが推奨される。
      注:細菌芝生の卵の視認性を向上させるために、選択した細菌を50%希釈することをお勧めします(つまり、飽和培養物ではありません)。
    3. 動物が20°Cで一晩成長できるようにします。 新しく播種したプレートのバッチが翌日に備えられることを確認します。
    4. 成虫の1日目に、成虫を、選択した希釈細菌を播種した新鮮なNGM-寒天プレートに移します。
      注:厚い細菌芝生を防ぐために、播種したばかりのプレートを使用するか、使用するまでプレートを4°Cで保存することをお勧めします。
    5. 各NGM-寒天プレートに産まれた卵の総数を数えます。
      メモ:プレートのスキャンを支援するために、プレートの蓋にグリッドを描き、卵のスコアリングされているプレートの下に置くことができます。その後、プレートをグリッド線に沿ってスキャンして、プレートが移動しても向きを維持し、卵の再カウントを防ぐことができます。
    6. ステップ3.2.4-3.2.5を7-8日間、または卵がプレートに表示されなくなるまで繰り返します。
      注:産卵率が高い1〜3日目には、少なくとも12時間ごとに動物を移動し、1日2回卵数を測定することをお勧めします。しかし、これは消耗品の作業量とコストを増加させるため、動物の移動と測定は1日1回に制限することができますが、すべての卵と孵化した動物が適切に数えられるように注意する必要があります。孵化した動物は、このアッセイの目的のために卵としてカウントされます。
  3. C. elegans子孫のひなの大きさ(発達)の測定
    1. ステップ1.3および1.4に記載されている標準的な漂白アッセイを使用して 、C. elegansの 同期集団を収集する。ひなの大きさのアッセイは、成人期1日目の〜1日前(15°Cで〜3日間またはL1停止後20°Cで〜2日間)であるL4段階で開始する。
    2. L4ワームを、選択した細菌を播種した別々のNGM-寒天プレートに選別します。〜10〜15匹の動物を繁殖力アッセイに使用することが推奨される。
    3. 動物が20°Cで一晩成長できるようにします。 新しく播種したプレートのバッチが翌日に備えられることを確認します。
    4. 成虫の1日目に、成虫を選択した細菌を播種した新鮮なNGM-寒天プレートに移します。
    5. 12〜24時間ごと(1日2回または1日1回)、成虫を7〜8日間、または子孫が見えなくなるまで、選択した細菌を播種した新鮮なNGM-寒天プレートに移します。卵の入ったプレートを全て20°Cに保ちます。
    6. 手順 3.3.5 を 7 ~ 8 日間、または子孫が見えなくなるまで繰り返します。卵の入ったプレートを全て20°Cに保ちます。
      注:子孫プレートは、スコアリングが必要になるまでの時間を延長するために、15°Cで保存することもできます。
    7. ワームを移してから2日後、プレート上の発達した子孫を数えます。L4段階(すなわち、20°Cでの孵化の2日後)またはそれ以前に発達中のワームを数えて、F2世代(すなわち、子孫の子孫)が結果を混乱させないようにする。生きているすべてのワームを数えます。
      1. カウントされた状態でプレートからすべてのワームを取り除きます。プレートをさらに1〜2日間維持してから再度採点し、孵化/発育が遅れている動物が見逃されないようにします。
    8. 採取したすべての産卵プレートについて、手順3.3.7を繰り返します。
      注:ひなサイズアッセイは、卵数アッセイ(ステップ3.2)と組み合わせて実施することができ、1つの実験から2セットのデータを収集することにより、消耗品の労力とコストを最小限に抑えることができます。これにより、同じ動物内のひなのサイズと卵の数を直接比較することもできます。

4. C. elegansにおけるストレス回復力の測定

  1. ツニカマイシンを用いたERストレス感受性の測定
    1. NGM-寒天プレートを作製するには、チュニカマイシンを含むプレート(ステップ1.1.7、注を参照)に100 μLの細菌を播種します。
      注意:ツニカマイシンを取り扱うときは、手袋を着用してください。
    2. 一貫性を保つために、すべての反復で同じバクテリアが使用されていることを確認してください。生存アッセイのために1株当たり8〜12個のツニカマイシンプレートを、および成体期まで動物を増殖させる1株当たり2〜4枚のツニカマイシンを含まないプレートを種子とする。プレートを一晩乾燥させます。
    3. ステップ1.3および1.4に記載されている標準的な漂白アッセイを使用して 、C. elegansの 同期集団を収集する。
      注:動物はチュニカマイシンで逮捕/死亡するため、動物は成人期の1日目までチュニカマイシンを含まないプレートで栽培する必要があります。
    4. 10-15日目に成体動物1匹をそれぞれ8-12枚のプレートに移す。標準的な生存アッセイでは、検閲イベント後にサンプルサイズが100をはるかに下回らないようにするために、〜120匹から始めます(例えば、15匹の8つのプレート= 120匹;10匹の12匹のプレート= 120匹)。
      注:FUDRアッセイと同様に、ツニカマイシンはL1動物の死/逮捕を引き起こすため、ツニカマイシン生存アッセイは動物を動かさずに実行できます。しかし、DMSOコントロールを行うと、子孫はDMSOプレート上で発達するため、動物を毎日移動させるか、滅菌技術が必要になります(生存アッセイには、セクション2で使用されているのと同じ方法を生存アッセイに使用できます)。
    5. 生存アッセイは、寿命と同様にスコアリングされる。すべての死んだ動物や検閲された動物をプレートから取り除いて、混乱を避けたり、同じ動物を数えたりしないようにします。
      注:1日おきに動物をスコアリングすることは可能ですが、ツニカマイシンでは死亡が急速に起こるため、毎日生存アッセイをスコアリングすることをお勧めします。
  2. パラコートを用いたミトコンドリア/酸化ストレス感受性の測定
    1. パラコートを含むプレートを播種することによってNGM-寒天プレートを準備する(ステップ1.1.7;注)100μLの細菌を選択した。
      警告: パラコートを取り扱うときは、環境上の危険があるため、手袋を着用してください。多くの研究機関が環境上の危険に対して特定の廃棄指示を必要とするため、廃棄の要件については、機関の環境衛生と安全性を確認してください。
    2. 一貫性を保つために、すべての反復で同じバクテリアが使用されていることを確認してください。種子は、生存アッセイのために1株あたり8〜12プレート、および成体期まで動物を成長させる1株あたりパラコートを含まない2〜4枚のプレートである。プレートを一晩乾燥させます。
    3. ステップ1.3および1.4に記載されている標準的な漂白アッセイを使用して 、C. elegansの 同期集団を収集する。
      注:成人期の1日目までパラコートなしで皿の上で動物を育てることを忘れないでください。しかし、一部の動物はパラコートプレート上で成虫期に発達する可能性があるため、滅菌技術を実行するか、成虫を子孫から遠ざける必要があります(ステップ2.2-2.3を参照)。
    4. 10-15日目に成体動物1匹をそれぞれ8-12枚のプレートに移す。標準的な生存アッセイでは、検閲イベント後にサンプルサイズが100をはるかに下回らないようにするために、〜120匹から始めます(例えば、15匹の8つのプレート= 120匹;10匹の12匹のプレート= 120匹)。
    5. 生存アッセイは、寿命と同様にスコアリングされる。すべての死んだ動物や検閲された動物をプレートから取り除いて、混乱を避けたり、同じ動物を数えたりしないようにします。
      注:動物を1日おきにスコアリングすることは可能ですが、パラコートでは死亡が急速に起こるため、毎日生存アッセイをスコアリングすることをお勧めします。これは、25°Cで成長した glp-4(bn2) 動物を使用する場合に特に当てはまります。
  3. 高温による熱応力感受性(耐熱性)の測定
    1. ステップ1.3および1.4に記載されている標準的な漂白アッセイを使用して 、C. elegansの 同期集団を収集する。
    2. NGM-寒天プレートを37°Cに予備温めてから、プレートを37°Cのインキュベーターに少なくとも1時間入れて、動物をプレート上に移動させます。
    3. 10-15日目に成体動物1匹を、あらかじめ温めたプレートにそれぞれ4~6枚ずつ移動させる。標準的な耐熱性の場合、約60匹の動物から始めます(例えば、15匹の4つのプレート= 60匹;10匹の6つのプレート= 60匹)
    4. 動物を37°Cのインキュベーターに入れ、2時間ごとに死亡のスコアを付けます。死とは、ピックで優しく触れても動きを示さない動物と定義されます。すべての死んだ動物や検閲された動物をプレートから取り除いて、混乱を避けたり、同じ動物を数えたりしないようにします。
    5. スコアリング中に周囲温度に長時間放置すると耐熱性の結果が変わるため、プレートを37 °Cのインキュベーターからできるだけ最小限の時間取り外すようにしてください。
      注:寒天の温度は1つの株を採点するのにかかる時間内に劇的に変化してはならないため、一度に1つの株だけを採取してスコアリングすることをお勧めします。
    6. 中央熱耐性は、一般に7〜9時間で達成される。したがって、7時間、9時間、および11時間で適切なアッセイを確認してください。
      注:各ラボでのインキュベーターの変動性、プレートの厚さ、およびその他の交絡因子により、1〜5時間はスキップできますが、タイムポイントをスキップする予定がある場合は、各ラボでタイミングを慎重に滴定することが重要です。耐熱性に関する完全なガイドについては、リファレンス 44 を参照してください。
    7. あるいは、37°Cではなく34°Cで耐熱性アッセイを行う。
      注:34°Cでの熱耐性の中央値はずっと後(この研究では10-14時間)に発生するため、耐熱性アッセイを深夜(34°Cのインキュベーターに入れた)に調製し、スコアリングを翌日の早い時間に開始することができます。これにより、37°Cの耐熱性アッセイに必要な典型的な12時間の期間ではなく、〜8時間の継続的なスコアリングが可能になります。

結果

C. elegans は、老化メカニズムの大部分がヒトとともに保存されているため、老化研究のための優れたモデル生物である。重要なことに、彼らは機器や消耗品の最小限の要件でメンテナンスと実験のコストが非常に低いため、資金が限られている機関にとって切望されているモデルシステムとなっています。さらに、学習曲線が浅い単純なアッセイが多数あるため、経験がほとんどまたはまったくない最年少の研究者にとっても優れたシステムになります。これらすべての要因は、ゲノム編集の容易さ、名目上のコストで利用可能な何千もの変異体およびトランスジェニック動物、および事実上すべての遺伝子の遺伝的ノックダウンのための利用可能なRNAiライブラリを含む C. elegans の強力な遺伝学と相まって、それらを学部機関にとって理想的なシステムにしています。ここでは、 C. elegans の老化を研究するための最も低コストの方法のいくつかが調査され、主に最小限の機器と消耗品コスト、および浅い学習曲線でのアッセイに焦点を当てています。実際、プロトコルとデータ収集の全体は、<5ヶ月の研究経験を持つ若い研究者、主に学部生によって書かれ/実行されました。

C. elegansの長寿研究は、動物の寿命が短く、14〜20日であるため、非常に簡単です。重要なことに、寿命アッセイは高度に標準化されており、NGM-寒天プレートを調製するためのインキュベーター、標準解剖顕微鏡、標準ワームピック、および消耗品のみが必要です。おそらく、C. elegansの寿命測定の最もコストがかかりすぎる側面は、必要な消耗品です。これは、C. elegansが自己受精する雌雄同体であるためです。したがって、長寿アッセイのために追跡されている成人は、毎日子孫から離れる必要があります。しかし、動物は、FUDRに曝露するか、または法外な25°Cで増殖させた温度感受性生殖細胞系列レスglp-4(bn2)変異体などの変異体を使用して、必要な消耗品の量を減らすことによって滅菌することができる30、31、32。ここでは、寿命アッセイをFUDRまたはglp-4(bn2)生殖細胞系列レス変異体を用いて実施し、非滅菌動物に対して実施した標準寿命と同様の結果を示した。野生型の寿命は、寿命2に対するFUDR45または25°Cでの成長の影響により同一ではありませんが、短命のhsf-1ノックダウン動物は、すべての条件について寿命の大幅な低下を確実に示しています(図1)。hsf-1は、熱応力応答の調節に関与する熱衝撃因子-1転写因子をコードし、そのノックダウンは寿命の有意な減少をもたらす38,46。

長寿は老化生物学において考慮すべき重要な要素であるが、C . elegans47でさえ、長寿はしばしば健康の増加と相関しない。したがって、補完的なアプローチとして、リプロダクティブヘルス、運動行動、ストレスレジリエンスなど、生物の健康を測定するいくつかの方法を提供しています。リプロダクティブヘルスは、2つの方法のいずれかで測定できます。まず、卵数の測定は、単一の自己受精雌雄同体によって産まれた卵の数を直接測定します。しかし、動物は精子よりも多くの卵母細胞を産生するので、生存可能な子孫を決して産生しないいくつかの未受精卵も産まれる48。したがって、動物の真の生殖能力をよりよく理解するために、ひなの大きさの測定は、生存可能な子孫の数の尺度を提供する。多くの場合、ストレス回復力の増加は、潜在的に生殖に対する知覚されたストレスの固有の影響のために、実際に生殖能力を低下させる可能性がある49。同様に、野生型対照と比較して 、hsf−1 過剰発現動物において、産卵数およびひなサイズの両方の有意な減少が見出される(図2A、B)。実際、 いくつかのhsf-1 過剰発現動物は完全な不妊症を示し、リプロダクティブヘルスが長寿と逆相関し得るという証拠を提供する。

生殖に関する健康は、生殖細胞系列の健康、機能的減数分裂、生殖能力を理解する上で重要ですが、一般に、長寿とひなのサイズ50との間に直接的な相関関係はありません。したがって、補完的なアプローチとして、自発運動行動は、51歳の間にC. elegansの健康寿命をアッセイするためのゴールドスタンダードの方法として提供される。運動行動を測定する方法はたくさんありますが、ほとんどの方法では高度なカメラ、追跡ソフトウェア、または高価な化学物質が必要です。対照的に、スラッシングアッセイでは、標準的なC. elegansラボが装備しているもの(解剖顕微鏡、ワームピック、ピペット、NGM-寒天プレートを製造するための消耗品)以外の機器は事実上必要ありません。スラッシング率は、若い動物と比較して高齢動物のスラッシングの有意な減少によって測定されるように、加齢中の健康寿命を測定するための信頼性の高い方法を提供します(図2C)。

最後に、ストレスアッセイに対する生存は、回復力の追加の生理学的測定である。ストレス応答を活性化する能力は、一般に老化過程の間に低下し、動物を弾力性を低下させ、ストレスに対してより敏感にする。したがって、ストレスレジリエンスは、生物の健康のための信頼できるプロキシとして使用することができます。ここでは、N結合型グリコシル化を遮断し、ER中のミスフォールディングタンパク質の蓄積をもたらす化学物質であるツニカマイシン曝露に応答して、1)ERストレスに対する感受性を調査するための方法が提供される。2)ミトコンドリアのスーパーオキシド形成を誘導する化学物質であるパラコートへの曝露によるミトコンドリア/酸化ストレス;3)高温への暴露による熱応力。ツニカマイシンおよびパラコートアッセイの場合、薬物はプレート製造中にNGM-寒天プレートに組み込まれる。高濃度のツニカマイシンの場合、子孫は一般に発達しないので、滅菌技術を使用する必要はない。ここで提示されたプロトコールは、ツニカマイシンの最終濃度として25ng/μLを推奨しているが、資金が限られている人々にとって、10ng/μLも生存率の有意な低下を示す(図3A)。どちらの濃度も子孫の発育を制限するため、滅菌方法は必要ありませんが、DMSO制御には滅菌技術または動物の新しいプレートへの移動が必要です。これは、ツニカマイシン毒性が子孫の発達を妨げるためであるが、DMSOは事実上無毒であり、チュニカマイシンで増殖すると子孫が完全に発達することを可能にする。

パラコートアッセイでは、パラコート治療は子孫が成人期に発達するのを妨げないため、滅菌技術または動物の動きのいずれかが必要です。高レベルのパラコート(4mM)は寿命を著しく短くし、低レベルのパラコート(0.25mM)はホルミスティック効果のために寿命を延ばす(図3B)が、以前に発表された結果と一致する52。最後に、耐熱性アッセイは、30-37°Cに達することができるインキュベーターのみを必要とし、追加の試薬は必要ありません。hsf-1の過剰発現は、以前に公表された53のように37°C(図3C)における耐熱性を増加させる。しかし、他の人が以前に、そして現在のデータから示したように、耐熱性アッセイの主な問題は、それらの変動性である。インキュベーターと動物がインキュベーターの外で過ごす時間の違いや、1時間ごとに熱耐性をスコアリングする時間など、多くの要因が耐熱性アッセイ内の変動性に寄与する可能性があります。耐熱性の徹底的なガイドラインについては、参考文献41を参照してください。

figure-results-1
図1:滅菌の有無による寿命測定値の比較。(A)空のベクター(ev)またはhsf-1 RNAi細菌を20°Cで播種したNGM-寒天プレート上で増殖させた野生型N2線虫の寿命。 動物は成虫期の1日目、3日目、5日目、および7日目に子孫から遠ざかった。(B)20°Cで空のベクター(ev)またはhsf-1 RNAi細菌を播種したNGM-agar-FUDRプレート上で増殖した野生型N2線虫の寿命。 動物を標準的なevまたはhsf-1 RNAiプレート上で成人期まで成長させ、次いで成人期の1日目にFUDRプレートに移動した。(C)25°Cで空のベクター(ev)またはhsf-1 RNAiを播種したNGM-寒天プレート上で増殖させたglp-4(bn2)変異動物の寿命。 すべての条件について、すべての動物が死亡または検閲として記録されるまで、動物は2日ごとに死亡についてスコア付けされました。外陰部の袋詰め、突出、または爆発を伴う動物、またはプレートの側面を這い上がって乾燥させた動物は検閲された。すべての統計量は、ログランクマンテルコックス検定を使用して実行され、表2に見出すことができます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
(A)スラッシングアッセイは、1日目(青)、4日目(赤)、および9日目(緑)に25°Cで空のベクターを播種したNGM-寒天プレート上で増殖したglp-4(bn2)変異動物に対して実施した。スラッシングは、NGM-寒天プレート上のM9溶液に入れた動物でスコアリングし、標準的な解剖スコープの接眼レンズに取り付けられた標準的なスマートフォンカメラを使用してビデオを記録し、スラッシングは精度のためにスローモーションでスコアリングした。n = 条件あたり15匹の動物。(B)卵数は、野生型N2(青)およびsur-5p::hsf-1(赤)動物で測定した。動物を20°Cで増殖させ、新鮮なプレート上に移動し、卵を12時間ごとに数えた。産卵した卵の総数を合計した。n = 野生型の場合は7匹、sur-5p::hsf-1の場合は9匹。(C)孵化を可能にするために卵を20°Cで2日間成長させた(B)と同じ動物でひなアッセイを測定し、孵化した卵をすべて計数した。= p <ノンパラメトリックマン・ホイットニー検定を用いて計算された0.001。各ドットは単一の動物を表し、線は中央値と四分位範囲を表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:生物の健康への代理としてのストレス回復力(A)20°Cで空のベクターRNAi細菌上で増殖させたN2動物の生存アッセイ。 動物を、成人期の1日目に、1%DMSO、10ng/μLツニカマイシン(商標)、または25ng/μLTMのいずれかを含むプレートに移した。(b)20°Cで空ベクターRNAi細菌上に増殖させたN2動物の生存アッセイ。 動物を、水、0.25 mM パラコート(PQ)、または4 mM PQのいずれかを含むプレート上のハッチから成長させた。A-Bでは、すべての動物が死亡または検閲済みとして記録されるまで、2日ごとに動物を死亡についてスコア付けしました。外陰部の袋詰め、突出、または爆発を伴う動物、またはプレートの側面を這い上がって乾燥させた動物は検閲された。すべての統計量は、対数ランクマンテルコックス検定を使用して実行した(表2)。(C)野生型N2動物に対するすべての37°C耐熱性アッセイのプールされたデータ対hsf-1の過剰発現(sur-5p::hsf-1)。データは、耐熱性アッセイの時間 = 9 時間で生存率として表され、各ラインは同じ日に実行された一致した実験を表します。動物を20°Cで空のベクターRNAi細菌上で増殖させ、アッセイのために成体期の1日目に37°Cに移動した。n=1株当たり60匹の動物を1回の反復につき。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

試薬レシピ
漂白剤溶液1.8% (v/v) 次亜塩素酸ナトリウム、0.375 M KOH
カルベニシリン水中の100mg/mLの原液(1000x)。4 °C で最大 6 か月間保存、または長期保存の場合は -20 °C で保存
ティッカー水中の10mg / mL溶液。-20°Cで保存してください。
ティッカー水中の1 M溶液。
リゾジェニーブロス(LB)このプロトコールでは、市販のLBが使用されましたが(材料表を参照)、バクトトリプトン、酵母エキス、およびNaClを使用したすべての標準的なLB自家製レシピで十分です。
M9ソリューション22 mM KH 2PO 4 モノ塩基、42.3 mM Na2HPO 4、85.6 mM NaCl、1 mM MgSO 4
線虫成長培地(NGM)1 mM CaCl 2, 5 μg/mL コレステロール, 25 mM KPO 4 pH 6.0, 1 mM MgSO4,2% (w/v) 寒天, 0.25% (w/v) バクトペプトン, 51.3 mM NaCl
NGM RNAiプレート1 mM CaCl 2, 5 μg/mL コレステロール, 25 mM KPO 4 pH 6.0, 1 mM MgSO4,2% (w/v) 寒天, 0.25% (w/v) バクトペプトン, 51.3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL カルベニシリン/アンピシリン.暗所で4°Cで最大3ヶ月間保存する
NGM RNAi DMSO1 mM CaCl 2, 5 μg/mL コレステロール, 25 mM KPO 4 pH 6.0, 1 mM MgSO4,2% (w/v) 寒天, 0.25% (w/v) バクトペプトン, 51.3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL カルベニシリン/アンピシリン;1% DMSO
(ツニカマイシンのコントロール)
NGM RNAi TM1 mM CaCl 2, 5 μg/mL コレステロール, 25 mM KPO 4 pH 6.0, 1 mM MgSO4,2% (w/v) 寒天, 0.25% (w/v) バクトペプトン, 51.3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL カルベニシリン/アンピシリン;1% DMSO、25 ng/μL ツニカマイシン
パラコート水中の400 mM溶液 - 新鮮に調製する必要があります
テトラサイクリン10mg/mL の原液 (500x) を 100% エタノール中。-20°Cで保存
ツニカマイシン100%DMSO中の2.5mg/mLの原液。-80°Cで保存し、長期保存してください。これは100xソリューション(25ng / μLの作業ソリューション)です。

表 1.試薬のレシピとプロトコル用のメディア。

対応する図パネルひずみ, 治療寿命の中央値# 死亡数/# 合計p値
(ログランク)
1AN2、ベクターRNAi、20°C1774/120--
N2, hsf-1 RNAi, 20 °C1165/120<0.001
1BN2、ベクターRNAi、FUDR、20°C19120/120--
N2, hsf-1 RNAi, FUDR, 20 °C11116/120<0.001
1CN2, glp-4(bn2), ベクターRNAi, 25 °C13115/121--
N2, glp-4(bn2), hsf-1 RNAi, 25 °C4120/120< 0.001
2AN2、ベクターRNAi、20°C、1%DMSO1985/120--
N2、ベクターRNAi、20°C、10 ng/μL ツニカマイシン15109/120<0.001
N2、ベクターRNAi、20°C、25 ng/μL ツニカマイシン12117/120<0.001
2BN2、ベクターRNAi、20°C1984/120--
N2、ベクターRNAi、20°C、0.25 mM パラコート2491/120<0.001
N2、ベクターRNAi、20°C、4mMパラコート650/120<0.001

表 2.寿命とストレス回復力の統計。

ディスカッション

寿命は、最も簡単には寿命として定義され、ほとんどの生物において、生物が生きているか生きていないかにかかわらず、明確な二項現象です。しかし、長寿は必ずしも生物の健康と相関しているわけではありません。例えば、ミトコンドリアストレスへの曝露が寿命を劇的に延ばすミトコンドリアホルミシスモデルは、一般に最も長生きしている動物の一部であるが、発育不全および代謝機能の低下を示す37,54。同様に、過活動小胞体ストレス応答を有する動物も、タンパク質恒常性および寿命が劇的に改善されたにもかかわらず、健康の低下と相関し得る特定の行動および表現型を示す36,49。最後に、HSF-1機能55の増加、XBP-1機能56の増加、およびFoxOシグナル伝達の変化57を含むモデル生物における多くの長寿パラダイムはすべて、がんリスクの増加と相関しており、生物ががんおよび他の健康疾患と絶えず闘っている場合、寿命の延長が有益ではないことは議論の余地がない。したがって、長寿は老化生物学における独立した測定ではあり得ません。

したがって、ヘルススパンの概念は、老化生物学の成長分野となっています。健康寿命は、大まかに言えば、健康である人生の期間として定義され、長寿よりも確認するのが難しいです。しかし、長寿とは異なり、「健康」の概念は、生物の健康には多くの異なる読み方があるため、複雑です:生物レベルでは、筋肉機能/強度、ニューロン/認知機能、リプロダクティブヘルスなどがあります。細胞レベルでは、タンパク質恒常性、脂質恒常性、グルコース恒常性、代謝などがある。2014年、老化生物学者は、老化の生物学的特徴を、老化の間に自然に分解し、実験的悪化が老化を加速し、実験的介入が老化を遅らせるように実験的に変更できるものでなければならないという構造化された定義で決定的に特徴付けた。老化のこれら9つの特徴には、ゲノム不安定性、テロメアの消耗、エピジェネティックな変化、タンパク質恒常性の喪失(プロテオスタシス)、幹細胞の枯渇、細胞間シグナル伝達の変化、ミトコンドリア機能障害、調節解除された栄養センシング、および細胞老化が含まれる58。それ以来、多くの研究が、細胞外タンパク質や免疫や炎症などの全身生理学を含む他の要因を含めるべきだと主張しています59。究極的には、healthspanの複雑な定義は、生物の健康が複数の異なる方法を使用して測定されることを義務付けています。

したがって、この原稿では、線虫モデルであるC. elegansを使用してヘルススパンのさまざまな側面を測定するための複数の方法が提示されています。スラッシングアッセイを用いた運動行動、卵数とひなの大きさを用いたリプロダクティブヘルス、ストレスに対する感受性をアッセイします。実際、運動運動行動は、生物が51歳の間に運動性と運動の著しい喪失を示すため、健康寿命を測定するためのゴールドスタンダードな方法です。C. elegansにおける筋肉機能は、適切なプロテオスタシス60、ミトコンドリア機能障害61、およびニューロン - 筋肉シグナル伝達62に依存するので、自発運動行動の喪失は、老化の複数の特徴に起因する可能性がある。この論文は運動行動の1つの測定に焦点を当てているが、固体寒天プレート上の動物の運動性、接触に対する応答51、走化性アッセイ63など、他の多くの方法が存在することに注意することが重要です。しかし、これらの方法は一般に、より洗練された記録装置、ワーム追跡ソフトウェアの使用、または高価で危険な、または揮発性の化学物質の使用を必要とし、これらはすべて一部の研究環境では禁止されている可能性があります。

さらに、成虫ワームは有糸分裂後であり、生殖細胞および胚のみが成虫ワーム内で細胞分裂を受けるので、卵数およびひなサイズのアッセイは、生殖に関する健康を測定する方法として、および成虫ワームの細胞分裂を測定する最も簡単な方法として提示される64。細胞分裂の尺度として、リプロダクティブヘルスは、細胞老化および幹細胞枯渇の老化の特徴に関連し得る。リプロダクティブ・ヘルスは、病原性感染症65やストレス49への曝露など、多くの要因の影響を受ける可能性があるが、リプロダクティブ・ヘルスと長寿の間に直接的な相関関係はない。実際、いくつかの長寿動物は、ひなのサイズ49の有意な減少を示し、長寿とひなのサイズ50との間に逆相関が存在する可能性さえある。これはC. elegansに特有の現象ではなく、生殖の長寿に対する有害な影響がヒト66、コンパニオンイヌ67、およびマウス68で長い間観察されてきた。それでも、私たちはリプロダクティブヘルスを測定するための信頼性が高く低コストの方法として卵数とひなのサイズを提供していますが、リプロダクティブヘルスは長寿や健康寿命と相関しない可能性があることに注意してください。

最後に、生存アッセイは、生物の健康の間接的な尺度として提供される。重要なことに、熱ストレス69およびERストレス35に対する応答を含む細胞ストレス応答は、老化プロセス中に急速に低下し、プロテオスタシス70、71の老化特徴に直接関連している。対照的に、過活性化ストレス応答は、ストレスに対する回復力を促進することによって寿命を有意に延ばすことができる35,37,38。この研究は、最も単純で低コストの方法に焦点を当てていますが、耐熱性41および酸化ストレス66には、ストレスレジリエンスアッセイのための多数の代替方法が存在し、それぞれが異なる機器および消耗品のセットを必要とする。ストレッサーへの単純な曝露研究を超えて、機器へのアクセスに応じて他の生理学的方法を実行することができます。例えば、細胞外フラックス分析装置は、ミトコンドリア機能および細胞呼吸をモニターすることができる73;蛍光解剖顕微鏡は、ストレス応答活性化のための転写レポーターの測定を可能にする20;高分解能化合物または共焦点顕微鏡は、ミトコンドリア74、小胞体75、76、およびアクチン細胞骨格77の蛍光プローブを用いてオルガネラの形態を測定するために使用することができる。

寿命の測定のための最後の警告として、ワームを殺菌するための化学的および遺伝的方法がコストを大幅に削減するために提供されていますが、どちらも寿命に直接影響を与える可能性があることに注意することが重要です。例えば、FUDRへの曝露は、寿命および耐熱性45の両方に影響を与えることが以前に報告されている。glp-4(bn2)変異体自体は寿命に直接影響しませんが、25°Cでの成長は軽度の熱ストレス33,34であり、したがって寿命2に影響を与える可能性があります。C.エレガンスを滅菌するための他の方法が存在し、オーキシン媒介性無菌性78または代替の温度感受性精子欠損変異体79を含む。しかし、すべての方法にはいくつかの注意点があり、各研究室の科学的ニーズに対して最も有害でないアッセイを利用するように注意する必要があります。長寿研究の最後の制限の1つは、サンプルサイズが低いか、単に研究者による客観的なエラーによって発生する可能性のある変動性です。自動化された寿命技術80で新しい技術が生まれるので、これは回避することができますが、これらのシステムはコストがかかり、エンジニアリングと計算機器とスキルが必要です。結局のところ、ここで提供される方法のコレクションは、ほぼすべての機関で迅速に適応および学習でき、老化生物学の強固な基盤を提供できる信頼性の高いツールセットです。

開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

G.G.はT32AG052374、R.H.S.は国立老化研究所のR00AG065200によってサポートされています。我々は、この株についてCGC(NIH研究インフラプログラム事務局P40 OD010440が資金提供)に感謝する。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
APEX IPTGGenesee18-242RNAi
クト寒天VWR90000-764NGM プレート用
バクト ペプトンVWR97064-330NGM プレート
塩化カルシウム二水和物VWR97061-904NGM プレート用
カルベニシリンVWR76345-522RNAi
コレステロールVWR80057-932NGMプレート用
DMSOVWRBDH1115-1LP溶剤
LBブロスVWR95020-778LB用
硫酸マグネシウム七水和物NGMプレート用 VWR97062-132、M9
ParaquatSigma-Aldrich36541酸化/ミトコンドリアストレス用
塩化カリウムVWR漂白剤solutonのための
カリウム二塩基性VWRNGMの版EM-PX1570-2
S7Eの解剖のスコープのためのリン酸
カリウムの一塩基性VWREM-PX1565-5
ナトリウムVWREM-SX0420-5NGMの版、M9
次亜塩素酸ナトリウム漂白剤溶液VWRRC7495.7-32
リン酸ナトリウム二塩基性VWR71003-472、M9
テトラサイクリン塩酸塩用、RNAi用VWR97061-638、
ERストレス用ニカマイシンシグマ-アルドリッチT7765-50MG
バ用 97061-566リン酸のための M9 Leica 10450840 標準的な解剖顕微鏡塩化用、ツ

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