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方法論記事

鼻ブレオマイシン噴霧により誘発される肺線維症のマウスモデル

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DOI:

10.3791/64097

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2023年1月20日

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1Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Center of Respiratory Medicine, China-Japan Friendship Hospital, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Institute of Respiratory Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 2Graduate School of Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, 3Capital Medical University, 4Beijing University of Chinese Medicine, 5Tianjin Chest Hospital, 6Institute of Clinical Medical Sciences, China-Japan Friendship Hospital, 7Beijing Key Laboratory for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, Institute of Clinical Medical Sciences, China-Japan Friendship Hospital

この記事について

サマリー

ブレオマイシンを用いた肺線維症の様々な動物モデルが確立されており、肺線維症の病態解明や新たな創薬標的の探索が進められています。しかし、肺組織を標的とする肺線維症モデルの多くは、薬剤の投与にばらつきがあります。ここでは、鼻ブレオマイシン噴霧によって誘発される均一な肺線維症のモデルを提案します。

要約

肺線維症は、さまざまな原因から生じるいくつかのヒト肺疾患に特徴的です。治療の選択肢がかなり限られていることを考えると、マウスモデルは新しい抗線維化戦略を開発するための重要なツールであり続けています。この研究では、ブレオマイシン (BLM) の肺内投与を鼻噴霧によって行い、臨床疾患の特性を厳密に模倣した肺線維症のマウス モデルを作成します。C57BL/6マウスは、鼻噴霧によりBLM(7 U/mL、30分/日)を3日間連続して投与し、9日目、16日目、または23日目に犠牲にして肺組織の炎症性および線維性変化を観察しました。経鼻エアロゾル化BLMは直接肺を標的とし、広範で均一な肺の炎症と線維化をもたらしました。これにより、典型的なヒト肺線維症の実験用マウスモデルを作成することに成功しました。この方法は、さまざまな鼻エアロゾルの投与が肺の病態生理学に及ぼす影響を研究し、新しい抗炎症および抗線維化治療を検証するために簡単に使用できます。

概要

肺線維症は、細胞外マトリックス成分(主にI型コラーゲン)が肺の間質に過剰に沈着すると肺機能障害を引き起こす進行性の疾患プロセスです1。肺線維症の病態生理学は複雑であり、治療の選択肢は現在非常に限られています。マウスモデルは、疾患の発生と進行に寄与する病原性メカニズム、および医薬品開発の新しい戦略を研究するための重要なツールであり続けています。

肺線維症のさまざまな動物モデルは、BLM 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 の気管内注入に依存しています。しかし、BLMが肺に引き起こす線維性変化の分布は均一ではなく、動物は点滴プロセス中に窒息するリスクがあります。BLMの腹腔内注射は、肺に比較的均一な線維性変化を誘発しますが、薬物の標的が不十分なため、複数回の投与が必要です。喉頭鏡による気管内エアロゾル投与は、気管切開や穿刺を必要とせず、結果として得られる肺内の薬物分布は最適です。ただし、エアロゾル化された粒子は大きい(5〜40μm)ため、肺組織の胸膜下領域に到達できません。

この研究では、BLMの肺内投与は鼻噴霧によって行われます。噴霧中、マウスは自発的に呼吸し、薬物粒子を吸入した。エアロゾル化された粒子のサイズは2.5〜4μmであったため、肺全体に均一に分布するだけでなく、胸膜下領域にも到達することができました。低倍率では、特発性肺線維症 (IPF) 患者の最も重要な肺組織病理学的特徴は、病変の重症度が異なること、一貫性のない分布、異なる相病変の交互の分布、および間質性炎症、線維性病変、およびハニカム肺の変化の存在です。これらの病理学的変化は、主に気管支周囲の末梢胸膜下実質または小葉中隔に関与します。したがって、このアプローチによりBLM粒子が肺の胸膜下領域に到達できることを考えると、このモデルはヒトの疾患の臨床的特徴を厳密にシミュレートします。

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プロトコル

中日友好病院(中国・北京)動物研究委員会は、本研究の一環として実施されたマウスを用いたすべての処置を承認しました(NO.190108)。マウスは、室温20〜25°C、相対湿度40〜70%、動物の光強度15〜20LX、明暗を交互に12時間/12時間、中日友好臨床医学研究所の無菌動物室に保管しました。動物は食べ物と水を自由に利用できました。

1.マウス

  1. 噴霧する前に、すべての動物が7日間住宅施設に順応していることを確認してください。
  2. 噴霧には、8〜10週齢の雄のC57BL/6マウスを使用します。

2.鼻ブレオマイシン噴霧

  1. ブレオマイシン製剤
    注意:BLMは化学毒であり、腫瘍を殺しますが、正常な細胞や正常な組織にも損傷を与える可能性があります。
    1. BLM溶液はクリーンベンチで調製します。
      1. 使用濃度(7 U/mL)を得るには、15 Uの塩酸BLMを2.14 mLの生理食塩水に再懸濁します。再懸濁したBLMを完全に溶解するまで慎重に混合します。
    2. 作業溶液は4°Cまたは氷上で保存し、1日以内に使用してください。噴霧する前に、BLM溶液を室温に戻します。
  2. 麻酔
    1. 0.1 gのペントバルビタールナトリウムを10 mLの生理食塩水に溶解して麻酔を準備します。.作業用麻酔液は4°Cの暗い場所に保管し、3日以内に使用してください。
    2. ペントバルビタールナトリウムを腹部に注射し、26 Gの針が付いた1 mLの注射器を使用して、最終用量を75 mg / kg体重でマウスに麻酔します。.
      注:この研究では、マウスは少なくとも30分間この用量に反応しませんでした。必要に応じて、マウスの反応に応じて獣医師と相談して用量を調整します。.
    3. 数分後、麻酔をかけたマウスのつま先を人差し指と親指で押して、四肢の離脱反射が消えたことを確認します。
  3. 噴霧システムの準備
    1. 装置を較正した後、麻酔をかけたマウスを柔らかいメッシュカバーで固定し(図1A)、ピペットで露光塔の上部噴霧ヘッドに作業用BLM溶液を追加し(図1B)、ネブライザーを30分間実行して安定した噴霧を実現します。
      注: ワークフローを 図 1C、D に示します。ソフトウェアの詳細な操作手順については、手順2.3.1.1-2.3.1.9を示す 補足図S1 および 補足図S2を参照してください。
      1. flexiWare 8のアイコンをダブルクリック(補足図S1A)、「実験セッション」(補足図S1B)をクリックし、「新規研究」ボタン(補足図S1C)をクリックします。
      2. 実験名(補足図S1D)を編集し、タイトルと所有者(補足図S1E)を編集します。
      3. IX-4DIOテンプレート(補足図S1F)を選択し、オペレーター(補足図S1G)を入力し、[確認]ボタン(補足図S1H)をクリックします。[次へ]ボタン(補足図S1I)。
      4. ポンプを選択し、次へをクリックします(補足図S1J)|次へボタン(補足図S2A) |[次へ] ボタン (補足図 S2B) |フィニッシュボタン(補足図S2C)。
      5. Continuous-1Lmin(3つのドット、補足図S2D)の設定をクリックします|DIO1、[デューティ サイクル (%)] を 25% に設定し、[OK] をクリックします (補足図 S2E)。
      6. [DIO2] をクリックし、[Duty Cycle (%)] を 25% に設定して、[OK] をクリックします (補足図 S2F)。
      7. [DIO3]をクリックし、[デューティサイクル(%)]を25%に設定して、[OK]をクリックします(補足図S2G)。
      8. 「DIO4」をクリックし、「デューティ・サイクル (%)」を 25% に設定して、「OK」をクリックします (補足図 S2H)。
      9. 上部の緑色のボタン(左)をクリックして操作を開始し、赤いボタン(右)をクリックして作業を停止します。右上隅のxをクリックして終了します(補足図S2I)。
    2. BLMグループでは、一度に12匹のマウスを合計4回、合計48匹まで原子化します。通常の対照群で一度に6匹のマウスを通常の生理食塩水で噴霧します。
  4. 動物の回復
    1. ネブライザーで30分間処理した後、マウスを加熱パッドを備えた回復ケージに移動します。
    2. マウスが完全に意識を持つまで観察します。
    3. マウスの状態が良好であること、つまり自由に動けるようになったことを確認したら、マウスを元のケージに戻します。完全に回復するまで、他の動物と一緒に置かないでください。
    4. BLMによる治療後24時間の間に、呼吸数、生存率、症状などの生理学的指標を2回確認します。.

3. 肺組織処理

  1. BLM投与の9日後、16日後、および23日後に、6匹のマウスにペントバルビタールナトリウムを腹部に注射して犠牲にします(最終用量100 mg / kg体重)。
  2. 気管と肺を取り外し、すぐに冷たいリン酸緩衝生理食塩水ですすいでください。
  3. パラフィン包埋前に左肺を10%中性ホルマリン緩衝液に24時間固定します。
  4. ヘマトキシリン-エオシン染色(H&E染色)
    1. 固定された肺組織を脱水機で脱水します。
    2. 脱水した肺組織ブロックをワックス溶解ボックスに56°Cで1時間置きます。
    3. 埋め込むには、溶かしたパラフィンをモールドボックスに注ぎ、パラフィンを含浸させたティッシュブロックをモールドボックスの底にすばやく置き、冷まして固めます。
    4. 埋め込まれたワックスブロックをミクロトームに固定し、スライステーブルを適切な位置に上下に調整し、ブレードを押してスケールを調整し、厚さ4μmのスライスをカットします。ピンセットを使用して、水で満たされたディスプレイボックスにスライスを置き、(前面を上にして)カールを解除します。
    5. スライスをパッチして焼きます。ワックススライスが完全にほどけたら、スライドガラスをワックススライスに対して135°の角度で置き、ピンセットを使用してワックススライスをスライドガラスに移動し、スライドガラスを持ち上げ、必要に応じてワックススライスの位置を調整します。ワックススライスを取り付けたスライドを47°Cの恒温テーブルに1分間置き、スライスを再びほどくまで待ちます。スライスが完全に平らになったら、スライドを62°Cのインキュベーターに1時間置きます。
    6. 脱ろうの場合は、焼きたてのスライドをキシレンに20分間2回入れます。
    7. 水分補給のために、スライドを段階的なアルコールシリーズに入れて肺組織スライスを再水分補給します:100%アルコール2分間、95%アルコール1分間、90%アルコール1分間、85%アルコール1分間、75%アルコール1分間、蒸留水3分間。
    8. 切片をヘマトキシリンで5分間染色します。1分間2回洗浄した後、0.5%塩酸アルコール分化溶液に5秒間入れ、1分間水で2回洗浄し、青色染色液に8〜10秒間入れ、水道水で2回すすぎ、エオシンで30秒間染色します。
    9. 脱水および脱染のために、染色した切片をアルコール75%に1分間、85%アルコールに1分間、90%アルコールに1分間、95%アルコールに1分間、100%アルコールに1分間、キシレンに1分間2回入れ、残りの液体をすべて吸収紙で除去します。
    10. 取り付けには、スライスの中央に中性ガムシール液を一滴垂らし、カバースリップを取り付けます。
  5. マウス肺組織の形態学的等級付け基準
    1. Ashcroftらによって記述された方法を使用して、実験グループを盲検化された研究者に、各サンプルから3つの微視的フィールドをランダムに選択し、100倍の倍率で肺線維症の程度を観察してもらいます。グレード1、わずかに腫れた肺胞、限局性軽度の線維症;グレード2、顕著な線維症(肺胞壁の厚さが正常な3倍を超える)、線維性病巣を伴う。グレード3、線維症の連続領域(肺胞壁の厚さが通常の3倍)。グレード4、線維性病巣の融合、線維性領域が肺組織の10%未満を占める。グレード5では、線維性病巣が融合し、線維化領域は10%から50%であり、肺胞構造は著しく損傷しています。グレード6、大きな連続線維性病巣(肺組織の50%以上)。グレード7、肺胞腔は線維性組織で満たされており、肺水疱が存在します。グレード8、完全な線維症。
    2. 各視野にグレードに対応するスコアを割り当て(たとえば、グレード4は4ポイントに相当します)、6つのサンプルの各グループに個別にスコアを付けます。

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結果

肺損傷は噴霧BLMによって誘発され、対照動物は同量の生理食塩水で噴霧されました。マウスを1日1回、1日30分間、BLM濃度7 U/mLを用いて噴霧した。マウスは、BLM投与後9日目、16日目、および23日目にH&E染色のために犠牲にしました(図2B)。正常な肺胞構造の喪失、中隔肥厚、肺胞の肥大、炎症細胞の間質および気管支周囲領域への浸潤の増加を伴うびまん性肺病変が、対照群のマウスと比較してBLMを受けたマウスの肺で観察されました。各肺組織切片における線維性変化の重症度は、観察された顕微鏡野の平均重症度スコア(アシュクロフトスコア)として評価されました。BLM-D9、BLM-D16、およびBLM-D23マウスのアシュクロフトスコアは、対照群のマウスのスコアよりも高かった(図2C)。

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ディスカッション

ブレオマイシンの気管内注射は、両方の肺に急性炎症反応と線維化反応をもたらし、ヒト間質性肺疾患の実験的マウスモデルを確立するための効果的なアプローチと見なすことができます。気管内投与は、最も一般的に使用される投与経路です2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。<...

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開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会(No.92068108)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
 ブレオマイシンバイオウェイ/日本化薬株式会社 DP721線維症モデル医薬品
0.9%生理食塩水注射用Baxter Healthcare(Tianjin)Co.,Ltd.ブレオマイシン製剤
1 mL シリンジBD300481麻酔動物
10% 中性ホルマリン緩衝液TechaLab Biotech Company肺組織を固定
15 mL 遠心分離管コーニング430790麻酔の準備
20 & °C;C冷蔵庫ニューフライグループBCD-213Kストアドラッグ
4 °C冷蔵庫ニューフライグループBCD-213Kストアドラッグ
アドビイラストレーター cc2020アドビプロセス画像
ブルーバックリキッド北京化学工場組織染色
クリーンベンチ蘇州蘇傑 浄化機器有限公司ブレオマイシン製剤
分化液北京化学工場組織染色
電子天秤メトラー・トレドAA-160麻酔の準備
エオシン染色北京伊利ファインケミカルズ株式会社ティッシュ染色
加熱パッドHIDOMマウス インキュベーション
ヘマトキシリン染色北京伊利ファインケミカルズ株式会社組織染色、
リン酸塩緩衝液(PBS)、生理食塩水(PBS)緩衝液HycloneSH30256.01クリーン、肺、
組織、Photoshop、描画ソフト、AdobeProcess、画像
、SCIREQ、INEXPOSEEMKA、Biotech Beijing Co.,Ltd.微粒化装置
正立型蛍光顕微鏡オリンパスBX53スライスを観察
、、

参考文献

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