腫瘍スフェロイドの半ハイスループット分析のための迅速な光学的クリアリング

スフェロイドなどの三次元(3D)細胞培養物は、凝集細胞増殖の生物学的に現実的で再現可能なモデルを提供する^1,2。これらのモデルは、基礎研究と医薬品開発の両方で急速に一般的になりつつあり、スフェロイドのサイズと構造の違いが治療間で検査され、薬効を確認する^3,4。これらの文脈において、多数のスフェロイドから詳細な情報を収集する能力は、統計的検出力の観点から、およびいくつかの治療にわたる細胞挙動の迅速な評価を可能にすることの両方から、非常に有利である。

スフェロイド構造の詳細な顕微鏡画像を得るために一般的に使用される技術は、時間がかかるか、高価であるか、またはスフェロイドサイズ^4,5などの主要な定量的特徴を保持しない低品質の画像を生成する。例えば、凍結切断に基づく組織学的技術は、高品質の画像を提供することができるが、しばしば時間がかかり、熟練した労働力を必要とし、しばしば切片化アーティファクト^6,7を作成するが、単一平面照明顕微鏡(SPIM)⁸および多光子顕微鏡⁹などのエレガントな技術は、容易に入手できない特殊な顕微鏡を必要とする。現代の顕微鏡技術は最近、回転楕円体が屈折率一致したクリアリング溶液内に配置され、共焦点顕微鏡^4,5を使用して画像が得られる、いわゆる光学的切断を可能にした。これらの技術は高い歩留まりを生み出す可能性を秘めていますが、一般的な問題には、イメージング中の回転楕円体の動き、クリア中のサイズの歪み、独自のクリアリングソリューションの高コストなどがあります。さらに、多くの既存のプロトコルは、直径300μm未満または深さ100μmまでの比較的小さなスフェロイドにのみ適用され、この技術を腫瘍増殖の初期段階に限定している⁵、^10、11。

本プロトコルは、全臓器透明化手順に由来する低コストの屈折率整合クリアリング溶液を用いて、詳細な回転楕円体画像のセミハイスループット、高収率収集を可能にする^12、13。イメージング中のスフェロイドの動きを防ぎ、サイズの歪みを低減する構造的サポートを提供するために、スフェロイドは24ウェル#1.5ガラス底板のアガロース-PBSゲルに取り付けられています。この技術により、24ウェルプレートの各ウェルに複数のスフェロイドをマウントできるため、さまざまな実験条件で最大360個のスフェロイド(15個のスフェロイド/ウェル)を迅速にマウントしてイメージングできます。容易に入手可能な消耗品から構築された屈折インデックスマッチングクリアリングソリューションは、取り付けられたスフェロイドと周囲のゲルを光学的にクリアするために使用されます。24時間のセトリング期間の後、このプロトコルは、2%未満のサイズ歪みで、比較的大きなスフェロイド(直径約700μm)であっても、回転楕円体構造の高品質の2Dおよび3D画像を提供します。

このプロトコールは、1つの24ウェルプレート(約240〜360個のスフェロイドまたは10〜15個のスフェロイド/ウェル)を、ウェルあたり200μLのアガロースゲルおよびウェルあたり500μLの透明化溶液でマウントするのに十分な量の腫瘍スフェロイドの調製を記載している。完全な手順を 図 1 に示します。

1. 2%アガロース-PBSゲル調製

1. ガラス瓶に0.5gの低融点アガロース( 材料表を参照)を計量し、25mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加える。
2. アガロースを溶かし、溶液を電子レンジで30〜60秒間沸騰させ、蓋は閉じたが密閉せず、一定の渦巻きを伴わない。アガロースが完全に溶解し、溶液が沸騰しないことを確認します。
   注:ゲルは室温で保存することができます。蒸発を説明するために使用前に容量を確認してください。液体の状態(マイクロ波、渦巻き状態で20-60秒)にしてから使用してください。

2. 清澄化液の調製

1. N,N,N',N'-テトラキス(2-ヒドロキシプロピル)エチレンジアミン9g、尿素22g、スクロース44g、トリトンX-1000000000g、脱イオン水24.9gを計量する(材料表参照)。
   注:N,N,N',N'-テトラキス(2-ヒドロキシプロピル)エチレンジアミンのおおよその量を計量し、所望の濃度を得るために他の成分の重量を調整する方が簡単です。
2. 溶液を56°Cの水浴中で一定の混合で加熱し、すべての結晶が溶解するまで続けます。
3. 混合中に形成された気泡が表面に上昇することができるように、溶液を室温で休ませる。この溶液は、室温で最大2ヶ月間安定である。

3. 回転楕円体調製

1. 前述のようにアガロースオーバーレイ法を用いてスフェロイドを生成する ^1,3,14.
   注: 他の方法で生成された回転楕円体も、このイメージング プロトコルと互換性があります。
2. メスを使用して1mLのピペットチップの先端を切断し、オリフィスを拡大します。
   注:すべてのスフェロイドは、カットチップを備えた1 mLまたは200 μLのピペットで処理しました。
3. ピペットを使用して、ウェルから回転楕円体を吸引し、透明な1.5mL円錐管に移す。同じ条件の複数の回転楕円体を同じチューブ内で組み合わせることができます。
   注:常に回転楕円体がチューブの底に沈み込み、媒体を吸引するようにしてください。
4. スフェロイドを1mL PBSで2回洗浄し、中性4%予熱パラホルムアルデヒド(PFA)溶液を加え、スフェロイドを37°Cで20分間インキュベートする。
5. PFA溶液を除去し、1mLのPBSでスフェロイドを2回洗浄する。

4. 回転楕円体染色

1. ピペットを使用して、最大 15 個のスフェロイドを 200 μL PCR チューブに移します。
   注: 壊れやすいスフェロイドの場合は、先に進む前にスフェロイドをゲルにマウントしてください (手順 5.1 ~ 5.4)。
2. PBS中の0.5%Triton X-100の200μLを用いて細胞を透過除去する。PCR チューブを 50 mL スクリューキャップチューブ内に置き、スフェロイドを室温で軽度の攪拌で 2 時間インキュベートします。
   注:特に指定のない限り、すべてのインキュベーションは、ローター、ローラー、またはシェーカー( 材料表を参照)での攪拌で行われます。これは、均一な染色を達成するために重要である。PBS内の固定スフェロイドは、ピペットチップの側面にくっつくことがあります。先端を0.5%Triton X-100ですすぐと、回転楕円体が先端に付着するのを最小限に抑えます。
3. 溶液(ステップ4.2)を200μLの抗体希釈バッファー(ABDIL)¹⁵ に交換し、室温で一晩インキュベートします。
4. ABDILを除去し、ABDILに75 μLの一次抗体を加え、4°Cで2.5日間インキュベートした。
5. 上清を除去し、0.1% Tween および 0.1% Triton X-100 (PBS-TT) を含む 200 μL の PBS で 2 回洗浄し、200 μL の PBS-TT と共に室温で 4 時間インキュベートします。
6. PBS-TTを除去し、ABDILに100 μLの二次抗体を加え、4°Cで2.5日間インキュベートした。
   注:DAPIまたは他の核色素は、この段階で添加することができる。ほとんどの色素は、抗体よりもインキュベーション時間が少なくて済みます。
7. 上清を除去し、200 μL の PBS-TT で 2 回洗浄し、200 μL の PBS-TT で 4 時間インキュベートします。回転楕円体は取り付けの準備ができています。

5. 取り付け

1. 200 μL のピペットを使用して、固定および染色したスフェロイドを、条件ごとに 1 本のチューブ (約 10 ~ 15 個のスフェロイド) で 500 μL PCR チューブに移します。
2. 溶液を200 μLの2%(w/v)液体アガロースゲルと交換し、室温で30秒間、クイックスピン(固定された最高速度で、 材料表を参照)で遠心分離します。
   メモ: すぐに取り付ける場合を除き、ゲル硬化を避けるために 50 °C の加熱ブロックに入れてください。
3. スフェロイドを約50 μLの液体アガロースゲルで吸引し、24ウェルガラス底プレートのウェルに分注します。
4. ゲルが固まる前に、周囲のゲルのピペットチップを使用してスフェロイドを分離し、スフェロイドがゲルで覆われていることを確認します。任意選択で、プレートを氷の上に置き、ゲルを急速にセットする。
   注: ウェルあたりの回転楕円体の数は、回転楕円体のサイズによって異なります。回転楕円体は互いに遠くに配置され、イメージング中に1つの回転楕円体のみが視野に入るようにします。これは、自動画像処理にとって重要です。
5. 1ウェルあたり500μLの清澄溶液(ステップ2)を加え、ゲルが水没していることを確認する。RTで少なくとも24時間インキュベートし、クリアリング溶液中の回転楕円体をイメージングします。スフェロイドは、室温で最大1ヶ月間、蒸発から保護されている場合、この溶液中で安定である。

6. イメージング

1. 容器内の回転楕円体の取り付け高さを含む、回転楕円体全体を包括するのに十分な長さの作動距離を持つ対物レンズを選択します。
   注: 回転楕円体の赤道面をイメージするには、作動距離が 3 mm 以上の対物レンズが必要です。NAが高く、倍率の高い対物レンズは、より良い解像度を可能にすることができるが、回転楕円体を画像化できる最大深さを制限する。
2. 赤道面を識別するには、XY平面で最大の表面積に達するまで焦点を調整し、必要なレーザー出力の割合、検出器電圧、ゲイン、オフセット設定で画像を作成します。
   メモ:レーザー出力の割合、検出器の電圧、ゲイン、オフセットは、蛍光色素分子、染色強度、レーザー強度、検出器の感度などによって大きく異なります。
3. 3D 画像の場合は、回転楕円体の開始と終了を設定し、イメージング前に z 強度補正設定を使用して、さまざまな Z 深度で適切な信号強度を選択します。
   メモ: 最適な画像解像度を得るには、x、y、z にナイキストサンプリングレートを使用します(詳細については、リファレンス¹⁶ を参照してください)。

高品質の2次元および3次元画像を提供するこのクリアリング方法の能力を実証するために、直径300〜600μmのスフェロイドを、FルアセントUバイキチン化ベースのCell CycleIndicator(FUCCI)形質導入メラノーマ細胞株FUCCI-WM164およびFUCCI-WM983b 9,17から増殖させた。これは、それぞれステップ3 1、3、14で提供される手順に従って、細胞周期のGap1、および初期のS期/Gap2/有糸分裂期にあるときに単量体の草原オレンジ2(mKO2)および単量体アザミグリーン(mAG)タンパク質を発現する。次いで、スフェロイドを37°Cで4%ホルムアルデヒド溶液で固定し、透過処理し、抗p27kip1/抗ウサギAlexa Fluor 647抗ピモニダゾール/抗マウスAlexa Fluor 647、DAPI、またはDRAQ7(材料表を参照)で染色した(図2)。すべての顕微鏡ファイルは、GitHub リポジトリ (https://github.com/ap-browning/SpheroidMounting) にアップロードされます。PBSマウントのスフェロイドと比較して、クリアソリューションは、最小限のサイズの歪みで高明瞭な画像を提供します(図2A)。このプロトコルは、組織学的切片化なしで回転楕円体の奥深くまで細胞レベルの細部を高解像度でイメージングすることを可能にし、断面画像は、ステッチングなしで4096 x 4096ピクセルの解像度で20倍の空気対物レンズ(0.7 NA)から得られた(図2B)。より低い倍率とより低い開口数対物レンズとより長い作動距離を使用して、少なくとも200μmの深さで細胞レベルの詳細を提供する3D共焦点画像を得ることができる(図2C)。スフェロイドはまた、Spoerri et al.4によるプロトコルに従って凍結切片および染色し、全スフェロイド染色と比較した(図2D、E)。図2Dは、ピモニダゾールによって染色されたスフェロイドの低酸素領域を示し、図2Eは、細胞周期停止(黄色)およびDAPI核染色(灰色)をマークするp27kip1染色を示す。タンパク質の局在化および染色パターンは、凍結切断と清澄化の間で類似しているため、この清澄化方法の影響を受けません。

zの信号強度補正は、回転楕円体全体のイメージングを可能にする。しかし、壊死コアによる光散乱は、回転楕円体の反対側を画像化する能力を制限する。DRAQ7核染色などの遠赤色蛍光色素分子のより深い浸透と散乱の少ないため、3Dスフェロイド構造表現をさらに改善できます(図3)。 ムービー 1 は、DRAQ7 で染色された FUCCI 回転楕円体の 3D レンダリングを示しています。zスライスを薄くすると、Z解像度が向上する可能性がありますが、これにより、蛍光色素分子のイメージング時間とフォトブリーチングが大幅に増加します。

クリアリング溶液がサイズの歪みを引き起こすかどうかを決定するために、2%アガロース-PBSゲル中の12個のスフェロイドを、クリアリング溶液の導入後6時間、12時間、24時間、72時間、および168時間で画像化した。画像は、回転楕円体と同じ断面積を有する球に基づいて定義される回転楕円体の直径を決定することによって要約された(図4A)。スフェロイドは最初の6時間でサイズがわずかに増加することが観察され、2%〜6%の直径フォールド変化によって示され(図4B)、24時間〜72時間後には、スフェロイドはPFA固定後のPBSにおける対応するサイズとほぼ等しいサイズに戻る(図4C)。

図1:回転楕円体の取り付けとクリアのプロトコルの図。 固定および染色されたスフェロイドを500μLチューブに移す。過剰の流体を200μLのアガロース-PBSゲルで置換し、遠心分離した。次いで、回転楕円体は、24ウェルプレート内のガラス底ウェルに移される。ゲルを固化させた後、500μLの透明化溶液を加え、スフェロイドを平衡化させる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:クリアされたFUCCIヒトメラノーマスフェロイドとクリアされていないFUCCIヒトメラノーマスフェロイドの比較。着色はmKO2に対して陽性の細胞核(赤色)を示し、これは間隙1の細胞を示す。(A)5000個のFUCCI-WM983b細胞から増殖したスフェロイドを、10日目に回収し、アガロース-PBSゲル中で画像化し、24時間後に透明化溶液を加えた後、間隙2の細胞を示す。クリアソリューションの前後に明視野画像と共焦点画像を比較すると、サイズの歪みが最小限に抑えられ、明瞭度が大幅に向上します。(B)FUCCI-WM164細胞から増殖させたスフェロイドをTriton X-100を用いて透過処理し、DRAQ7で染色し、すべての細胞核を染色した。画像は、20倍の対物レンズ(0.75 NA)を用いて得られ、クリア溶液を実証すると、細胞レベルの詳細の高解像度イメージングが可能になる。 (C)PBS中のFUCCI-WM164スフェロイドの3D画像(10x、0.4 NA)が得られ、クリア溶液が添加されてから24時間後。異なるz平面でレーザー出力、電圧、オフセットを調整することで、回転楕円体の奥深くまでイメージングできます。(D,E)ピモニダゾールおよびp27kip1について染色された凍結切片および透明化された全回転楕円体との比較。(d)マゼンタにおけるピモニダゾール染色は、スフェロイドにおける低酸素領域を示す。赤と緑はFUCCIを示します。(e)DAPI(灰色)およびp27kip1(黄色)を示す凍結切片および透明回転楕円体。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:クリアリングにより、最小限の光損失で回転楕円体の奥深くまでイメージングできます。FUCCIヒトメラノーマスフェロイドの共焦点顕微鏡画像は、倍率10倍、NA(0.4)を下げ、信号損失を最小限に抑えながら、より高いz深度でのイメージングを可能にします。 (A)DRAQ7で染色された3.88μmのスフェロイド核スライス。 (B-D)488(mAG)、568(mKO2)、および647nm(DRAQ7)チャンネルのY/z解像度。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:クリアリングソリューションは、回転楕円体サイズへの影響を最小限に抑えます。 (A)PBSゲル(n =12スフェロイド)における初期スフェロイドサイズ(等価直径)の分布、(B)クリアリング溶液を添加してからの直径折り畳み経時変化。0 時間で、回転楕円体は PBS ゲルのみに含まれています。(C) 直径の分布は、12 時間、24 時間、および 72 時間で変化 します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ムービー1:DRAQ7で染色されたFUCCI回転楕円体の3Dレンダリング。この映画をダウンロードするにはここをクリックしてください。

オリンパスは出版費用に貢献しました。