動的界面の共焦点顕微鏡可視化のためのマイクロテンシオメータ

Summary

本稿では、界面形態を可視化しながら界面張力と表面拡張レオロジーを同時に測定するためのマイクロテンシオメータ/共焦点顕微鏡の設計と操作について述べる。これにより、技術や生理学において重要な界面の構造と特性の関係をリアルタイムに構築することができます。

Abstract

界面活性分子の流体-流体界面への吸着は、本質的に遍在している。これらの界面を特徴付けるには、界面活性剤吸着速度を測定し、バルク界面活性剤濃度の関数として平衡表面張力を評価し、平衡化後の界面領域の変化と表面張力がどのように変化するかを関連付ける必要があります。高速共焦点顕微鏡による蛍光イメージングによる界面の同時可視化により、構造機能関係を直接評価することができます。キャピラリー圧力マイクロテンシオメータ(CPM)では、半球状の気泡がキャピラリーの端部に固定され、1mL容の液体リザーバに固定される。気泡界面を横切る毛細管圧力は、ラプラス方程式に基づくモデルベースの圧力、気泡曲率、または気泡面積制御を可能にする市販のマイクロ流体フローコントローラ を介して 制御される。Langmuirトラフやペンダントドロップなどの以前の技術と比較して、測定と制御の精度と応答時間が大幅に向上しています。毛細管圧力の変化は、ミリ秒単位で適用および制御できます。気泡界面の動的応答は、気泡が膨張および収縮するにつれて、第2の光学レンズ を介して 視覚化される。気泡の輪郭は円形プロファイルにフィットし、気泡の曲率半径 R と、結果を無効にする円形度からの偏差を決定します。ラプラス方程式は、界面の動的表面張力を決定するために使用されます。平衡化に続いて、コンピュータ制御のマイクロ流体ポンプによって小さな圧力振動を課して気泡半径(0.001〜100サイクル/分の周波数)を振動させて拡張弾性率を決定することができ、システムの全体的な寸法は、マイクロテンシオメータが高速共焦点顕微鏡のレンズの下に収まるほど十分に小さく、蛍光タグ付き化学種をサブミクロンの横方向分解能で定量的に追跡することができる。

Introduction

界面活性剤膜で覆われた空気と水の界面は、日常生活の中で遍在しています。界面活性剤 - 水注入は、枯渇した油田からの油回収を強化するために使用され、シェールガスおよび油の水圧破砕ソリューションとして使用されます。気液フォームおよび液液エマルジョンは、潤滑剤および洗浄剤として多くの工業的および科学的プロセスに共通しており、食品において一般的である。界面における界面活性剤およびタンパク質は、包装、保存、および投与中に抗体立体配座を安定化させ¹、²、³、⁴、⁵、眼における涙液膜安定性⁶、⁷、⁸、および肺力学⁹、^10、11、¹²、^13、

Protocol

1. キャピラリーチューブの作製

1. キャピラリーをキャピラリープーラーに入れ、目的の引っ張りプログラムを実行して、先端に外径(OD)が〜1μmのテーパーキャピラリーを2つ作ります。
   注: 引っ張る前のキャピラリーの OD は、マイクロテンシオメーターセルのキャピラリーホルダーに収まるように指定された OD である必要があります。キャピラリーの内径(ID)はさまざまですが、引っ張った後のキャピラリーの臨界半径に影響します。結果として生じるテーパが最初にキャピラリーODおよびIDを迅速に減少させ、次に所望のキャピラリーODおよびIDの近くの半径に達し、次いでよりゆっくりと直径を減少させるように、引っ張りプログラムが選択される。これにより、より大きなキャピラリー長が作成され、IDで30〜100μmの使用可能なキャピラリーが得られるようにスコアリングできます。
2. 毛細血管の先端を所望のスポットにスコア付けして、30〜100μmのIDを取得し、先端を切断する。これで、毛細血管の先端に所望の半径のODとIDが与えられます(図1A)。毛細血管はステップ2まで保存することができる。
   メモ:キャピラリーの切断エッジは、90°のクリーンブレイクでなければなりません。切断エッジに欠陥があると、キャピラリーへの気泡のピン留め不良や表面特性測定不良につながります。テーパー毛細血管の先端は非常に繊細です。溶液以外のもの....

Results

測定誤差の主な原因は、切断プロセス(図5A、B)またはコーティングプロセス(図5D)のいずれかに欠陥がある毛細血管から生じます。どちらのタイプの欠陥も、光学画像解析システムによる気泡の形状およびサイズを決定する際にエラーをもたらし、不正確な表面張力値につながる。新しいキャピラリーを引っ張ってコーティングした後、CPMにキャピラリーを挿入する前に、光学顕微鏡下でコーティングした後、各新しいキャピラリーを慎重に検査することが重要です。ミスカットされたキャピラリーは廃棄する必要がありますが、コーティングが不十分なキャピラリーは酸洗浄して再コーティングして、キャピラリーの端部での気泡のピン留めを改善することができます(プロトコルのステップ2)。キャピラリーは、エンドカットがキャピラリーに対して完全に垂直であり(図5C)、バブルピンがキャピラリーの端部に直接ある場合(図5E)に.......

Discussion

結合されたCPM/CFMは、界面ダイナミクス、平衡、および形態を調べるための強力なツールです。このプロトコルでは、CPM/CFM を使用してデータを取得するために必要な手順について説明します。

図2 は、キャピラリー、溶媒、および熱交換用のチャネルが示されているセル設計を示しています。溶媒交換の入口はセルの下部にあり、出口は上部になければならず、交換中にセルがオーバーフローしないようにする必要があります。実際には、入口と出口の流量は、同じ蠕動ポンプに対してわずかに異なる場合があります。このセル設計の一般的な問題の 1 つは、セルからの漏れです。これは、ほとんどの場合、セルと接続の1つとの間の接続不良によって引き起こされますが、すべての接続が乾燥していて漏れていない場合、これはセルを囲むボルトの締め過ぎによるセルのスライドガラスの亀裂が原因である可能性があります。

図3 は、さまざまなポンプとセル間の接続、およ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 O.D. タイゴン チューブ	フィッシャー サイエンティフィ		チューブ
A1RHD 多光子直立共焦点顕微鏡	ニコン		共焦点顕微鏡
酸洗浄液			硫酸と Alnochromix 水で 50% 体積で希釈し、
Alnochromix	Alconox	2510	を希釈するまで待ちますパッケージの説明書に硫酸と混合し、希釈して酸洗浄液を作る
セラミックガラスカッター	Sutter Instruments
Chloroform	Sigma-Aldrich	650471	HPLC Plus
Curosurf	Chiesi		肺界面活性剤
Di			18.5 MΩ - cm
エタノール	任意の		200プルーフは疎水性化に使用され、変性は
Fiber-Liteモデル190光ファイバーイルミネ	Industries Inc.の	281900100	光源; 他の光源も同様に機能する必要があります
Flow EZ F69 mbar w/Link Module	Fluigent	LU-FEZ-0069	マイクロ流体ポンプ
Fluigent SDK VIs	Fluigent		CPM仮想インターフェースに必要な
1mmのVitonシートから機械加工された	フルオロエラストマーガスケット
ガスフィルター	Norgren	F07-100-A3TG	マイクロ流体ポンプと圧力調整器の間に置く
ガス調整器 ノル	グレン	10R0400R	からポンプの範囲に圧力を下げ、ガスフィルター範囲に接続 2-120 psi
ガラス キャピラリー	サッター機器	B150-86-10	ホウケイ酸ガラス O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm
ガラス スライド	任意の		75 mm x 25 mm
ガラス シリンジ	ハミルトン	84878	25 μLガラスシリンジ
疎水性化剤	Sigma-Aldrich	667420	1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチルトリエトキシシラン98%、他の疎水性トリエトキシシランは代用できます
不溶性界面活性剤	Avanti	850355C-200mg	16:0 DPPC in chloroformLabVIEW
ソフトウェア	National Instruments		2017
Longpass Filter	ThorLabs	FEL0650	650 nmロングパスフィルター、波長は励起レーザーの頻度を除去する必要があります
Lyso-PC	Avanti	855675P	16:0 Lyso PC 1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン
Masterflex L / S可変速アナログコンソルポンプシステムw/ Easy-Load II ポンプヘッド	Masterflex	HV-77916-20	蠕動ポンプ
MATLAB	Mathworks		R2019
マイクロピペットプーラー P-1000	サッター機器		キャピラリープーラー
マイクロテンシオメーター セルとホルダー			セルはPEEKから機械加工され、ホルダーはアルミニウムから機械加工されています、図3および4を参照してください
マイクロテンシオメーター 対物	レンズ ニコン		Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm
NI ビジョン開発モジュール	National Instruments		CPMバーチャルインターフェースに必要
PEEKフィンガータイトフィッティング	IDEX	F-120x	10-32 コーンポート
PEEKプラグ	IDEX	P-551	10-31 コーンポート
ピペットチップ	Eppendorf	22492225	100 μL - 1000 μL、オートクレーブプラスチック
鉗子	Thermo Scientific	6320-0010
プラスチックシリンジ	Fischer Scientific	14-955-459	10 mL
配管部品	フィッシャーサイエンティフィ		3 ウェイバルブとチューブを接続するためのその他の配管部品。
Research Plus 1チャンネル 100 μL–1000 μL	エッペンドルフ	3123000063	マイクロピペッター
硫酸	酸 任意の		酸洗浄液に使用
T プラン SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm	ニコン		共焦点顕微鏡 対物レンズ
テキサスレッド DHPE トリエチルアンモニム塩	サーモフィッシャーサイエンティフィ	1395MP	フルオロフォア
真空ポンプ	ガスト	DOA-P704-AA