バイポーラ電極を用いて扁桃体の電気キンドリングによる側頭葉てんかんマウスモデルの作成

Summary

扁桃体は、この構造に由来し、この構造から伝播する側頭葉てんかんにおいて重要な役割を果たします。本稿では、記録機能と刺激機能の両方を備えた脳深部電極の作製について詳しく説明します。扁桃体に由来する内側側頭葉てんかんのモデルを紹介します。

Abstract

扁桃体は発作の最も一般的な起源の1つであり、扁桃体マウスモデルはてんかんのイラストに不可欠です。しかし、実験プロトコルを詳細に説明している研究はほとんどありません。この論文は、バイポーラ電極作製の方法を導入して、扁桃体電気キンドリングてんかんモデル作成の全プロセスを示しています。この電極は刺激と記録の両方を行うことができ、刺激と記録のために別々の電極を埋め込むことによって引き起こされる脳損傷を軽減します。長期脳波(EEG)記録の目的で、スリップリングを使用して、ケーブルのもつれや脱落によって引き起こされる記録の中断を排除しました。

基底外側扁桃体(AP:1.67 mm、L:2.7 mm、V:4.9 mm)を19.83回±5.742回周期的に刺激(60 Hz、15分ごとに1秒)した後、6匹のマウスで完全なキンドリングが観察されました(ラシーンのスケールで分類された3つの連続したグレードVエピソードの誘発として定義されます)。キンドリングプロセス全体を通して頭蓋内脳波が記録され、キンドリング後に20〜70秒続く扁桃体のてんかん分泌が観察されました。したがって、これは扁桃体に由来するてんかんをモデル化するための堅牢なプロトコルであり、側頭葉てんかんにおける扁桃体の役割を明らかにするのに適しています。本研究は、近心側頭葉てんかんのメカニズムや新規抗てんかん原薬の今後の研究に貢献します。

Introduction

側頭葉てんかん(TLE)は最も一般的なタイプのてんかんであり、薬剤耐性てんかんへの転換のリスクが高い。選択的扁桃体海馬切除術などの手術はTLEの有効な治療法であり、この病気のてんかん発生とイクトジェネシスはまだ調査中です^1,2。TLEの病因は、海馬だけでなく、扁桃体でも広範囲に発生することが示されています^3,4。例えば、扁桃体硬化症と扁桃体肥大の両方がTLE発作の起源として頻繁に報告されています^5,6。扁桃体の重要性を過小評価することはできません。てんかん形成の研究には扁桃体モデルが不可欠であり、このモデルの明確な図解が緊急に必要とされています。

動物モデルにおいて発作を誘発するためのいくつかのアプローチが提案されている。過去には、けいれん薬は早期に腹腔内注射されていました⁷。この方法は便利であったが、てんかん病巣の位置は不確かであった。定位技術と詳細な動物の脳アトラスの開発により、頭蓋内薬物注射が適用され、局在化の問題が解決されました⁸。しかし、急性期の重度の発作に対する介入の欠如は高い死亡率をもたらし、慢性自然発作は不安定な発作間発作および発作頻度の問題を伴いました^9,10。最後に、電気キンドリング法が開発されました。この方法は、特定の脳領域を定期的に数回刺激し、場所と発症時間の両方を明確に制御して発作を誘発することを可能にする¹¹。

この方法の利点は、電極の頭蓋内移植が低侵襲であることである¹²。さらに、発作の重症度は刺激の終了によって制御可能であり、発作によって引き起こされる死亡率を減少させる。これらの変更により、以前のアプローチの欠点が解決されました。特に、このモデルはヒトの発作を適切に模倣することができ、SEを迅速に誘導する能力があるため、てんかん重積状態(SE)の研究に特に適しています¹³。また、抗てんかん薬のスクリーニング¹⁴ やてんかんのメカニズムに関する研究にも使用できます。最後に、扁桃体が記憶調節、報酬処理、および感情と密接に関連していることはよく知られています¹⁵。これらの精神機能の障害はてんかん患者でしばしば遭遇するため、扁桃体てんかんモデルはてんかんの感情的な問題を研究するためのより良い選択かもしれません¹⁶。

Protocol

この実験は、首都医科大学玄武病院の実験動物倫理委員会によって承認されました。全てのマウスは首都医科大学玄武病院の動物実験室で飼育された。このプロトコルは4つの部分に分かれています。最初の2つのパートでは、スリップリングを使用して電極と脳波記録/刺激装置を接続する電極と電気回路を構築する方法を紹介します。第3部では電極埋入の操作方法について説明し、第4部では扁桃体てんかんモデルに使用される脳波記録および刺激パラメータを示します。

1. 電極の作製

1. テフロンコーティングされたタングステン線(裸径:76.2μm)の長さ3cm2本、同じ長さの銀線(裸径:127μm)1本、および2 x 2ゲージの列ピン1セットを事前に準備した材料を用意してください。
2. ライターを使用して各タングステンワイヤーの一端を燃やし、5mmの絶縁コーティングを取り除きます。
   注意: 絶縁体を取り除いたタングステン線は黒くなります。タングステン線のこの部分は上端と呼ばれます。
3. 極細マルチストランドワイヤーの一部をはがし、暗くなり始める下端から上端まで巻き、上まで続けます。この極細線(柔らかな質感)とタングステン線を合わせ、一方の端をつまんでもう一方の端をやさしく撚ることで、2つの材料を簡単に絡み合わせることができます。
4. そっと引っ張ってしっかりと包まれ、余分な極細線を切り取ります。プロセス全体を通してタングステン線をまっすぐに保つようにしてください。
5. 列ピンをクランプに固定しますamp ピンの長辺を外側に向けて溶接テーブル。シリンジ針を使用してはんだペーストを拾い上げ、ピンに塗布します。溶接トーチを320°Cに加熱します。トーチチップで鉛フリーのブリキ線を溶かして塗ります。
6. タングステン線の上端を列ピンの1本の針で重ね、トーチのはんだを使用してタングステン線をピンに接着します。
   注:極細線の助けを借りずにタングステン線をピンで直接溶接することは非常に困難です。
7. 別のタングステン線と別の銀線を同じ方法で行ピンに溶接して、各ワイヤーが針に対応するようにします( 図1、iを参照)。
8. タングステン線の上端より少し長い2本の熱収縮チューブを切断します。それらを2本のタングステンワイヤのはんだ接合部に置き、2本のタングステンワイヤの回路が直列に配置されないように、導電性部分がチューブで完全に覆われていることを確認します。
   注意: 3本のワイヤーがありますが、そのうちの2本が絶縁されている場合、3本のワイヤーは直列になりません。銀線にチューブを追加することもできます。
9. 溶接テーブルクランプから電極を取り外し、収縮チューブを加熱すると電極の形状が崩れやすいため、電極を大きなペンチでそっと保持し、わずかに力の強い優れた熱伝導率クランプを使用します。
10. エアダクトをオンにし、320°Cの温度に達するまで加熱します。熱収縮チューブを締めるまで数秒間吹きます( 図1、iiを参照)。
11. 溶接プロセス中に針がプラスチック本体から分離する場合は、溶接部品とプラスチック本体をホットメルト接着剤で接合します( 図1、iiiを参照)。インターフェイスの挿入に影響するため、インターフェイスに塗りつけないように注意してください。
12. 2本のタングステン線を持ち、両端を離して撚り合わせます( 図1、ivを参照)。両端の間隔が0.5 mmを超えないように、撚り合わせたタングステン線を長さ約10 mmにトリミングします。
    注:このステップは、電極の長さを柔軟に調整できるように、電極移植の前に実行することもできます。
13. グルーガンを加熱し、電極の周りに接着剤を均等に塗布します。
14. マルチメーターで電極を確認します:マルチメーターの1本のバーを列ピンの溶接されていない側に置き、タングステン線または銀線の端をもう一方のバーにそっと触れて、回路が滑らかかどうかを確認します。線が直列に配置されていないことを確認します。

2.スリップリング接続と回路の説明

注意: マウスの電極が自由に動く状態でケーブル を介して EEGデバイスに接続されている場合、マウスが動いて向きを変えるときにケーブルが絡まる可能性があります。これにより、ケーブルが短くなり、最終的にマウスの動きを妨げたり、ケーブルが頭から落ちたりします。ここで説明する方法では、ケーブルの脱落を防ぐために4チャンネルのスリップリングが導入されています。 図 1B では、4 つのチャネルが 4 色で表されています。

1. 両端の絶縁スキンを5mm剥がし、内部の金属線を露出させます。
2. 各固定子ワイヤに熱収縮チューブのセクションを追加します。
3. 各ワイヤをEEGデバイスコネクタプラグで溶接します。
4. 熱風で熱収縮チューブを収縮させます。
5. 各ローターワイヤーに熱収縮チューブのセクションを追加します。
6. 赤とオレンジのワイヤーの導電性部分をねじ込み、ヘッダーのジョイントに溶接して列ピンに合わせます。
7. ヘッダーの他の2本のワイヤを各ジョイントに溶接します。
   注意: 銀線に対応する茶色のチャネルは、接地のためにEEGデバイスに接続されています。赤とオレンジのチャンネルは同じタングステン線から信号を受信し、オレンジ色のチャンネルはEEGデバイスの基準として機能します。赤チャンネルの信号は無意味ですが、電流刺激を形成するには黒チャンネルと共存する必要があります。黒チャンネルの信号は、脳内の実際の電気信号です。さまざまなデバイスに合わせて、マルチチャネルスリップリングを使用してさまざまな回路を設計できます。

3.移植手術

1. 動物
   1. 手術には、体重24〜26 gの8週齢のC57BL / 6野生型雄マウスを使用します。
   2. 温度管理された環境(22 ± 1°C)に12時間の明暗サイクル(明時間:8:00-20:00)で飼育し、水と飼料を 自由に供給します。
   3. 手術中は動物を暖かく保つために、追加のヒートマットを使用してください。
   4. 手術後、鎮痛薬の最初の投与としてメロキシカムを皮下注射(10 mg / kg)します。次に、動物を別々のケージに入れて、回復を最適化します。手術後の最初の1週間はメロキシカムを動物の食事に加えます。
   5. 実験後、麻酔下でマウスの左心室に4%パラホルムアルデヒドを注入し、電極標的の組織学的検証のために脳組織を採取する。
2. マウスの体重を量り、1%ペントバルビタール溶液の腹腔内注射によって麻酔をかけます。ドリルビット、電極、歯科用セメントなど、使用するすべての手術器具と消耗品をオートクレーブ滅菌します。
3. マウスが完全に麻酔をかけられたら、かみそりで目から耳の部分まで髪を剃ります。
4. 脳定位固定装置フレームにマウスを固定します。前の上歯を切歯バーに入れ、両方のイヤーバーを耳に均等に深く挿入します。エリスロマイシン眼軟膏を目に塗り、手術中の明るい光によって引き起こされる乾燥や失明を防ぎます。
5. ヨードフォアと75%アルコールの3つの交互の綿棒で円を描くように手術領域を消毒します。次に、この切開の途中から矢状切開を前方に行い、切開の両側の皮膚を切り取って三角形の窓を作ります。
6. 綿の小片をボールに丸め、3%過酸化水素で濡らします。前部と後部の泉門がはっきりと見えるまで、露出した部分を小さな綿球でそっとこすって、頭蓋骨に付着した軟組織を取り除きます。
7. 前部と後部の泉門が水平位置になるように、前後の高さを調整します。前泉門の位置を軸の原点と考えてください。
8. ステンレス鋼のネジを左小脳頭蓋骨に固定し、ドリルを使用して平らな面を作成します。ネジが頭蓋骨から半分突き出ていることを確認します。
9. 扁桃体のキンドリングの座標が、ブレグマから後方に-1.67 mm、外側に-2.7 mm、腹側から-4.9 mmであることを確認します。定位固定装置を調整して、この場所を見つけてマークを付けます。
10. 直径0.5mmのスカルドリルでマークされた場所に穴を開けます。
11. 電極を定位固定装置の位置決めロッドに固定し、電極を穴の上に垂直に配置し、位置をゆっくりと-4.9mmに落とします。銀線をネジに3回巻き付け、操作中に電極本体を振らないように注意してください。
12. 歯科用セメントを混合し、電極と頭蓋骨の表面にそっと塗布します。歯科用セメントが硬化したら、固定電極を囲むセメントが円錐形になるまで外側を修正します。
13. セメントが硬化したら、電極を定位固定装置から解放します。動物の痛みによって引き起こされる不快感を和らげるためにメロキシカム10mg / kgを皮下投与します。.手術後の最初の週に鎮痛効果のためにメロキシカムを動物性食品に投与する。マウスを取り外してケージに戻し、他のマウスから離したままにします。

4.電気キンドリング

1. 術後の回復を可能にし、炎症を治めるために、キンドリングの前に手術後少なくとも1週間マウスを休ませます。
   注:一般に、十分に回復していないマウスはキンドリングにうまく反応しません。
2. マウスの頭の電極とEEGデバイスを接続するスリップリングケーブルを備えたカスタマイズされたボックスにマウスを入れます。箱の蓋の穴にケーブルを通し、箱に残っている長さを調整して、マウスが自由に動くようにします。
3. EEGデバイスの電源を入れ、正常に動作しているかどうかを確認します。刺激装置を、1秒の列車持続時間、60Hzで1msの単相方形波パルスを配信するように設定します。
4. 最初の刺激で50μAの電流強度から始めます。高周波スパイクを特徴とする後放電についてEEGを監視します。後放電が観察されない場合は、次の刺激に25μAを追加し、後放電が観察されて5秒間続くまで、10分ごとにこのプロセスを続けます。
   注:実験に放電が必要ない場合は、ステップ4.4をスキップできます。300μAはキンドリングに十分な強度です。
5. ステップ4.3で決定された電流強度でマウスを15分ごとに、1日20回以下刺激します。
6. 刺激に対する行動反応を監視します。
   注:3つの連続したグレードVエピソードの発生は、ラシーンランク標準¹⁷と組み合わせて、完全なキンドリングと見なされます。

Results

電極と回路により、EEGを記録し、刺激として機能することができます(図1)。このセットアップにより、記録電極と刺激電極を別々に埋め込む複雑さを回避し、脳組織への損傷を最小限に抑えます。スリップリングの適用により、あらゆるタイプのデバイスとの電極接続が可能になります。

健常成人男性C57BL/6マウス6名に電極移植手術を施行し,術後2週間で電気刺激を行った.行動発作レベルは刺激の数が増えるにつれて徐々に増加し、グレーディングはラシーンのスケールに基づいています:1 =口または顔の自動化。2 =2つ以下のミオクローヌスジャーク。3 = 3つ以上のミオクローヌスジャークおよび/または前肢クローヌス;4 =強直間代性の前肢および背中の伸展。5 =強直間代性の前肢と背中の伸展と飼育と崩壊;6 =強直間代の前肢と背中の伸展、ワイルドランニングまたはジャンプ¹⁴。完全なキンドリングに必要な刺激の数が記録されました(表1)。

Discussion

てんかんは、複数の症状と多様な原因を持つ病気のグループです¹⁸;すべてのタイプのてんかんに単一のモデルを使用できるわけではなく、研究者は特定の研究に適したモデルを選択する必要があることに注意してください。本研究では、電極作製の最もアクセスしやすい方法の1つを紹介します。この方法のさまざまな部分は、さまざまな実験条件に適応するように調整できます。

この方法は、刺激機能と記録機能の両方を備えた電極を利用し、刺激と脳波記録のために別々の電極を埋め込むことによって引き起こされる動物の脳への損傷を軽減します。電極を製造する際には、異なるサイズの列ピンを選択できます。ジャンボローピンは、スリップリングに最もしっかりと接続できます。ただし、動物の頭に複数のオブジェクトを埋め込む必要がある場合があります。この場合、占有スペースが少なく操作しやすいため、小さな列ピンを選択でき、マルチチャネルスリップリングを使用してすべての埋め込み電極を接続できます。スリップリングは、さまざまな実験室のEEGデバイスのニーズを満たすために、さまざまなタイプのインターフェ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488-conjugated Donkey anti-Rabbit IgG	invitrogen	A-21206
c-Fos antibody		ab222699
頭蓋ドリル	SANS	SA302
歯科用セメント	日清
EEG記録・刺激装置	Neuracle Technology (Changzhou) Co., Ltd	NSHHFS-210803
鉛フリー錫線	BACON
ピンヘッダー/メス	ヘッダーXIANMISI		間隔1.27mm銀
線	AMシステム	786000
リップリング	Senringエレクトロニクス株式会社	SNM008-04
ワイヤーAMシステム	796000
超微細マルチスタンドワイヤー	深センChengxingワイヤーとケーブル	UL10064-FEP
溶接装置	BAKON	BK881