このプロトコルは、ガイドRNAの設計からノックアウトクローンの細胞クローニングおよび特性評価まで、CRISPR/Cas9を使用してノックアウト筋芽細胞を生成する方法を説明しています。
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この記事について
サマリー
要約
クラスター化調節間隔短い回文反復(CRISPR)/Cas 9の重要な用途の1つは、特に遺伝子診断中に同定された疾患に関連する新しい遺伝子/タンパク質の機能を研究するためのノックアウト細胞株の開発である。このような細胞株の開発のためには、選択された細胞へのCRISPRツール(Cas9およびガイドRNA)の高効率の挿入、および選択された遺伝子の特異的欠失に対するCas9活性の制限の2つの主要な課題を解きほぐさなければならない。ここで説明するプロトコルは、筋肉細胞などのトランスフェクトが困難な細胞にCRISPRツールを挿入することに専念しています。このプロトコールは、一般に入手可能なプラスミドで産生されるレンチウイルスの使用に基づいており、すべてのクローニングステップが目的の遺伝子を標的とするために説明されています。Cas9活性の制御は、Cas9を標的とするガイドRNAをコードするレンチウイルスによる細胞の形質導入がCas9発現の漸進的廃止を可能にするKamiCas9と呼ばれる前述のシステムの適応を用いて行われている。このプロトコルは、筋肉細胞内カルシウム放出および励起収縮結合に関与するこの重要なカルシウムチャネルのノックアウトを確認するために、タンパク質および機能レベルでさらに特徴付けられた RYR1ノックアウトヒト筋細胞株の開発に適用されている。ここで説明する手順は、筋肉細胞または他のトランスフェクトが困難な細胞内の他の遺伝子に容易に適用することができ、ヒト細胞におけるこれらの遺伝子を研究するための貴重なツールを生成することができる。
概要
遺伝子シーケンシングの進歩や、特定の組織における機能未知の遺伝子の変異の同定に伴い、新たな標的遺伝子の機能を理解し、関連する病態生理学的機構への関与を確認するための関連細胞モデルの開発は不可欠なツールとなっています。さらに、これらのモデルは将来の治療開発にとって非常に重要であり1,2であり、実験における動物の使用を減らすための国際的な勧告と直線的にノックアウト動物モデルの開発に代わる興味深い代替手段を構成する。CRISPR/Cas9を用いた遺伝子編集は、現在利用可能な最も強力なツールの1つであり、多くのノックアウト/ノックインモデルの開発を可能にしており、CRISPR/Cas9を用いた標的遺伝子検証は、CRISPR/Cas93の最も広く使用されているアプリケーションの1つです。遺伝子編集の成功は、CRISPRツール(ガイドRNAおよびヌクレアーゼCas9)を標的細胞モデルに導入する能力にかかっており、筋肉細胞4などの多くのトランスフェクトが困難な細胞では課題になる可能性があります。この課題は、ウイルス、通常はレンチウイルスを使用することで克服することができ、これは効率的に多くの細胞型を形質導入し、その導入遺伝子を送達するという大きな利点を有する。しかし、その主な欠点は、宿主細胞ゲノムにおける導入遺伝子の組み込みであり、組....
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プロトコル
筋肉生検は、欧州の勧告とフランスの法律に従って、研究のための組織銀行(Myobank、EUネットワークEuroBioBank、パリ、フランスのパートナー)から取得されました。書面によるインフォームドコンセントは、すべての個人から取得されました。不死化筋芽細胞は、V. Mouly博士(Myology Institute、パリ、フランス)によって親切に製造され、プロトコルはMyology Institute倫理委員会(MESRI、n AC-2019-3502)によって承認されました。
1. クリスパーガイドデザイン
- 欠失させる遺伝子の領域を特定する。ensembl.org や genome.ucsc.edu などのゲノムブラウザツールを使用してゲノム配列を検索し、2つの領域の染色体座標を決定して、削除する領域の両側にあるガイドRNA(gRNA)を探します。
- ここで用いた遺伝子について、 RYR1遺伝子のFASTA 配列およびエクソン101の配列を以下のようにして取得する。ensemblで、ヒトゲノムの最新バージョンで RYR1 を検索し、最初のエントリを選択して、タンパク質コード配列の転写産物をクリックします。次に、 Exons をクリックして、遺伝子のエクソンのリストにリダイレクトします。
- 「配列 のダ....
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結果
このプロトコールは、RyR1タンパク質をコードするRYR1遺伝子をノックアウトするために、RyR1が以前に特徴付けられていた健常者15由来の不死化筋芽細胞15(いわゆるHM細胞、ヒト筋芽細胞用)に適用された。ガイドRNAの設計は、遺伝子のエクソン101およびイントロン101の一部を包含する配列を削除するためになされた。エクソン101の一部の欠失は、リーディングフレームの破壊をもたらすことが予測される。加えて、エクソン101はタンパク質の細孔をコードしており、したがって機能的なカルシウムチャネルを生成するために必要とされる。重篤なRyR1関連ミオパチーに罹患した多くの患者は、遺伝子7のこの領域に変異を有する。CRISPORソフトウェアで予測された最良のガイドは、最高の効率を維持しながら、できるだけオフターゲットを持たないように選択されました。我々は、細胞の大部分がノックアウトされることを確認し、PCRを使用して編集されたクローンにおける欠失の検出を容易にするために、同じウイルスベ.......
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ディスカッション
病態に関与する未知の機能の遺伝子の特性評価への道のりにおける主要なステップは、これらの遺伝子の機能を研究するための関連する細胞モデルの開発である。CRISPR/Cas9を用いた遺伝子編集の利用は指数関数的に成長している研究分野であり、ここで紹介するノックアウトモデルの開発は、その最も広く使用されているアプリケーションの1つです。この文脈において、我々はここで、関心のある任意の遺伝子におけるヒト細胞株ノックアウトを開発するための汎用性の高いプロトコルを提案し、関連するヒト細胞モデルにおけるこの遺伝子の特性評価を可能にする。ここで提示されたプロトコルは、iPSCだけでなく不死化筋芽細胞においても使用することができ、したがって、実質的に、目的の遺伝子における任意のヒト細胞モデルKOの産生をもたらし得る。
制限は、このプロトコルを不死化細胞に適用する必要があることであり、数週間の培養および細胞クローニングが多数の連続した増幅と共に必要とされる。あるいは、数週間または数ヶ月間増幅および維持することができる細胞を使用すべきである。この手順を用いて、目的の遺伝子(ここでは RYR1
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開示事項
著者らは、開示する利益相反はありません。
謝辞
この研究は、Association Française contre les myopathies(AFM-Téléthon)とAuvergne-Rhône Alpes Région(AURA)からの助成金によって資金提供されました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 抗CACNA1S抗体 | Sigma-Aldrich | HPA048892 | Primary antibody |
| Blp I | NE BioLabs | R0585S | Restriction enzyme |
| CalPhos Mammalian Transfection Kit | Takara | 631312 | トランスフェクションキット |
| Easy blot anti Mouse IgG | GeneTex | GTX221667-01 | HRP secondary antibody |
| Easy blot anti Rabbit IgG | GeneTex | GTX221666 | HRP secondary antibody |
| Fluo-4 direct | Molecular Probes | F10472 | Calcium imaging |
| GAPDH(14C10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #2118 | 一次抗体 |
| HindIII | Fermentas | ER0501 | 制限酵素 |
| InFusion HD Precision Plus | 宝 | 638920 | ライゲーションキット |
| MasterMix Phusion High Fidelity with GC | ThermoFisher Scientific | F532L | PCR反応用ミックス with High Fidelity Taq polymerase and dNTPs |
| Myosin Heavy Chain antibody | DHSB | MF20 | 一次抗体 |
| NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | REF | プラスミドの精製のための740424調製キット |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609 | DNA purification |
| NucleoSpin Tissue | Macherey-Nagel | 740952 | Kit for DNA extraction from cell |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C737303 | Chemically competent cells |
| Plasmid #87904 | Addgene | 87904 | SpCas9をコードするレンチウイルスプラスミド(LV-Cas9用) |
| プラスミド#87919 | Addgene | 87919 | 付きカセット挿入用レンチウイルスバックボーン(LVガイドターゲット用) |
| プラスミド#12260 | Addgene | 12260 | ウイルスプラスミドコードレンチウイルス包装GAG POL |
| プラスミド#8454 | Addgene | 8454 | レンチウイルスおよびMuLVレトロウイルス粒子を産生するためのエンベロープタンパク質をコードするレンチウイルスプラスミド |
| V5タグモノクローナル抗体 | Invitrogene | R96025 | 一次抗体 |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | Chemically competent cells |
| Xma I | NE BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
参考文献
- Claussnitzer, M., Susztak, K. Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries. Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).
- Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G.
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再版と許可
